实时定量PCR评价小鼠胸腺功能方法的建立

目的建立实时定量PCR检测小鼠胸腺及脾脏T淋巴细胞中信号结合T细胞受体删除环（sjTRECs）水平的方法。推测其中的初始T细胞的数目,评价胸腺功能,从而为胸腺功能研究及胸腺研究模型的建立提供研究依据和方法。方法提取小鼠胸腺和脾脏淋巴细胞基因组DNA,PCR扩增目的片段。纯化构建标准质粒的RAG2片段,构建标准重组质粒并鉴定。优化PCR体系后,实时定量PCR反应建立标准曲线,并检测不同品系（BALB／c和C57BL／6）成年小鼠胸腺及脾脏淋巴细胞sjTRECs含量。结果成功构建标准质粒。确定最适实时定量PCR反应条件后,在实时定量PCR中建立可信度高的标准曲线。建立的方法分析表明,这两个不同品系的sjTRECs含量统计学差异不显著。结论成功建立定量检测小鼠T淋巴细胞中sjTRECs含量从而推测其中的初始T细胞数目的方法。为胸腺功能研究及胸腺研究模型的建立提供研究依据和方法。     

一种检测小鼠T淋巴细胞中sjTRECs含量简易方法的研究

目的建立一种快速、简单的检测小鼠胸腺和脾脏淋巴细胞的信号结合T细胞受体删除环(signal ioint TCR rearrangement excision circles,sjTRECs)水平的方法,并研究其准确性,以期推测初始T细胞含量从而评价胸腺功能。方法根据标准质粒荧光定量PCR的扩增曲线选择合适有效的扩增循环次数;优化PCR条件;梯度稀释的标准质粒(10^3—10^8拷贝)PCR扩增后使用图像分析软件包分析琼脂糖凝胶电泳的图像,测量PCR产物带的光密度,经统计获得标准曲线及方程。将样本的PCR产物带的光密度代入标准曲线方程,从而获得样本的sjTRECs水平读数,并和实时定量PCR结果比较。结果获得适合的PCR条件;成功建立可信度高的标准曲线;与实时定量PCR的检测结果比较,小鼠sjTRECs含量随年龄变化的趋势一致。结论成功建立研究方法,与实时定量PCR评价sjTRECs水平得到明显相似的结果,表明此方法可能成为TREC水平检测的一种有效可靠的分析方法。     

小鼠胸腺输出功能及免疫重建的研究方法

目的建立实时定量PCR检测小鼠T淋巴细胞中信号结合T细胞受体删除环（sjTREC）水平和T细胞受体β链可变区（TRBV）CDR3的方法,推测其中的初始T细胞的数目和克隆性,评价胸腺输出功能及免疫重建,从而为胸腺输出功能及移植后T细胞免疫提供可靠的研究方法。方法分别提取小鼠脾脏细胞基因组DNA和总RNA。PCR方法扩增DNA标本目的片段。纯化鉴定并构建含sjTREC片段的质粒标准品。建立稳定的实时定量PCR反应检测小鼠脾脏淋巴细胞sjTREC含量的方法。采用半巢式PCR扩增TRBV基因产物,采用ABI3700分析TRBV谱型。结果构建了可靠的sjTREC和TCRα质粒标准品。在实时定量PCR中建立了可靠的标准曲线。建立的定量PCR方法分析可成功用于脾细胞的sjTREC含量的检测。8周龄BALB/c小鼠脾细胞sjTREC含量为（626±115）拷贝/10^5个脾细胞。结论建立了可靠的定量检测小鼠T淋巴细胞中sjTREC含量的方法,建立了分析T细胞谱型的方法,为研究生理和病理条件下胸腺输出功能及T细胞免疫重建改变提供了可靠的方法。     

枸杞子对D-半乳糖致免疫衰老小鼠胸腺功能的作用

目的：建立D-半乳糖致衰老动物模型,并设置不同处理,研究枸杞子对于小鼠胸腺功能的作用,确定其对于免疫衰老的影响。方法：小鼠分组进行造模并给药;实时定量PCR方法对处理后小鼠胸腺初始T细胞标记物（sjTRECs）进行绝对定量以评价免疫中枢器官胸腺的生成和输出功能。结果：小鼠胸腺和脾脏的T淋巴细胞中的sjTRECs的含量：D-Gal模型组〈枸杞组〈对照组（P〈0.05）。结论：D-Gal模型组与对照组相比,小鼠胸腺的初始T细胞生成和输出功能显著减弱,成功建立了D-Gal致小鼠免疫衰老的模型。枸杞组的小鼠胸腺初始T细胞生成和输出功能较D-Gal组显著增强,具有延缓衰老和免疫保护的作用。     

