重组日本血吸虫FKBPl2基因的酶活性及其转录水平鉴定

目的对日本血吸虫（Schistosoma japonicum,sj）FK506结合蛋白12（FKBPl2）进行肽基脯氨酸顺反异构酶（peptidyl-prolyl cis-trans isomerase,PPIase）活性鉴定,并比较它与26000 Mr的谷胱甘肽转移酶（Sj26GST）基因在成虫、尾蚴和虫卵的转录水平。方法从成虫RNA中RT-PCR扩增sjFKBPl2基因,将其克隆入pGEX-4T-1载体中,诱导表达重组融合蛋白,经纯化后进行PPIase活性测定。利用RT-PCR半定量分析sjFKBPl2基因与Sj26GST基因的转录水平。结果将sjFKBPl2基因成功克隆入pGEX-4T-1载体中后,表达、纯化的重组融合蛋白有PPIase活性。sjFKBPl2在尾蚴与虫卵期的转录水平相仿,都高于Sj26GST基因,是成虫期转录水平的1．5倍左右。结论成功鉴定了重组sjFKBPl2酶活性,sjFKBPl2在尾蚴和虫卵期较高的转录水平,为将其进行疫苗等研究提供了依据。     

日本血吸虫重组抗原的诱导表达及其免疫学活性鉴定

为了筛选和发现日本血吸虫新的疫苗候选抗原分子我们构建了日本血吸虫抗原ＰＳｊ＾５１４与表达载体ｐＧＥＸ－１λｔ重组体，表达克隆ｐＧＳｊ２４。对工程菌的诱导表达及表达产物分析证实，特异性表达产物是分子量约为２２ｋＤａ的两条十分接近的蛋白带。该蛋白可溶性蛋白，表达方式为分离表达，可被日本血吸虫免疫兔血清，感染兔血清及病人血清特异地识别。     

FKBP12．6重组腺病毒载体的构建及其心肌细胞感染效率测定

 【目的】构建携带FKBP12．6基因的重组腺病毒载体以研究FKBP12．6在心力衰竭时心室肌电重构中的作用。【方法】将平端化的FKBP12．6片段连接到穿梭质粒pAdTrack-CMV构建重组穿梭质粒pAdTrack／FKBP12．6，用Xho I单酶切进行鉴定。采用电穿孔法将线性化pAdTrack／P12．6转化AdEasier-1细菌。产生重组腺病毒质粒pAdEasy-1／FKBP12．6。采用脂质体介导法用线性化pAdEasy-1／FKBP12．6转染293细胞，从病变的293细胞分离、纯化重组腺病毒Ad．FKBP12．6；采用PCR方法对其进行鉴定。用重组腺病毒感染乳鼠心肌细胞，在荧光显微镜下计算GFP阳性细胞百分率。【结果】在病变293细胞的冻融上清中含有重组腺病毒Ad．FKBP12．6，其滴度为1．5×10^12pfu／mL。当感染复数（MOI）为75时，感染效率可达100％。【结论】成功构建了携带FKBP12．6基因的重组腺病毒载体；Ad．FKBP12．6可高效感染乳鼠心肌细胞。本研究为进一步探讨FKBP12．6在心力衰竭时心室肌电重构中的作用奠定了基础。     

日本血吸虫Sj16基因重组杆状病毒的构建和鉴定

目的利用杆状病毒-昆虫细胞系统构建日本血吸虫(Schistosomajaponicum,Sj)Sj16基因重组杆状病毒。方法从日本血吸虫尾蚴提取总RNA,通过RT-PCR扩增出Sj16基因全编码区序列,将其克隆到载体pET30a(+)中,通过PCR将Sj16基因连同pET30a(+)多克隆位点下游的6×His·Tag一起扩增出来,插入donor载体pFastBacHTa中,构建重组杆状病毒donor载体pFastBacHTa-Sj16-His,转化大肠杆菌DH10Bac-GFP进行转座,提取重组Bacmid,用Lipofectin法转染昆虫细胞Sf9使其包装成有感染性的重组杆状病毒。结果构建了含日本血吸虫Sj16基因的重组Bacmid-GFP-Sj16-His,转染Sf9细胞后,获得了有感染力的重组杆状病毒。结论成功构建了日本血吸虫Sj16基因重组杆状病毒,为下一步重组Sj16蛋白表达和Sj16基因功能研究打下了基础。     

