与肝X受体相关的脂肪酸合酶转录调控区乙酰化组蛋白动态表达

目的利用肝X受体(liver X receptor,LXRs)激动剂T0901317,对脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FAS)基因转录调控区的组蛋白乙酰化状态进行研究,探讨FAS基因转录表达中是否存在组蛋白乙酰化引起的染色质重塑事件。方法用实时荧光定量PCR方法测定FAS mRNA的转录表达时间谱。通过染色质免疫沉淀技术,结合实时荧光定量PCR测定脂肪酸合酶基因转录调控区4个位点上乙酰化组蛋白H3和乙酰化组蛋白H4的表达情况。结果①T0901317作用2 h开始FAS mRNA表达呈时间依赖性增高(1.09倍,P>0.05),16 h达到峰值(4.25倍,P<0.01),48 h时仍明显高于0 h的表达(2.59倍,P<0.01)。②T0901317作用30 min,组蛋白H3乙酰化水平显著高于0 h水平(P<0.05),1 h降至0 h水平以下(仅上游2 000 bp位点差异有统计学意义P<0.05),2 h又接近或高于0 h水平(仅LXRE位点增高有统计学意义P<0.05)。③T0901317作用30 min,组蛋白H4乙酰化水平均较0 h增高(P<0.05),而1 h和2 h,其水平均低于0 h(P<0.05)。结论在LXRs激动剂T0901317的作用下,FAS基因mRNA水平呈时间依赖性增高;而在FAS基因转录早期,FAS基因转录起始点上下游约2 500 bp位置范围均有组蛋白乙酰化引起的染色质重塑改变,但这种改变是随位置、时间和组蛋白的不同,呈动态变化的过程。     

组蛋白乙酰化激活人脑胶质瘤中胶质细胞源性神经营养因子转录的机制研究

  目的  研究组蛋白乙酰化对人脑胶质瘤中胶质细胞源性神经营养因子基因(GDNF)的表达调控和具体机制。  方法  取正常人脑组织、低级别胶质瘤脑组织(LG-glioma)、高级别胶质瘤脑组织(HG-glioma)各6例。用组蛋白乙酰化酶抑制剂和组蛋白去乙酰化酶抑制处理人脑神经胶质瘤U251细胞。实时荧光定量PCR检测脑组织及细胞中的GDNF mRNA水平,染色质免疫共沉淀(ChIP)-PCR检测GDNF启动子区转录因子cAMP应答元件结合蛋白(CREB)结合位点的H3K9乙酰化水平,以及转录因子CREB与GDNF启动子区的结合能力,同时检测组蛋白乙酰化酶和脱乙酰化酶抑制剂对转录因子CREB结合能力和GDNF表达的影响。  结果  与正常脑组织和低级别脑胶质瘤组织比较,高级别胶质瘤组织的GDNF mRNA水平高(P < 0.01),GDNF启动子区的H3K9乙酰化水平增加(P < 0.01),且GDNF启动子上CREB结合区的乙酰化水平高于非CREB结合区的乙酰化水平(P < 0.01)。高级别胶质瘤组织中CREB与GDNF启动子区的结合能力高于正常脑组织和低级别脑胶质瘤组织(P < 0.05)。组蛋白乙酰化酶抑制剂处理U251细胞后,GDNF启动子上CREB结合区的乙酰化水平下降,CREB与GDNF启动子结合活性下调,并下调GDNF mRNA和蛋白水平,而组蛋白去乙酰化酶抑制剂具有相反作用(P < 0.01)。  结论  组蛋白乙酰化通过促进转录因子CREB与GDNF基因启动子区的结合,从而促进胶质瘤中GDNF的高转录。     

