胆管癌细胞系QBC939裸鼠肝门部胆管原位种植瘤模型的建立

目的建立胆管癌细胞系QBC939裸鼠肝门部胆管原位种植瘤模型并观察淋巴引流情况。方法应用我们前期建立的肝门部胆管癌细胞系QBC939,行裸鼠背部皮下接种,建立高转移特性胆管癌裸鼠皮下种植瘤模型,然后将高转移性种植瘤组织接种于裸鼠肝门部胆管与门静脉间组织间隙紧贴胆管处,4周及6周后行种植瘤瘤组织解剖学和病理学检查,并观察淋巴管引流情况。结果模型建立过程中,胆管癌细胞系QBC939细胞裸鼠皮下接种成瘤率为100%(10/10);原位种植4周后,肝门部胆管原位种植瘤成瘤率为100%(10/10),原位种植6周后,合并发生肝脏转移及腹腔淋巴结转移为80%(8/10)。结论成功建立了胆管癌细胞系QBC939裸鼠肝门部胆管原位种植瘤模型。     

利用裸鼠建立人肝门部胆管癌肝门移植模型

目的:应用肝门部胆管癌细胞系FRH及组织块法建立裸鼠人肝门部胆管癌肝门移植模型,观察肿瘤局部浸润和远处转移情况.方法:20只裸鼠取上腹部切口,显露肝门部,取裸鼠皮下移植瘤边缘直径约1mm组织块植入肝门部肝实质内.观察裸鼠生命体征的变化,定期处死裸鼠,取血查肝功,取肝门肿瘤、肝脏、胰腺、脾脏、胃肠、肺脏标本福尔马林液固定,苏木素-伊红染色后显微镜下观察,肝门移植瘤电镜观察.结果:20只模型全部建立成功,成瘤率100%,2周左右可触及肝门部有小结节,平均4周出现黄疸,6周左右裸鼠出现明显恶液质.解剖后发现肝门部肿瘤侵及胆囊、肝门血管和腹腔淋巴结.胰腺、脾脏、胃肠、肺脏未见转移灶.结论:肝门部胆管癌肝门移植模型成瘤率高,其转归接近临床,可用于肝门部胆管癌的实验研究.     

双自杀基因系统对体内外胆管癌抑制作用的实验研究

目的观察胞嘧啶脱氨酶基因（CD）和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV-tk）双杀基因对胆管癌细胞和裸鼠胆管癌移植瘤的抑制作用.方法在脂质体介导下将质粒pWZLneoCDglytk转入胆管癌QBC939细胞,经G41 8筛选获得稳定表达双自杀基因的QBC939/CD＋tk细胞株,RT-PCR法鉴定CD和tk基因的表达.体外给予前体药物5-氟胞嘧啶（5-Fc）和/或丙氧鸟苷（GCV）,作用于QBC939/CD＋tk细胞,MTT法测定细胞抑制率.裸鼠皮下注射QBC939/CD＋tk细胞,成瘤后腹腔注射前体药物,用药前后测量移植瘤的大小判断疗效.结果CD和tk基因在QBC939/CD＋tk细胞中获得稳定表达.联合5-Fc和GCV与任何单一药物相比,在较小剂量下可产生较强的抑制作用.随着药物浓度的提高,对细胞生长的抑制作用也相应地提高.前体药物对QBC939/CD＋tk细胞早期生成的移植瘤抑制作用明显,肿瘤可完全消失,并观察到明显的局部旁观者效应.结论双自杀基因系统在体内外对胆管癌细胞和裸鼠移植瘤均有明显的抑制效果,旁观者效应也很明显.     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂对胆囊癌细胞系和肝外胆管癌细胞系HDAC1表达的影响