异基因造血干细胞移植合并胸腺移植及CD4--DLI后T细胞重建情况

目的 评价异基因造血干细胞(allo-HSCT)联合胸腺移植(TT)时给予去除CD4+T细胞供体淋巴细胞输注(CD4--DLI)对T细胞重建及向外周T细胞储存库输出能力的影响.方法 分为两组,对照组allo-HSCT时联合TT,处理组allo-HSCT时联合TT及CD4--DLI,移植5个月后提取小鼠脾脏T细胞的基因组DNA,以实时定量PCR检测小鼠脾脏T细胞中信号结合T细胞受体重排删除环(sjTRECs)水平,PCR扩增目的基因与RAG2片段,建立PCR标准曲线并比较对照组和处理组脾脏T细胞sjTRECs含量.结果 对照组和处理组的脾脏T细胞sjTRECs水平差异有统计学意义,处理组显著高于对照组(P＜0.01).结论 allo-HSCT+TT时给予CD4--DLI能够显著加快移植后T细胞重建及向外周T细胞储存库输出能力的恢复.     

ADSCs对辐射诱发C57小鼠胸腺瘤免疫功能的影响及其机制

目的:观察脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)对辐射诱发小鼠胸腺瘤免疫功能的影响及其可能的机制,方法:清洁级C57BL/6小鼠32只,随机分为4组:对照组、照射组、照射+ADSCs组、假照射+ADSCs组,各8只,末次照射后第7天后分别处死4组小鼠,计算小鼠胸腺指数.刀豆素A(ConA)诱导的胸腺淋巴细胞转化率采用MTY法测定,运用流式细胞仪检测胸腺淋巴细胞的细胞周期以及T淋巴细胞亚群的变化.结果:照射+ ADSCs组相对于照射组小鼠的胸腺淋巴细胞转化率和胸腺指数显著增高(P＜0.05),并且CD4+T淋巴细胞的含量显著增加(P＜0.05),CD8+T淋巴细胞明显下降(P＜0.05),CD4+/CD8+T淋巴细胞比值显著升高(P＜0.05).结论:ADSCs可能通过调节小鼠胸腺内细胞水平的变化,保护小鼠胸腺细胞的免疫功能.     

混合胸腺裸小鼠移植模型的建立及重建T细胞功能的体外研究

目的　建立混合胸腺移植模型 ,并在体外观察重建T细胞的功能状况。方法　首先建立混合胸腺裸小鼠左肾包膜下移植模型 ,流式细胞仪检测受体动物外周血中T细胞的重建情况 ,并利用刀豆素A(concanavalinA ,ConA)增殖实验和混合淋巴细胞培养检测其体外功能状态。结果　混合胸腺移植 3个月后 ,移植的胸腺组织在裸小鼠肾包膜下能够正常发育 ,并有效重建了受体外周血中的CD4 T和CD8 T细胞。体外功能检测显示 ,受体的脾细胞对ConA的刺激有良好的反应性 ,并对供体胸腺来源的F3Q44大鼠抗原刺激表现为特异性的低反应。结论　混合胸腺移植不仅在数量上可重建受体裸小鼠外周血中CD4 T和CD8 T细胞 ,而且受体中重建的T细胞还可发挥正常的免疫功能     