MIR-138-5p 通过靶向组蛋白去乙酰化酶调节心脏 肥大

目的:探究MIR-138-5p 对心脏肥大的影响及其机制。方法:首先构建体外心脏肥大的模型,HE 染色、α-肌动蛋白染色 和RT-PCR 方法,分别检测模型大鼠心脏的横断面积和血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）处理的心肌细胞（H9c2）的表面积和心肌细胞中 MIR-138-5p mRNA 表达情况;MIR-138-5p-mimic 转染AngⅡ处理过的H9c2 细胞,α-肌动蛋白染色和Western 印迹分别检测 心肌细胞的表面积和心肌肥大标志物的蛋白表达水平;采用TargetScan 在线软件筛选miR-138-5p 的潜在靶基因,并进一步验 证。MIR-138-5p-mimic、pcDNA- HDAC4共转染AngⅡ处理过的H9c2 细胞,α-肌动蛋白染色和Western 印迹法分别检测心肌 细胞的表面积和心肌肥大标志物的蛋白表达水平。结果:相对于Sham 组,模型大鼠的心脏体积及心脏横截面均明显增大,心肌 细胞中的MIR-138-5p mRNA 表达水平明显降低（F=21.578,P<0.001）;相对于Con 组,AngⅡ组心肌细胞的表面积明显增大,且 MIR-138-5p mRNA 表达水平明显降低（F=23.790,P<0.001）。相对于AngⅡ+miR-NC 组,AngⅡ+miR-mimic 组心肌细胞的表面 积（F=8.325,P<0.01）、心肌肥大标志蛋白表达水平（F=9.532,P<0.01）和心肌细胞中HDAC4 mRNA表达水平明显降低（F=25.530, P<0.001）; 相对于MIR-138-5p-mimic+pcDNA-Con 组,MIR-138-5p- mimic+pcDNA-HDAC4 组心肌细胞的表面积明显减小 （F=10.134,P<0.01）,心肌肥大标志蛋白表达水平明显升高。结论:MIR-138-5p 通过靶向组蛋白脱乙酰基酶-8（HDAC4） 调节心脏肥大反应。     

组蛋白乙酰化转移酶亚型类固醇受体共激活因子1在发育心脏的时空表达

目的研究组蛋白乙酰化转移酶亚型类固醇受体共激活因子1(SRC1)在小鼠心脏中的时空表达规律,初步探讨其与心脏发生发育的关系。方法取胎龄E7.5～18、出生1d和3个月成年小鼠正常心脏,每个时间点选9个标本,采用免疫组织化学SP法观察SRC1蛋白在不同发育阶段心脏的空间表达;每个时间点选6组标本,利用蛋白质印迹分析技术检测其在小鼠心脏发育过程中时序性表达变化。结果免疫组织化学结果显示,SRC1蛋白在E7.5胚胎心脏原基中不表达;E8.5～E9.5心管中微弱表达;E10.5后心脏发育各时期,小梁弱表达,心脏其他区域均有较强而广泛表达。蛋白质印迹分析结果显示,E10.5以后的心脏发育阶段,SRC1蛋白在E10.5较低表达,与E11.5、E12.5相比表达差异有统计学意义(P<0.05),与其他发育时间点相比表达差异无统计学意义(P>0.05);E11.5～E12.5达到表达高峰,此两个发育时间点相比表达差异无统计学意义(P>0.05),与其他发育时间点相比表达差异有统计学意义(P<0.05);此后表达下降并持续低表达至成年鼠期,此阶段表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论 SRC1蛋白广泛表达于E8.5后的发育...     

心肌祖细胞中Tbx5启动子区的组蛋白乙酰化调控机制研究

目的 研究心肌祖细胞中Tbx5启动子区p300和CBP介导的组蛋白乙酰化修饰对Tbx5表达的调控及其修饰位点,探讨Tbx5的组蛋白乙酰化修饰调控网络。方法 体外培养胚胎心肌祖细胞,分为对照组、二甲基亚砜(DMSO)组和姜黄素组,对照组不给予额外干预,DMSO组给予DMSO干预,姜黄素组给予30 mmol/L姜黄素干预。同时,采用慢病毒载体转染胚胎心肌细胞48 h,分为对照组、GFP组和p300-RNAi组,对照组不转染,GFP组采用GFP慢病毒载体转染,p300-RNAi组采用p300-RNAi慢病毒载体转染。Western blot方法检测各组的组蛋白H3的乙酰化水平;实时荧光定量逆转录PCR检测各组Tbx5和p300 mRNA水平的表达;染色质免疫共沉淀(CHIP)-实时荧光定量逆转录PCR检测Tbx5启动子区组蛋白H3不同位点H3K4、H3K9和H3K27的乙酰化水平及Tbxt5启动子结合的p300和CBP水平。结果 姜黄素组Tbx5 mRNA相对表达水平及H3ac水平较对照组和DMSO对照组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。p300-RNAi组p300 mRNA...     