目的 观察组蛋白去乙酰化酶抑制剂-曲古抑菌素(TSA)在体外和体内对胆囊癌细胞和肝外胆管癌细胞HDAC1表达的影响.方法 用TSA作用于胆囊癌细胞系(Mz-ChA-1)和肝外胆管癌细胞系(QBC939、KMBC、OZ),然后用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测HDAC1之mR-NA的表达变化,用Western blot检测其蛋白的表达变化.将这些细胞接种在裸鼠皮下建立胆囊癌和肝外胆管癌裸鼠种植瘤模型,用免疫组织化学方法 观察TSA在体内对裸鼠种植瘤组织中HDAC1蛋白表达的影响.结果 TSA可以减弱胆囊癌细胞系(Mz-ChA-1)和肝外胆管癌细胞系(QBC939、KMBC、OZ)HDAC1 mRNA和蛋白的表达;TSA作用前后的胆囊癌细胞系(Mz-ChA-1)和肝外胆管癌细胞系(KMBC)裸鼠成瘤组织中的各种蛋白的表达均无变化.结论 TSA在体外可以抑制胆囊癌和肝外胆管癌HDAC1的表达;TSA抑制HDAC1表达的作用可能受到体内环境的影响而消失.     

人胆管癌细胞神经周围浸润模型的构建与初步观察

目的构建人胆管癌细胞神经周围浸润模型，观察培养神经细胞的生长、人胆管癌细胞的增殖与神经周围浸润的过程的形态学变化。方法应用小鼠背根神经节（Dorsal Root Ganglia，DRG）置于Matrigel基质中体外培养，同时在其表面接种人胆管癌细胞QBC939，观察神经纤维的生长、QBC939细胞粘附、浸润神经纤维的过程及其形态学变化。结果小鼠DRG置于Matrigel基质中体外培养时，神经纤维生长迅速，人胆管癌细胞QBC939能够穿过人工基质粘附并浸润神经纤维，形成包绕神经纤维的细胞团。结论DRG／神经细胞-肿瘤细胞共培养模型较好的模拟了肿瘤细胞穿过细胞基质，浸润神经纤维的过程，人胆管癌细胞QBC939细胞对神经纤维具有亲嗜性。     

人胆管癌细胞神经周围浸润模型的构建与初步观察

目的构建人胆管癌细胞神经周围浸润模型,观察培养神经细胞的生长、人胆管癌细胞的增殖与神经周围浸润的过程的形态学变化。方法应用小鼠背根神经节(DorsalRootGanglia,DRG)置于Matrigel基质中体外培养,同时在其表面接种人胆管癌细胞QBC939,观察神经纤维的生长、QBC939细胞粘附、浸润神经纤维的过程及其形态学变化。结果小鼠DRG置于Matrigel基质中体外培养时,神经纤维生长迅速,人胆管癌细胞QBC939能够穿过人工基质粘附并浸润神经纤维,形成包绕神经纤维的细胞团。结论DRG/神经细胞-肿瘤细胞共培养模型较好的模拟了肿瘤细胞穿过细胞基质,浸润神经纤维的过程,人胆管癌细胞QBC939细胞对神经纤维具有亲嗜性。     

人肝门部胆管癌转移动物模型的建立及生物学特性研究

目的利用人肝门部胆管癌细胞系（FRH-0201）接种裸鼠脾脏，建立肝、肺转移模型。方法将FRH-0201细胞系（120代）接种于7只Balb／c裸小鼠脾脏。出现转移时，将转移瘤行组织病理学及超微结构观察。将转移的肿瘤行细胞培养，再次接种裸鼠脾脏，观察转移成瘤情况。结果脾脏局部成瘤率为100％（7／7），转移瘤发生率14．3％（1／7）。转移瘤细胞再次接种于裸小鼠脾脏，转移发生率100％。转移瘤电镜显示典型恶性细胞特征。转移瘤细胞染色体众数19条，主流范围18～44条。结论该实验所建立的肝门部胆管癌转移瘤，符合恶性肿瘤的特点，与人肝门部胆管癌生物学特性一致。     