日本血吸虫TGF-β1成熟肽编码序列的克隆、表达及其转录水平

目的 获得日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)转化生长因子β1(TGF-β1)成熟肽基因的DNA,进行原核克隆和表达.并比较它与Sj26kd的谷胱甘肽转移酶(Sj26GST)在成虫和虫卵期的转录水平.方法 根据美国国立生物信息学中心(NCBI)上登录的小鼠TGF-β1基因的全长序列,设计两条位于保守区的寡核苷酸作为引物.利用RT-PCR从日本血吸虫成虫的mRNA中扩增SjTGF-β1基因的部分序列,并利用生物信息学进行分析和鉴定.克隆SjTGF-β1成熟肽基因的cDNA到原核表达载体pGEX-6p-3,将重组载体转化大肠杆菌BL21株并诱导表达.利用RT-PCR半定量分析SjTGF-β1基因与Sj26GST基因在成虫和虫卵期的转录水平.结果 成功获得并构建了SjTGF-β1成熟肽基因的原核表达载体.融合表达后的重组融合蛋白经SDS-PAGE分析,显示其相对分子质量约为3 5000.与目的 基因编码蛋白的预测分子量相符.SjTGF-β1在成虫与虫卵期的转录水平都低于Sj26GST基因,但虫卵期的转录水平比成虫高.结论 SjTGF-β1成熟肽基因的获得为其编码序列全长的获得奠定了基础;重组融合蛋白的成功表达为进一步的功能研究提供保障;虫卵期该基因的转录水平高提示该基因在血吸虫虫卵与宿主的相互作用中可能具有一定的作用.     

IL—12对日本血吸虫重组SjGST—Sj32免疫小鼠攻击感染后虫 …

目的 观察白细胞介素－１２（ＩＬ－１２）对重组日本血吸虫谷胱苷肽－Ｓ－转移酶－３２ｋＤ融合蛋白（ｒＳｊＧＳＴ－Ｓｊ３２）蛋白免疫小鼠肝脏虫卵肉芽肿大小的影响。方法 ＢＡＬＢ／ｃ小鼠３６只随机分别ＩＬ－１２加ｒＳｊＧＳＴ－Ｓｊ３２组、ｒＳｊＧＳＴ－Ｓｊ３２组和磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）组，第３次免疫后４周，经腹部贴片感染１０条尾蚴，４５天后杀鼠取肝组织，常规染色，光镜下进行组织学观察及单个虫卵肉芽肿大小     

IL-12对日本血吸虫重组SjGST-Sj32免疫小鼠攻击感染后虫卵肉芽肿形成的调节

目的观察白细胞介素-12(IL-12)对重组日本血吸虫谷胱苷肽-S-转移酶-32kD融合蛋白(rSiGST-Si32)蛋白免疫小鼠肝脏虫卵肉芽肿大小的影响。方法BALB/c小鼠36只随机分成IL-12加rSjGST-Sj32组、rSiGST-Si32组和磷酸盐缓冲液(PBS)组，第3次免疫后4周，经腹部贴片感染10条尾蚴，45天后杀鼠取肝组织，常规染色，光镜下进行组织学观察及单个虫卵肉芽肿大小的测量。结果与PBS组和rSjGST-Sj32组相比，IL-12加rSiGST-Sj32组虫卵肉芽肿体积明显减少(P＜0.01)。在形态学上，PBS组和rSjGST-Sj32组肝脏虫卵肉芽肿周围有大量嗜酸性粒细胞为主的炎性细胞浸润，还有少量的纤维母细胞、类上皮细胞等，有的肉芽肿已有纤维形成。IL-12加rSjGST-Sj32组的肝脏虫卵周围仅有少量的嗜酸性粒细胞聚集，很少见到胶原纤维。结论IL-12能下调rSjGST-Sj32蛋白免疫小鼠肝脏虫卵肉芽肿的应答。     

日本血吸虫大陆株26KDa基因重组蛋白保护性免疫力的研究

本文报道了ｒＳｊｃ２６ＧＳＴ分别抗原可诱导宿主产生抗日本血吸虫感染的保护性免疫力，获得免疫的小鼠虫贡荷与肝、脾组织中虫卵负荷均下降，减虫率与肝、脾减卵分别为３０与５７．１１％、７９．９７％。ＥＬＩＳＡ测免疫鼠血清特异性抗体水平明显升高。提示ｒＳｊｃ２６ＧＳＴ作为日本血吸虫病候选疫苗矍有广泛应用前景。     

日本血吸虫重组疫苗的研究概况

<正> 血吸虫病是严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病。它威胁着全世界74个国家和地区约6亿人口的健康,估计感染人口约为2亿,患者2千万左右。世界卫生组织(WHO)认为该病是所有寄生虫病中分布范围最广、危害最严重的疾病之一。多年来,防治血吸虫病一直是靠传统的吡喹酮药物化疗和杀灭钉螺的方法。但效果并非尽如人意,其原因包括多方面:首先,吡喹酮对已造成的损害组织作用甚微,且化疗药物的应用,还可能造成临床症状的不典型,使血吸虫的早期诊断难度加大,同时大规模使用吡喹酮治疗时有诱发某些虫株产生耐药性的可能;同时,血吸虫保虫宿主种类繁多,如牛、羊、鼠等哺乳动物,据统计全世界有54万头病畜,都可以作为其传染源;其次,作为血吸虫的中间宿主钉螺,其分布的水域面积广阔,有螺面积估计约34亿平方米,加之山区丘陵地形复杂等原因,使消灭钉螺具有相当难度;第三,血吸虫尾蚴感染速度非常之快及感染后不能获得持久性的免疫力,易重复感染等。因此,要从根本上控制和消灭血吸虫病应考虑借助于疫苗。     