粒细胞集落刺激因子对急性辐射损伤小鼠胸腺输出功能的影响

目的粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)是急性辐射损伤治疗的首选药物,但其在促进粒系造血恢复的同时能否促进辐射损伤后中枢免疫功能恢复尚不清楚。文中以亚致死量辐射损伤小鼠为研究对象,观察G-CSF对急性辐射损伤后胸腺输出功能的影响。方法雌性BALB/c小鼠50只给于6.0 Gy60钴一次性全身照射后随机均分为2组。G-CSF组小鼠给予重组人G-CSF 100μg/(kg.d)皮下注射,连续14 d;对照组小鼠给予等体积磷酸盐缓冲液(PBS)皮下注射,连续14d。照后30d、60d分别利用流式细胞仪及荧光定量PCR技术检测外周血中初始T淋巴细胞比例以及胸腺细胞中T细胞受体重排删除环(T cell receptor rearrangement excision circles,TRECs)拷贝数,判断胸腺输出功能。结果照后30 d,G-CSF组小鼠外周血中初始T淋巴细胞比例G-CSF组(3.5±0.9)%与对照组(1.3±0.8)%比较差异有显著性统计学意义,P≤0.05;胸腺信号结合T细胞受体删除环(signal joint T cell receptor rearrangement excision circles,sjTRECs)拷贝数G-CSF组(6450±783)均明显高于对照组(3630±595),P<0.05。但照后60 d 2组上述检测指标差异无统计学意义。结论 G-CSF可在急性辐射损伤后早期增加胸腺输出功能,促进中枢免疫重建。     

红枣注射液对小鼠免疫功能的影响

目的：观察红枣注射液对小鼠免疫功能的影响。方法：用100％红枣注射液给小鼠皮下注射，观察小鼠胸腺及脾重量、血清溶菌酶含量、T淋巴细胞酸性α－醛酸奈脂酶（ANAE）细胞百分率及T淋巴细胞转化率。结果：实验组小鼠胸腺及脾重量增加，血清溶菌酶含量增加，T淋巴细胞ANAE活性升高，T淋巴细胞转化率增高。结论：红枣注射液能使小鼠免疫器官重量增加，并能增强小鼠非特异性免疫功能及特异性细胞免疫功能。     

T细胞在胸腺内的分化发育

T细胞即胸腺依赖淋巴细胞（thymus dependent lympnocyte),是在胸腺内分化并发育成熟的。T细胞的分化发育指来自骨髓的淋巴干细胞进入胸腺,在此分裂、增殖、发育,并从皮质迁移入髓质,成为成熟T细胞的过程^[1]。本文就T细胞分化发育的条件、过程、T细胞在胸腺中的选择作用及基意义进行综述。     

造血干细胞移植患者动态监测胸腺输出功能的意义

目的观察造血干细胞移植患者胸腺近期输出功能的动态变化情况,分析其相关影响因素,从而了解移植后T细胞免疫重建情况。方法选择2007年1月~2012年6月于北京大学深圳医院接受造血干细胞移植的血液病患者41例,采用实时荧光定量PCR方法检测患者不同时期200μL外周血中T细胞受体重排DNA删除环（sjTREC）水平,计算每毫升血液中sjTREC拷贝数。同时检测32例年龄匹配的正常者外周血T细胞受体重排DNA删除环含量作为正常对照。比较患者造血干细胞移植后sjTREC随时间变化情况。结果 32例正常对照组外周血Log sjTREC/mL为3.78±0.22,它与年龄呈负相关（r=-0.59,P〈0.05）。41例移植患者移植前外周血sjTREC水平显著低于正常对照组,移植后外周血sjTREC进一步下降,移植6个月后TRECs逐渐升高,移植后1.5年基本恢复至移植前水平,移植后2.5年恢复至接近正常水平。反复化疗可使患者胸腺输出功能下降。不同年龄组患者移植后胸腺输出功能恢复差异无统计学意义（P〉0.05）。移植6个月后,自体造血干细胞移植组患者外周血sjTREC水平恢复快于异基因移植组（P〈0.05）,至移植后2年二者差异无统计学意义（P〉0.05）。移植1年后存在广泛型cGVHD的患者其外周血sjTREC水平下降,低于无cGVHD者（P〈0.05）。结论造血干细胞移植后T细胞免疫重建缓慢,并受多种因素影响。胸腺输出功能可作为评价移植后免疫重建的有效指标。     

The Study on Morphological and Functional Changes of Thymus, Spleen and T Lymphocytes in Vasectomized Rabbits

The morphology and functional changes of thymus, spleen and T lymphocytes were studied in vasectomlzed rabbits. The results showed that: (t) A significant low weight of thymus and spleen, and a slight or medium atrophy of thymic lobules and shrinked splenic nodules and lymphoid tissues were observed in the rabbits vasectomized for 6 months (VG6 rabbits), (2) Spontaneous-proliferation of thymus could not be affected by vasectomy, (3) The lowest activity of IL 2 was detected in the supernatant of spleen ceil culture of VG6 rabbits.     

