人载脂蛋白基因apoAⅠ在毕赤氏酵母中的胞内表达

将PCR扩增得到的apoAⅠ基因片段插入胞内表达质粒pPIC3.5K,重组的pPIC3.5K apoAⅠ用BglⅡ酶切后,转化PichiapastorisGS115菌株,筛选获得G418高抗性转化子,再通过PCR鉴定证实apoAⅠ基因已整合到染色体上.其转化子经摇瓶发酵和甲醇诱导,收集细胞裂解后,用SDS PAGE与Westernblotting检测,证明胞内有明显的rApoAⅠ表达,其分子质量与人血浆提取的ApoAⅠ相同.     

人血管抑制素基因克隆、表达和生物活性分析

应用PCR技术从人胎肝cDNA库中扩增了人血管抑制素基因。将克隆的基因重组进酵母质粒pPIC9K获得含该基因的重组质粒pPIC9KA3。用电激法将质粒pPIC9K转化毕节酵母GSll5，经PCR检测获得含人血管抑制素基因的酵母工程菌GSll5(pPIC8KA3)。再用G418筛选法，在含不同浓度的G418平板上筛选高拷贝整合的转化子。对高拷贝整合的转化子进行发酵培养和诱导表达。SDS—PAGE及Westem印迹分析显示：表达产物约占胞外蛋白的43％，相当于94mg/L，并具有免疫活性。并能抑制bFGF诱导的鸡胚尿囊膜新生血管的生成。还对用G418筛选高拷贝整合转化子的方法做了探索。     

红色荧光蛋白在毕赤酵母中的高效表达

报道了红色荧光蛋白(DsRFP)在毕赤酵母中的高水平表达．利用PCR技术从YEpFLAG-1-DsRFP扩增出DsRFP编码序列．克隆到毕赤酵母胞内表达载体pPIC3．5K构建重组表达载体pPIC3．5K-DsRFP．电击转化进毕赤酵母．G418-RDB平板双重筛选后获得重组转化子．经MM／MD平板培养与PCR鉴定．重组子全部为HIS^ -MUT^ 表型．重组菌株诱导表达48h后获得了高效表达．摇瓶中表达水平达到细胞内总蛋白的12％．表达量达到1．8g／L．经硫酸铵分级沉淀，DE-AE-5PW阴离子交换柱层析与S-HyperD阳离子交换柱层析后获得电泳纯蛋白．说明我们建立的毕赤酵母表达应用平台具有高效表达外源蛋白的能力。     

人载脂蛋白基因apoAⅠ在毕赤氏酵母中的表达

将化学法合成的apoAⅠ基因插入分泌型载体 pPIC9K .将重组的 pPIC9K apoAⅠ用BglⅡ酶切后 ,转化PichiapastorisGS115菌株 ,筛选获得G4 18高抗性转化子 .转化子经摇瓶发酵和甲醇诱导 ,上清液用SDS PAGE检测 ,有明显的rApoAⅠ表达 .经Phenyl sepharose 6 (FastFlow)疏水层析柱和SephadexG 5 0 (coarse)分子筛层析 ,得到rApoAⅠ蛋白纯品 .经Westernblotting ,N末端氨基酸顺序测定证明 ,毕赤氏酵母表达的rApoAⅠ与人血浆提取的ApoAⅠ基本一致 .     

链霉菌H197 mtg基因毕赤酵母表达载体的构建与鉴定

将酵母胞内表达质粒pPIC3.5k重组成带有谷氨酰胺转胺酶的新型表达载体pPIC3.5k/MTG,为谷氨酰胺转胺酶（MTG）在毕赤酵母中的表达研究提供了实验基础.利用PCR的方法扩增出MTG基因片段,将目的片段和质粒pPIC3.5k进行双酶切后进行连接,构成重组质粒,然后转化至E.coli DH5α感受态细胞中,筛选阳性克隆,经测序证明为目的基因片段.结果表明：经过PCR和酶切均证明已经将目的片段转到酵母表达载体pPIC3.5k内.     

人甲状旁腺素在甲醇毕赤酵母中的分泌表达

选用酵母偏爱的密码子，人工合成长度为282bp的人甲状旁腺素(hFTH)基因，将其克隆于M13载体中，DNA测序验证正确。通过PCR从含有hFTH基因的M13载体获得了该基因，将其插入到含有AOX1启动子和α因子信号肽序列的表达载体pPIC9K中，构建了重组质粒pPIC9K-hFTH，电击法转化甲醇毕赤酵母(Picha pastoris)GS115菌株，经G418筛选得到高拷贝转化子，甲醇诱导表达，Tricine-SDS-PAGE电泳结果表明在9．3kDa处有明显的诱导蛋白带，与报道的hFTH的相对分子质量相近；酶联免疫沉淀法(ELISA)检测证明表达的蛋白具有hFTH免疫活性为132ng／L。     