CBP/P300介导的组蛋白H3K9乙酰化修饰对GATA4表达的影响

目的 明确GATA4在小鼠胚胎心脏发育过程中的时序表达,并阐明其组蛋白修饰调控机制.方法 选取胎龄11.5 d(E11.5)至新生0.5d胎鼠心脏,RT-PCR检测胎鼠心肌细胞中GATA4mRNA表达水平,CHIP-QPCR检测GATA4启动子区组蛋白H3K9ac水平及与CBP/P300的结合水平.用CBP30干预心肌祖细胞,RT-PCR检测心肌祖细胞在不同浓度CBP30(0.5、1、2、4μmol/L)干预不同时间点(6、12、24、36 h)后GATA4 mRNA表达水平,CHIP-QPCR检测心肌祖细胞中GATA4启动子区组蛋白H3 K9 ac水平及与CBP/P300的结合水平.结果 ①小鼠胚胎心脏发育过程中GATA4表达量,E14.5明显高于E11.5(P ＜0.05);CHIP结果显示E14.5 GATA4启动子区组蛋白H3 K9 ac水平高于E11.5(P ＜0.05);E14.5与CBP/P300的结合水平亦高于E11.5(P ＜0.05).②CBP30干预心肌祖细胞后,GATA4表达量较对照组明显降低(P＜0.05).CHIP结果显示CBP30组GATA4启动子区组蛋白H3K9ac水平及与CBP/P300的结合水平较对照组显著降低(P＜0.05).结论 CBP/P300可通过介导组蛋白H3 K9乙酰化修饰参与调控GATA4在小鼠胚胎心脏发育过程中的时序表达.     

早期胚胎停止发育绒毛中IGF2、GCN5和p300/CBP的表达

目的研究胰岛素样生长因子2(IGF2)及组蛋白乙酰基转移酶(HATs)相关因子组蛋白乙酰基转移酶(GCN5)、p300/CREB结合蛋白(p300/CBP)在正常及早期胚胎停止发育患者绒毛中的表达及三者间的相关性。方法采用免疫组化SP法检测21例正常早期妊娠绒毛、29例胚胎停止发育绒毛组织中IGF2、GCN5和p300/CBP的表达情况。结果早期胚胎停止发育绒毛中,IGF2、GCN5和p300/CBP的阳性表达显著低于正常早孕绒毛(P=0.001、P=0.002和P=0.003);并且这些指标在胚胎停止发育绒毛中的表达,两两间均存在显著正相关(r=0.563、0.622和0.563,P<0.00)。结论 IGF2、GCN5及p300/CBP的表达下调可能与早期妊娠胚胎停止发育有关,GCN5及p300/CBP的表达下调有可能参与早期绒毛发育过程中IGF2的表观遗传调控。     

辅激活因子及组蛋白协同乙酰化修饰对NF-κB亚基转录调控的影响

核因子κB(NF-κB)信号转导通路在细胞的增殖、分化、凋亡、免疫应答及炎症反应中具有重要的调节作用。炎症调节机制极其复杂,NF-κB在不同的环境下,通过不同的翻译后修饰、协同组蛋白共价修饰以及招募辅激活因子参与调控下游靶基因的表达。辅激活因子具有乙酰基转移酶活性,对转录激活的调控至关重要,而组蛋白的乙酰化修饰一直是表观遗传学研究的热点,其可使NF-κB对靶基因的特异性调控更加精确。两者协同作用在NF-κB亚基转录调控中发挥关键作用。     

Nkx2-5转录因子在心脏发育中的作用

心脏是脊椎动物在胚胎发育过程中第一个形成的器官,脊椎动物的心脏由多细胞系的特化到管状结构的形成,最后精确组装为成熟的4个心腔结构,经历了一个复杂的发育过程,它涉及到多种基因不同时间和不同空间的先后表达与相互作用.研究脊椎动物心肌基因表达的分子调控是了解调节心肌发生的关键.Nkx2-5是目前研究较多的与心脏发育密切相关的转录因子.     