重组日本血吸虫乳酸脱氢酶(SjLDH)酶学特性的研究

目的获得重组SjLDH主要的酶动力学参数。方法分光光度计测定NADH在340nm处吸光度的变化,检测不同pH及温度下重组蛋白催化正、逆反应的效率以确定其最佳pH、最佳温度;分别固定底物NADH、丙酮酸、NAD＋及乳酸浓度,分别测定丙酮酸、NADH、乳酸及NAD^＋在不同浓度下的反应速度,计算机Lineweaver-Burk双倒数方程回归计算各底物的米氏常数（Km值）、最大反应速度（Vmax）。并比较各自的Vmax／Km值。结果重组蛋白酶活性为379U／mg。催化正、逆反应的最佳pH分别为pH6．0—7．0和pH9．0—10．0;催化正、逆反应的最佳温度分别为37—60℃及40—50℃,后者在70℃时仍有较高催化活性;在NADH辅酶作用下,重组SjLDH催化丙酮酸还原为乳酸的最大反应速度是催化NAD＋作用下乳酸氧化为丙酮酸的21倍。比较丙酮酸与乳酸的Vmax／Km值。前者是后者的23倍。而NADH的Vmax／Km值是NAD＋的7倍。结论重组蛋白在生理条件下主要催化丙酮酸还原为乳酸的反应。     

重组Calpain蛋白诱导抗体产生及检测日本血吸虫感染的研究

目的 研究在大肠杆菌中表达的日本血吸虫Calpain蛋白的免疫原性及其在日本血吸虫病诊断上的应用。方 法用重组Calpain蛋白免疫BALB／c小鼠，ELISA法测定特异性IgG抗体的动态变化及其IgG亚型(IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3)产生特征；同时用重组Calpain蛋白作为诊断抗原，粪检血吸虫病阳性患者血清作为一抗，肝吸虫阳性患者血清作为考核交叉反应血清。结果 重组Calpain抗原免疫小鼠后，产生了一个极高的抗Calpain特异性抗体，免疫4周IgG类抗体达到高峰，与对照组鼠相比较免疫鼠血清中IgG1，IgG2a，IgG2b特异性抗体也显著上升；Calpain重组抗原血清检测日本血吸虫和粪检的符合率为100％，粪检阳性EPG低的个体抗Calpain抗体滴度高，EPG高的患者抗Calpain抗体滴度反而低，与肝吸虫的交叉反应率为37％。结论 日本血吸虫Calpain是一个具有免疫原性的蛋白，能够激发宿主产生高水平的免疫球蛋白，能够敏感地测定日本血吸虫的感染，提示Calpain可以发展成为日本血吸虫病的诊断抗原和日本血吸虫疫苗候选分子。     

IL-12在血吸虫感染小鼠肝脏中的表达及其对肝纤维化的影响

目的探讨日本血吸虫感染小鼠肝脏中白细胞介素-12（IL-12）的表达及其对肝纤维化的影响。方法在小鼠感染血吸虫后的不同时期（6、8、10、12周），分别采用免疫组织化学法观察肝脏IL-12的变化，VG染色及多媒体病理图文定量分析系统检测注射基因重组小鼠IL-12（rIL-12）前、后胶原纤维含量的改变。结果小鼠肝脏IL-12含量随感染时间延长而缓慢下降，胶原纤维含量随感染时间延长逐渐升高，经皮下注射rIL-12后小鼠肝脏IL-12含量随着相应因子补充而显著上升，胶原纤维含量则逐渐降低。结论IL-12能明显抑制血吸虫感染小鼠肝脏胶原纤维合成，延缓肝纤维化发生。     

日本血吸虫尾蚴抗原模拟表位的筛选及其免疫保护性

目的 筛选日本血吸虫尾蚴抗原的模拟表位，探讨其对日本血吸虫的免疫保护性。方法 用粗提日本血吸虫尾蚴抗原的抗体IgC作配体筛选噬菌体12肽库，按“吸附－洗脱－扩增”的过程进行三轮筛选；随机挑取单个噬菌体克隆进行Dot-ELISA检测；用混和噬菌体克隆免疫小鼠3次，攻击感染45d后剖杀冲虫，计算虫数及肝卵数。结果 经三轮筛选，特异性噬菌体得到富集，挑取11个噬菌体克隆经Dot-ELISA鉴定，均与日本血吸虫尾蚴抗原免疫血清呈特异性反应。与对照组相比，混和噬体克隆免疫小鼠的减虫率为18.79%，减卵率为38.00%。结论 利用噬菌体随机肽库技术获得了日本血吸虫尾蚴抗原的模拟表位，这些表位能诱导对日本血吸虫的保护性免疫。     