丙型肝炎病毒核心蛋白激活肝门部胆管癌细胞血管内皮生长因子的表达

目的 探讨丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白对肝门部胆管癌生长和转移的影响。方法 首先构建表达HCV核心蛋白的真核表达载体pcDNA3-HCVcore,再将含有 pcDNA3-HCVcore的载体和不含 pcDNA3-HCV core的空载体分别导入肝门部胆管癌细胞株 QBC939中,RT-PCR和免疫组织化学检测 VEGF mRNA和蛋白表达。结果 重组质粒 pcDNA3-HCVcore在 QBC939细胞中有稳定表达;表达 HCV核心蛋白的细胞QBC939的 VEGF在蛋白水平和 mRNA水平较转染空载体的细胞QBC939明显升高。结论 HCV核心蛋白能激活VEGF表达,可能对肝门部胆管癌的生长和转移具有促进作用。     

核酸内切酶在肝门部胆管癌组织和细胞株中的表达和临床意义

目的 研究核酸内切酶(Dicer)在肝门部胆管癌组织和胆管癌细胞株(QBC939)中的表达及其与临床病理因素和预后的相关性.方法 采用免疫组化染色检测40例肝门部胆管癌和10例正常胆管组织中Dicer的表达;Western-blot和RT-PCR检测人胆管癌细胞株QBC939与人胆管上皮细胞株HIBEpic中Dicer的表达量;分析Dicer表达与临床病理因素的相关性.对根治性切除的肝门部胆管癌患者术后总生存期和无病生存期进行单因素和多因素分析.结果 Dicer在肝门部胆管癌组织中的表达明显低于正常胆管组织(P＜0.05),在QBC939中的表达明显低于HIBEpic(P＜0.05),高分化胆管腺癌中Dicer表达明显高于中、低分化腺癌.单因素生存分析结果显示Dicer低表达组的根治性切除术后总生存期和无病生存期均短于高表达组(P＜0.01).多因素分析显示Dicer表达水平为与预后相关的独立危险因素(P＜0.05).结论 在肝门部胆管癌和胆管癌细胞株Dicer表达下调;低表达Dicer的胆管癌患者预后更差.Dicer可能为肝门部胆管癌的诊断和判断预后的分子标志物.     

PTEN基因联合奥沙利铂对胆管癌细胞生长抑制的研究

目的探讨脂质体介导PTEN基因转染人胆管癌细胞（QBC939）,联合化疗药物奥沙利铂（L-OHP）,分别进行人胆管癌细胞体外培养和体内接种生长,观察分析该基因对胆管癌细胞生长的抑制情况,探索人类胆管癌的生物治疗的可行性和方法.方法将携带PTEN基因的真核表达载体pBP-PTEN和不含该基因的空载体.转胆管癌QBC939细胞,嘌呤霉素抗性筛选克隆、扩增培养.绘制细胞生长曲线及MTT细胞活性观察;利用免疫组化检测转染前后PTEN阳性表达率;透射电镜扫描观察转染前后及联合奥沙利铂后细胞的超微结构变化;流式细胞分析细胞的周期变化和细胞凋亡情况;体外细胞侵袭力抑制试验;裸鼠体内肿瘤生长,病理学及电镜扫描的观测.结果PTEN基因转染后QBC939细胞稳定表达,阳性表达率升高（P＜0.05）;肿瘤细胞活性下降（P＜0.05）,细胞周期G1～S期抑制,细胞凋亡率增加（P＜0.01）;透射电镜细胞较成熟、分化好;细胞侵袭力明显抑制（P＜0.05）;裸鼠体内肿瘤未转染组生长早,加入奥沙利铂后生长受抑制（P＜0.05）,病理证实为腺癌.结论1.脂质体成功将PTEN基因转染人胆管癌QBC939细胞,并稳定表达.2.PTEN基因转染后细胞生长速度无明显变化;MTT实验活性细胞数有所下降.3.转PTEN基因后的胆管癌细胞超微结构变化显示线粒体增多,细胞较成熟、分化好;流式细胞议分析,细胞周期G1期被抑制,细胞凋亡多,侵袭力受到抑制;4.接种转PTEN基因裸鼠的体内成瘤显著抑制;6.转基因的生物治疗联合奥沙利铂（L-OHP）对人胆管癌细胞生长具有显著的抑制作用.     