转录共激活子p300分布及其表达的组织差异性

目的阐明转录共激活因子(p300)在大鼠组织中的分布特点及其表达的组织差异,探讨p300在组织差异相关的基因表达调控中的作用.方法采用免疫组织化学技术检测p300在雄性大鼠大脑皮质、海马、小脑、心肌、肝脏、肺脏、肾脏、睾丸中的分布特点;运用免疫印迹技术,对不同组织中p300蛋白水平进行检测.结果① p300蛋白在心肌、肝脏、肺脏、肾脏、睾丸、小脑、海马、大脑皮质中均有分布.②在睾丸、海马和肾脏组织中,p300主要分布在精原细胞、锥形神经元细胞和远曲小管上皮细胞中;大脑皮质神经元均表达p300,在分子层中呈弱阳性;p300在小脑蒲肯野细胞和心脏组织的心肌细胞表达呈强阳性.p300在肝细胞中均匀分布,而肺脏组织中p300表达呈弱阳性.③ p300蛋白在骨骼肌中表达水平最高,其次是心肌、睾丸、肝脏和小脑,下丘脑中未检测到明显的阳性表达.结论 p300的表达和分布具有组织和细胞差异性,这种差异分布可能是机体不同组织、细胞中蛋白表达差异的重要机制.     

肺癌组织p300/CBP基因突变机制的研究

目的探讨p300/CBP基因在肺癌中的发生、发展中的作用.方法采用PCR-SSCP及DNA序列分析技术检测30例新鲜肺癌组织p300/CBP的基因突变,以30例正常肺组织作对照.结果肺癌组织中p300/CBP基因存在1个位点的点突变,位于p300gDNA的4773碱基,T→G,突变点为编码区,丝氨酸(Ser)→精氨酸(Arg).本组30例肺癌组织中,有1例突变,结论肺癌组织中p300/CBP基因存在1个位点的点突变.     

氟桂利嗪对脑缺血再灌注损伤沙鼠脑组织p300/CBP表达的影响

目的研究氟桂利嗪对脑缺血再灌注损伤沙鼠脑组织内p300/CBP表达的影响。方法40只沙鼠随机分为对照组、假手术组、缺血再灌注组及氟桂利嗪组,每组10只。采用夹闭双侧颈总动脉制作脑缺血再灌注模型,于缺血再灌注后1 d处死动物取前脑组织;采用免疫组织化学法检查各组沙鼠脑内p300/CBP的表达情况。结果对照组及假手术组沙鼠脑内p300/CBP呈弱阳性表达,2组比较差别无统计学意义(P>0.05);缺血再灌注组沙鼠脑组织内p300/CBP阳性表达率较对照组及假手术组表达明显增强(P<0.01),氟桂利嗪组沙鼠脑组织内p300/CBP的表达较缺血再灌注组下降(P<0.05)。结论正常沙鼠脑内有p300/CBP表达;沙鼠脑缺血再灌注后脑组织内p300/CBP表达上调,氟桂利嗪可以降低其表达。     

p300特异性siRNA载体的构建及其对心肌细胞GATA4表达的影响

目的 构建并筛选小鼠p300特异性siRNA载体,并观察p300表达降低对心脏特异性转录因子的调控作用,为进一步研究p300介导的组蛋白乙酰化失衡对心脏发育的影响奠定基础.方法 针对小鼠p300基因的保守序列区域设计并构建3个重组质粒p300 RNAi1,p300 RNAi2和p300 RNAi3.利用阳离子脂质体将其分别转染入体外培养的乳鼠心肌细胞,分别利用RT-PCR和免疫荧光从mRNA和蛋白水平检测p300表达,判断抑制效率,并检测心脏特异性转录因子GATA4的表达水平.结果 pSOS-HUS组和p300 RNAi2组中p300 mRNA水平表达较正常对照组无明显降低,而p300 RNAi1组和p300 RNAi3组中p300 mRNA表达量较正常组有明显降低(分别为0.220 8±0.020 0,0.170 8±0.040 0,vs 0.509 5±0.030 0),且差别有统计学意义(P<0.05),抑制率分别为56.7%和66.5%.转染p300RNAi1组和转染p300RNAi3组的GATA4 mRNA表达水平(分别为0.423 1±0.110 0,0.262 7±0.080 0)明显低于正常组(0.856 4±0.070 0)和阴性对照组(0.841 5±0.040 0),差别有统计学意义(P<0.05).结论 p300特异性siRNA 质粒载体构建成功,p300 RNAi1和p300 RNAi3具有确切阻断p300蛋白表达的作用,并下调GATA4的表达.     