日本血吸虫感染小鼠脾细胞体外IL-2转录水平的实验观察

应用RT PCR方法对日本血吸虫感染小鼠脾细胞体外在SEA与ConA诱导下产生的IL 2从mRNA转录水平进行研究 ,以探讨该细胞因子mRNA转录水平的动态变化及其在肉芽肿形成与调节过程中的作用。结果显示 ,未感染和感染 3周小鼠脾细胞均无IL 2表达 ,感染后第 5周的小鼠脾细胞出现IL 2特异性条带 ,感染后第 8周IL 2表达明显增强 ,感染后第 1 0、1 2周无论SEA或ConA都不能诱导IL 2mRNA的转录。表明IL 2表达的动态变化与肉芽肿的形成、发展及调节相平行 ,提示IL 2可能在肉芽肿形成和调节过程中起重要作用。     

抗日本血吸虫病天然分子疫苗免疫猪血清筛选日本血吸虫尾蚴cDNA文库结果分析

目的通过天然分子疫苗免疫猪血清作为探针筛选日本血吸虫尾蚴cDNA文库,应用表达序列标签获得日本血吸虫新基因.方法制备天然分子免疫猪血清,将筛选的尾蚴cDNA文库中大肠杆菌XL1-Blue侵入大肠杆菌BM25.8后环化成质粒,筛选出已转入质粒的菌株.提取质粒DNA,进行测序,得到一个表达序列标签(EST).通过NCBI网站的BLASTx及BLASTn公共数据库,编辑分析EST序列并进行同源性比较.结果从26个克隆样品中筛选出8个阳性克隆,其中有一个新基因(GenBank登录号DQ097517),该基因全长861 bp,有完整的阅读框架,与蜜蜂(Apis mellifera)SMC3蛋白编码的mRNA基因序列同源性最高.结论疫苗免疫猪血清可作为筛选日本血吸虫新基因的有效探针,新发现1个日本血吸虫相关基因.     

三峡库区当地人群日本血吸虫IgG抗体特征研究

目的掌握三峡库区当地人群抗日本血吸虫特异性抗体本底分布特征,探讨库区人群抗血吸虫特异性抗体的影响因素。方法选择三峡库区中段万州区的当地居民为研究对象,用统一的调查表进行个案调查,采集2～3ml静脉血,检测人群血吸虫特异性抗体(IgG)。结果调查633人,人群血吸虫抗体水平几何平均数(OD均值)为0.0145,抗体阳性率为3.32%(21/633);男性OD均值为0.0140,女性为0.0150,二者间差异无统计学意义(t=0.543,P=0.587)。男性阳性率为3.103%,女性3.499%,差异无统计学意义(!2=0.076,P=0.782)。70岁以上组OD均值最高(0.0252),10～19岁组最低(0.0058),年龄组与OD均值呈明显的相关(r=0.224,P=0.000);学生OD均值显著低于家庭妇女(P=0.0000)、农民(P=0.0000)和工人(P=0.0000);学历与OD均值存在明显的相关(r=0.199,P=0.000),学历越高,OD值呈下降趋势;抗体水平全频率分布曲线均呈"L"型,OD均值小于0.03者占63.8%,小于0.07者分别为91.3%。多因素逐步回归分析表明,职业(t=2.3221,P=0.0211)和人均年收入(t=-2.2724,P=0.0240)与抗体水平显著相关。结论三峡库区人群日本血吸虫特异性抗体水平低,呈非流行区人群分布特征;三峡库区存在潜在的影响人群血吸虫特异性抗体水平的因素;建议进一步健全三峡库区血吸虫病监测体系,针对重点人群,开展健康教育,预防和控制血吸虫病在三峡库区发生和流行。     

在体外培养中吡喹酮对日本血吸虫肝门型童虫活动及存活影响的观察

用体外培养技术观察了吡喹酮对日本血吸虫肝门型童虫活动及存活情况的影响。童虫接触较低浓度(1μg/ml以下)吡喹酮后表现为短时间兴奋,继而出现轻度挛缩,虫体活动减弱,换正常培养基后活动很快恢复并能正常存活;而接触较高浓度(1μg/ml以上)吡喹酮后,童虫立即出现强直性挛缩,活动几乎停止,短时间(6h内)换正常培养基童虫活力尚可恢复并能正常存活,延长与药物接触时间童虫活力不能恢复,继续培养时也不能存活。