磁靶纳米化疗药物治疗胆管癌移植瘤的对比研究

目的: 比较纳米磁靶向性药囊与其他化疗药物治疗裸鼠人胆管癌移植瘤的效果并探讨其机制。方法:以在体外培养的人胆管癌细胞QBC939接种裸鼠。20d后将裸鼠随机分为4组（每组8只）：生理盐水对照组（A组），5-FU治疗组（B组），纳米磁靶向性药囊＋内磁化支架治疗组（C组），健择治疗组（D组）。记录各组各时段肿瘤体积变化和抑瘤率，绘制肿瘤生长曲线。于治疗后35d处死裸鼠，取肿瘤组织观察超微结构改变。结果:A,B,C,D组于治疗后35d肿瘤体积分别为（2 256.1±267.1）mm3，(2 096.5±237.9) mm3，（1 392.2±189）mm3，（1 534.9±115）mm3，其中C,D组与A,B组之间的肿瘤体积比较有明显差异（P<0.05）。B,C,D组抑瘤率为7.4%, 39.6%和33%。电境观察C组和D组均有凋亡细胞出现。结论:同等剂量下，纳米磁靶向性药囊治疗效果优于5-FU，但与健择无明显差异。     

阿托伐他汀对人胆管癌QBC939细胞系增殖及侵袭的影响

目的 探讨阿托伐他汀(ATV)对人胆管癌QBC939细胞系增殖、侵袭的影响及其可能作用机制方法 应用细胞培养技术培养QBC939细胞,经不同浓度的阿托伐他汀处理后,以MTF法检测阿托伐他汀对QBC939细胞的杀伤抑制率,以Matrigel侵袭实验、迁移实验和半定量RT-PCR检测阿托伐他汀对QBC939细胞的侵袭、运动能力和对细胞内RhoC,MMP-9,p27 mRNA表达的影响情况.结果 阿托伐他汀可明显抑制QBC939细胞的生长及增殖,且其抑制作用呈剂量-时间效应关系:IC50为25 μmoL/L,最强抑制作用时间为48h.Matrigel侵袭实验及迁移实验显示,经10 μmol/L,25 μmol/L,50 μmoL/L药物干预48h后的QBC939细胞,随着浓度的增加,其体外侵袭、运动能力明显减弱(P＜0.05);半定量RT-PCR测定显示,阿托伐他汀作用48h后,QBC939细胞中p27表达含量明显增高、MMP-9的表达降低,而RhoC的表达改变并不明显.结论 阿托伐他汀可抑制人胆管癌QBC939细胞的生长增殖,并减弱其体外侵袭、运动能力.     

光动力治疗人胆管癌细胞荷瘤裸鼠的实验研究

目的研究光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)对人胆管癌荷瘤裸鼠的治疗效果,探讨其抗肿瘤性、安全性及腹腔注射和瘤内注射光敏剂两种不同给药途径疗效的差异。方法人胆管癌细胞QBC939接种于Balb/c裸小鼠皮下,建立荷瘤动物模型。以血卟啉衍生物(HpD)作光敏剂,采用腹腔内和瘤内注射2种不同给药方式,后以波长630 nm的激光照射肿瘤组织,观察PDT后肿瘤体积变化和病理改变。结果接受光动力治疗的两组肿瘤生长速度明显减慢,瘤内局部注射给药组疗效与腹腔给药组差异无统计学意义(P>0.05);组织学检查见肿瘤组织有广泛坏死,各组裸鼠心、肝、肺、肾组织切片未见病理性结构改变。结论HpD,PDT对人胆管癌荷瘤裸鼠的肿瘤组织有杀伤作用,使肿瘤生长减慢;HpD-PDT杀伤胆管癌移植瘤的深度可达0.8cm;在本实验光照条件下的PDT治疗是安全的。     