事件相关电位p300在精神分裂症并发代谢综合征患者中的变化研究

目的 探讨事件相关电位p300在精神分裂症(Sch)并发代谢综合征(MS)患者中的变化.方法 采用连续取样法,选取2014年9月至2015年10月期间就诊的Sch患者165例,80例符合MS诊断标准的病例作为研究组,按就诊序号取前85例不符合MS诊断标准的病例设为对照组.全部患者均测定腰围、体质量指数(BMI)、空腹血糖(FPG)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、事件相关电位p300水平,采用蒙特利尔认知评估量表(MOCA)评定认知功能.结果 研究组腰围、BMI、FBG、TG、SBP、DBP均明显高于对照组,HDL水平明显低于对照组,组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).研究组OZ、PZ、CZ、FZ点N2、P3波幅明显低于对照组,各点N2、P3潜伏期明显长于对照组,组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).研究组MOCA评分明显低于对照组,组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 事件相关电位p300在精神分裂症并发代谢综合征患者中异常改变,p300波幅缩短,潜伏期延长可能与机体代谢及认知功能异常改变有关.     

p300/CBP、Smad4在非小细胞肺癌组织中的表达

目的：探讨p300/CBP、Smad4蛋白在非小细胞肺癌（NSCLC）组织中的表达及其临床意义。方法：采用免疫组化SABC法检测60例NSCLC组织和20例正常肺组织中p300/CBP、Smad4的表达,分析两者相关性,并探讨其与NSCLC临床病理特征之间的关系。结果：p300/CBP在NSCLC组织中表达率为65.0%,过表达率为51.7%。Smad4在NSCLC组织中表达率为63.3%。p300/CBP和Smad4均与NSCLC淋巴结转移、分期等临床病理学参数有关（P〈0.05）。p300/CBP的表达还与NSCLC分化有关（P〈0.05）。p300/CBP、Smad4在NSCLC组织中阳性表达率呈中度负相关（P〈0.05）。结论：联合检测p300/CBP和Smad4的表达,在预测NSCLC的恶性生物学行为方面可能比单因素检测更具意义。     

p300诱导的乙酰化修饰参与脂多糖诱导的炎症介质合成

目的 探讨辅助激活因子p300诱导的乙酰化修饰介入脂多糖（LPS）诱导的炎症介质合成过程及其作用机制。方法 Agilent Sureprint G3 Mouse Gene Expression V2 微阵列芯片以及蛋白免疫印迹（WB）技术联合于小鼠巨噬细胞（RAW246.7）中筛选表达水平与LPS刺激强度相关的分子;凝胶电泳迁移实验（EMSA）以及染色质免疫共沉淀（chip-qpcr）方法验证相关分子与炎症基因IL-6以及TNF-α启动子部位的结合现象;相关分子过表达或干扰质粒转染RAW246.7后,WB法检测转染质粒的作用效果,ELISA方法检测IL-6以及TNF-α合成水平,染色质免疫沉淀-测序技术（chip-seq）分析炎症基因启动子部位相关分子的结合以及H3K27的乙酰化修饰水平。结果 微阵列芯片以及WB技术共同证实p300的表达与LPS刺激强度存在较好关联。免疫共沉淀证实了p300与c-myb存在结合现象。EMSA证实c-myb可与炎症基因启动子序列结合,而p300不能直接结合;chipqPCR表明当c-myb被干扰时,p300不能与炎症基因启动子序列结合。WB检测显示过表达或干扰质粒均能够干预相关分子的表达,且p65、p300以及c-myb 3者在表达上无相互影响。ELISA联合chip-seq显示与对照组比较,p300过表达以及LPS刺激均可导致炎症基因启动子部位结合的p300和H3K27乙酰化修饰水平增加,从而促进p65与启动子的结合和炎症基因转录（P<0.05）;而c-myb表达被干扰时,p300过表达以及LPS刺激诱导的p300与p65在启动子的结合、H3K27乙酰化修饰和炎症介质合成均被遏制（P<0.05）。在p65干扰相关组别中,p65与启动子的结合以及炎症基因转录均被抑制（P<0.05）,但未对p300的结合以及H3K27乙酰化水平造成影响。结论 LPS刺激可诱导p300合成,后者在c-myb介导下结合于炎症基因启动子区域,并通过乙酰化H3K27易化启动子与p65结合,从而促进炎症基因表达。     