小鼠Aire逆转录病毒表达载体的构建及表达

目的：将小鼠Aire基因定向连入MigR1-GFP质粒,得到长期稳定的Aire逆转录病毒表达载体,收集逆转录病毒上清感染胸腺基质细胞,为研究Aire在胸腺细胞终末分化中的作用奠定基础。方法：以小鼠胸腺基质细胞的cDNA为模板扩增得到Aire的ORF片段;将该片段连接入MigR1-GFP质粒;将构建成功的Aire—MigR1-GFP质粒转染293T细胞,收集逆转录病毒上清;使用逆转录病毒上清感染胸腺基质细胞系MTEC9,流式细胞仪检测感染效率,Western blot确定Aire蛋白的表达。结果：（1）成功得到Aire的ORF片段。（2）构建的Aire逆转录病毒表达质粒能够成功表达Aire蛋白。（3）逆转录病毒上清成功感染胸腺基质细胞系MTEC9。结论：成功构建了小鼠Aire逆转录病毒表达载体,并实现了Aire蛋白在胸腺基质细胞系中的强制性表达。     

T淋巴细胞体外发育方法的研究进展

T淋巴细胞（简称T细胞）在细胞过继免疫治疗（ACT）中发挥重要作用,利用T细胞体外发育方法可获得来源稳定且获取简便的T细胞,相比从自体或同种异体组织分离得到T细胞的传统方法更有优势。目前T细胞体外发育方法有胎儿胸腺器官培养、重组胸腺器官培养和Notch信号驱动的二维培养三种。其中胎儿胸腺器官培养操作简便,离体胸腺在体外培养即可支持T细胞分化发育至成熟,但完整的胸腺导致培养物维持时间有限、细胞收获困难;重组胸腺器官培养将各类胸腺基质细胞分散再重组构建三维培养环境,在体内外实验中均可支持T细胞成熟,但生物材料和三维环境导致培养物维持时间和细胞产量均受限;Notch信号驱动的二维培养采用人工呈递Notch信号通路配体来驱动T细胞分化发育,培养体系结构简单且稳定,但仅能支持T细胞发育至早期未成熟阶段。本文综述了上述培养方法的研究进展和不足之处,并讨论了T细胞体外发育未来发展的要求和方向,以助力ACT的推广和应用。     

白念珠菌菌血症诱导小鼠皮质胸腺细胞凋亡

采用白念珠诱导小鼠胸腺内细胞凋亡,对其发生部位和累及的胸腺内细胞表型进行了研究。结果发现：静脉注射白念珠菌入小鼠体内６ｈ后,开始出现胸腺细胞凋亡;１２ｈ、１８ｈ和２４ｈ胸腺凋亡细胞百分率不断增加;ＣＤ３＾＋和ＣＤ８＾＋细胞百分率均较对照组有明显的下降;胸腺内细胞凋亡主要发生在皮质区,而髓质区别少。表明白念珠菌能诱导小鼠胸腺细胞凋亡（主要是未成熟ＣＤ３＾＋ ＣＤ４＾＋ ＣＤ９＾＋细胞及少量成熟的ＣＤ     

白念珠菌菌血症诱导小鼠皮质胸腺细胞凋亡

采用白念珠菌诱导小鼠胸腺内细胞凋亡 ,对其发生部位和累及的胸腺内细胞表型进行了研究。结果发现 :静脉注射白念珠菌入小鼠体内 6h后 ,开始出现胸腺细胞凋亡 ;1 2h ,1 8h和 2 4h胸腺凋亡细胞百分率不断增加 ;CD3+和CD8+细胞百分率均较对照组有明显的下降 ;胸腺内细胞凋亡主要发生在皮质区 ,而髓质区则少。表明白念珠菌能诱导小鼠胸腺细胞凋亡 (主要是未成熟CD3+CD4+CD8+细胞及少量成熟的CD3+CD4- CD8+细胞 )