人载脂蛋白基因apoAI在毕赤氏酵母中的表达

将化学法合成的apoAI基因插入分泌型载体pPIC9K．将重组的pPIC9K—apoAI用BglⅡ酶切后，转化Pichia pastoris GS115菌株，筛选获得G418高抗性转化子．转化子经摇瓶发酵和甲醇诱导，上清液用SDS-PAGE检测，有明显的rApoAI表达．经Phenyl—sepharose 6(Fast Flow)疏水层析柱和Sephadex G-50(coarse)分子筛层析，得到rApoAI蛋白纯品．经Western blotting，N末端氮基酸顺序测定证明，毕赤氏酵母表达的rApoAI与人血浆提取的ApoAI基本一致．     

分泌性表达人rPA毕赤酵母工程菌株的构建及发酵条件的初步优化

通过PCR扩增得到组织型纤溶酶原激活剂突变体Reteplase(rPA)基因片断，将该基因片断插入到含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列载体pPIC9K中，构建了重组表达质粒pPICgK／rPA，转化Pichia pastoris GS115宿主菌．通过比较转化子在MM和MD平板上的生长状况，筛选His^ Mut^s表型转化子．并在2．0mg/mL G418平板筛选得到多拷贝转化子GR10，GR11．摇瓶培养，甲醇诱导外源基因表达，表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析，结果表明重组蛋白分子量约39ku，能与特异性单克隆抗体发生免疫反应；体外气泡法测定rPA活性，结果显示重组蛋白具有较好的纤溶活性．通过正交试验，优化发酵条件，表达活性最高为1050IU／mL．     

α-amanitin线性肽骨架融合基因表达条件的优化

利用加端PCR技术在pGEX—1λT质粒BamHⅠ和pstⅠ位点间(片段BamHⅠ端)加入α-amanitin线性八肽碳骨架编码序列，再将两次连续加端PCR产物连入BamHⅠ、PstⅠ双酶切的pGEX—1λT载体，得到含α-amanitin线性碳骨架编码序列的阳性重组子pGAT-1．序列测定和结果分析显示，构建的融合基因相位正确，阅读框通读．通过对融合基因在大肠杆菌中表达条件的优化，目的融合蛋白的表达量可提高33．5％，占总蛋白表达量的28．3％．     

单链莫奈林基因表达载体的构建及其分泌表达

根据甜蛋白莫奈林的氨基酸序列，选择酵母偏爱密码子，化学合成单链莫奈林(Single-Chain Monellin，SCM)基因片段，并拼接成全基因．基因的DNA序列分析表明，合成的单链莫奈林基因与设计的一致．该基因插入于毕赤氏酵母整合型质粒pPIC9K中置于AOXI启动子的控制下，并通过电转化技术将重组质粒pPIC9K／SCM导入Pichia pastoris，在含有G418的YEPD平板上筛选整合型的多拷贝的转化子．转化子在BMMY培养基中经甲醇诱导表达，用SDS-PAGE检测发酵液，表明SCM的分泌表达蛋白可达发酵液蛋白含量的90％．     

转甲状腺素蛋白基在毕赤氏酵母中的非融合表达

用限制酶将pSK-TTR质粒上TTR基因切下，分别插入分泌型载体pPIC9和pPIC9K，将重组的pPIC9K-TTR用BglⅡ酶切后，转化pichia pastoris GS115菌株，筛选获得G418高抗性转化子，转化子经摇瓶发酵，上清液用SDS-PAGE检测，有明显的rTTR表达，经DEAE-sepharose F.F.离子交换柱和Superdex75分子筛层析，得到蛋白线纯度大于95%的rTTR，经Western Boltting，分子质量和等电点测定等证明，毕赤氏酵母的表达rTTR与人血浆提取的TTR极为相似。     

重组质粒pPIC9K-pZP3α-hCGβ CTP109～145的构建

目的：为发展多特异性避孕疫苗,制备重组抗原pPIC9K－pZP3α－hCGβCTP^109-145,用基因工程技术构建重组质粒pPIC9K－pZP3α－hCGβCTP^109-145,方法：根据pZP3α全长和hCG 0633CTP109-145编码的DNA序列设计两对引物,通过部分重聚合酶链式反应（overlaping PCR）,扩增出pPIC9K－pZP3α－hCGβCTP^109-145片断,克隆到载体质粒pPIC9K中,然后导入大肠杆菌DH5α,用PCR和双酶切反应鉴定重组质粒,并用DNA测序仪对重组质粒测序,结果：3步PCR扩增出pPIC9K－pZP3α－hCGβCTP^109-145DNA片段,插入到载体质粒pPIC9K的克隆位点,获得重组pPIC9K－pZP3α－hCGβCTP^109-145表达质粒,测序结果显示插入序列与设计预期完全一致。结论：重组质粒pPIC9K－pZP3α－hCGβCTP^109-145构建成功,为表达重组抗原pPIC9K－pZP3α－hCGβCTP^109-145,探讨重组多特异性避孕疫苗抗生育效能的研究建立基础。     