癫痫患者服用卡马西平前后P300变化的临床研究

目的用卡马西平治疗癫痫患者,并用P300来检测其认知功能的变化。方法收集我院神经内科门诊2002～2006年癫痫大发作患者共31例,其中男18例,女13例,年龄在25～40岁,用药前均作EEG、IQ及P300检查,服药半年或一年后再作P300检测。结果服用卡马西平半年组,P300潜伏期和反应时间较服药前明显缩短,P300波幅无显著性改变。服用卡马西平一年组,P300潜伏期和反应时间较服药前明显缩短,但因样本较少差异未达到显著性水平,P300波幅无明显改变。结论服用卡马西平半年或一年后,临床症状得到控制。P300潜伏期反应时间有明显变化,提示卡马西平治疗对癫痫患者的认知功能有一定的正影响。     

p38 MAPK在小鼠睾丸出生后不同发育阶段的表达

目的：探讨p38 MAPK在小鼠睾丸出生后不同发育阶段的表达．方法：应用免疫组织化学SABC法检测1～7周龄小鼠睾丸p38MAPK的表达和定位．结果：在2周龄小鼠睾丸生精小管上皮中即可观察到p38MAPK免疫阳性反应，免疫反应阳性细胞为精原细胞；3，4和5周龄小鼠睾丸仅有个别生精小管上皮可见p38 MAPK免疫阳性反应；6，7周龄小鼠睾丸中p38 MAPK表达较丰富，免疫反应阳性细胞为精原细胞和初级精母细胞，免疫阳性反应物均主要位于细胞核内．在7周龄小鼠睾丸中还可见到部分间质细胞呈p38 MAPK阳性，免疫阳性反应物主要位于细胞质内．结论：p38 MAPK可能对生精细胞的增殖分化以及雄激素的分泌具有调控作用。     

胃癌组织中p300/CBP、Smad2蛋白表达及其临床意义

目的检测胃癌组织中p300/CBP、Smad2蛋白的表达,探讨p300/CBP在胃癌的发生与发展中的作用。方法采用免疫组化S-P法,检测51例胃癌和51例正常胃黏膜组织中p300/CBP、Smad2蛋白的表达;结果p300/CBP、Smad2在胃癌组织中的免疫组化染色强度分别为(5.2635±1.0047),(5.7027±0.6330),均明显低于相应正常胃黏膜组织分别为(12.9769±0.9274),(15.2297±0.8871),P<0.01。进展期胃癌组织中p300/CBP、Smad2的染色强度分别为(4.4274±1.3970),(4.6574±1.1281),均显著低于早期胃癌组织分别为(6.6684±1.0341),(7.4632±1.2856),P<0.05;伴淋巴结转移组p300/CBP、Smad2的染色强度分别为(4.4092±0.8203),(4.4115±0.7737)显著低于无淋巴结转移组分别为(6.8263±2.0127),(8.0699±0.7854),P<0.05;p300/CBP、Smad2染色强度与胃癌分化程度、患者年龄及性别无显著相关性。胃癌组织中p300/CBP的低表达与Smad2的低表达呈正相关。结论p300/CBP、Smad2在胃癌中的表达水平明显降低,并与胃癌的分期以及淋巴结的转移有关,提示p300/CBP、Smad2低表达使TGF-β信号传导通路受阻,可能参与胃癌的发生发展过程。