抗菌肽AD基因的改造及在毕赤酵母中的表达

采用PCR技术改造抗菌肽AD基因，将其C末端改造为Asn编码，改造后的抗菌肽Cecropin AD基因克隆到pPICZα－A载体上，构建成酵母重组分泌型表达载体，转化毕赤酵母（Pichia pastoris)受体菌GS115中，采用zerocin抗性标记筛选重组转化子，经摇瓶发酵，浓缩发酵液进行酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和抑菌活性检测。结果表明，改造后的Cecropin AD基因在毕赤酵母中获得了表达，表达产物经α－Factor信号肽引导分泌到胞外，具有较强的杀菌活性。     

脉胞菌hH3v基因的初步研究及原核表达载体构建

根据植物表达载体pET52（b）多克隆位点和脉胞菌着丝粒结构相关蛋白CenH3的编码基因hH3v序列，设计引物，通过PCR扩增将基因两端加上KpnⅠ和SacⅠ酶切位点，经双酶切后将hH3v插入表达载体pET52（b）中，利用热激法转化大肠杆菌Top10感受态细胞，在选择培养基上挑取单菌落培养，经PCR检测，表明目的基N原核表达载体构建成功，为着丝粒结构进一步的研究提供了基础．     

酿酒酵母GPDH1基因表达载体pPIC3.5K-ScGPD的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的表达

将酿酒酵母3-磷酸甘油脱氢酶基因GPDH1的编码序列构建到表达载体pPIC3．5K中，利用电转化法将构建好的表达载体转入巴斯德毕赤酵母中，利用含有G418的YPD平板筛选到两个阳性转化子，通过分子生物学及外源蛋白表达实验证明，酿酒酵母3-磷酸甘油脱氢酶基因GPDH1已经整合到巴斯德毕赤酵母的基因组上，并且得到了预期的表达。     

β葡聚糖酶杂合基因bglHAM的克隆及在P.pastoris中的表达

采用PCR的方法,以Bacillus macerans总DNA为模板,构建出β-1,3-1,4葡聚糖酶杂合基因bglHAM,与巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K重组,得到重组质粒pPIC9K-HAM,电脉冲转化法转化酵母菌GS115,KM71,在MM,MD平板上筛选表型,YPD-G418平板上筛选多拷贝重组子,重组菌株经甲醇诱导后,刚果红平板染色法检测到β-葡聚糖酶活性,SDS-PAGE证明表达产物的分子量约为24kD,摇瓶诱导培养筛选到的重组菌株,胞外每mL发酵液最高酶活达240U。     

重组人细胞色素P450 2C9在毕赤酵母中的胞内表达

以含有CYP2C9基因完全编码框的克隆载体质粒DNA为模板,并在人细胞色素P4502C9的5’端插入kozak序列及3’端6×His标签进行PCR扩增,克隆至真核表达载体pPIC3.5K,利用电激法将经Sal I线性化的重组质粒pPIC3.5K-2C9转化至毕赤酵母GS115中,通过抗性、表型和PCR筛选多拷贝整合株,甲醇诱导毕赤酵母GS115/pPIC3.5K-2C9的表达,SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定表达产物.结果表明:含有重组质粒的重组pPIC3.5K-2C9表达了大小为55KD的目的蛋白,与预期大小相符,说明人细胞色素CYP2C9可在毕赤酵母的胞内表达.     

分泌载体pPSA18的构建及地衣杆菌淀粉酶在枯草杆菌中的表达和分泌

本文报道利用枯草杆菌噬菌体Spol 的启动子Spac Ⅰ,合成的解淀粉芽胞杆菌信号序列及枯草杆菌质粒PUB 18重组,构建分泌型表达载体并将地衣芽胞杆菌α-淀粉酶基因(缺失启动子及信号序列)引入构建的载体,获得重组质粒pPSA 18.将此质粒转化枯草杆菌QB1130(amy~-)感受态细胞,在含5μg/ml 卡那霉素及1%可溶性淀粉的LB 平板上筛选Km~r 及淀粉酶阳性的转化子.从阳性转化子中提取质粒,经酶切分析后重新转化枯草杆菌QB1130,得到的转化子全部都能向胞外分泌淀粉酶,证明构建的载体能在枯草杆菌中表达和分泌外源基因产物.