rhNIS基因转导胆管癌细胞介导125I摄取的研究

目的：探讨人钠/碘同向转运体(hNIS)基因cDNA转导至胆管癌细胞系QBC939细胞后的表达水平及其对介导125I摄取的影响。方法：将扩增出的hNIS基因cDNA序列克隆至pMD18-T载体;筛选后的亚克隆hNIS编码至真核表达型载体PDC316中,经脂质体途径导入胆管癌细胞（QBC939）,建立新细胞系(QBC939-A) 。同时设立空质粒(QBC939-B)转染和空白(QBC939-C)对照组。在体外培养条件下采用半定量RT-PCR检测各组2,3,6 d细胞内hNIS-mRNA表达水平和1,2,3,6 d的125I摄取情况。结果：建立了能稳定表达hNIS基因的新型细胞系QBC939-A。hNIS-mRNA表达水平检测显示,QBC939-A于3 d表达量达高峰,与QBC939-B和QBC939-C比较,有显著性差异（P<0.05）。且QBC939-A细胞的摄碘能力在转染后3 d达高峰,较QBC939-C高14倍,较QBC939-B高16倍。结论：rhNIS基因转导至胆管癌细胞足以在短期内介导125I的摄取,为介导125I靶向治疗胆管癌的研究奠定了基础。     

纳米磁小体靶向药囊治疗人胆管癌细胞株移植瘤实验研究

目的:将纳米磁小体靶向药囊(TM5-FUNC)经尾静脉注射入胆管癌荷瘤裸鼠体内,通过埋植在移植瘤内的磁化支架所产生的磁靶向引导作用,TM5-FUNC选择性地聚集于裸鼠胆管癌移植瘤组织内;探讨此装置对人胆管癌的生长抑制作用。方法:建立人胆管癌裸鼠移植瘤模型,将裸鼠随机分成6组,通过尾静脉按分组方案给药,分别将TM5-FUNC 250mg/kg、200mg/kg和150mg/kg组列为高、中、低剂量组。计算各组裸鼠肿瘤体积、抑瘤率和肿瘤生长曲线。处死裸鼠后,将肿瘤标本置电镜下观察肿瘤组织超微结构改变情况。结果:结合内置支架的TM5-FUNC高、中剂量组的移植肿瘤体积在治疗后35d与对照组比较有显著差异(P<0.05);TM5-FUNC低剂量组的肿瘤体积与对照组比较则无明显差异(P>0.05)。其肿瘤的抑制率分别为:高剂量组39.6%、中剂量组14.6%、低剂量组7.9%。从高、中、低剂量TM5-FUNC干预组中可见,随着药物浓度的增高,肿瘤生长越缓,高剂量组肿瘤生长曲线变化最为缓慢,中剂量组次之,其余组曲线变化较为一致。电镜结果显示,TM5-FUNC对荷瘤裸鼠的肿瘤细胞有诱导凋亡作用,且随着药物浓度的增大,细胞凋亡的形态改变越为明显。结论:本课题组所研制的TM5-FUNC新剂型,在内磁场的导向作用下,能有效抑制人胆管癌裸鼠移植瘤的生长。     

γ-氨基丁酸对人胆管癌细胞株QBC939增殖和侵袭的影响

目的 观察抑制性神经递质γ-氨基丁酸(GABA)对人胆管癌细胞株QBC939生物学行为的影响.方法 采用MTF比色法观察GABA对人系胆管癌细胞QBC939增殖的作用,PCR-ELISA法观察其对QBC939细胞端粒酶活性的影响,Transwell小室分析GABA对胆管癌细胞侵袭能力的影响,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、明胶酶谱法分析GABA对QBC939细胞分泌的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)mRNA和酶活性的影响,数据采用单因素方差分析和Dunnett法处理.结果 GABA对人胆管癌细胞QBC939的增殖有抑制作用(抑制率由2.6%增至26.8%,P＜0.05);抑制癌细胞中端粒酶的活性(0.82±0.05)vs.(0.56±0.05)(P＜0.05);抑制胆管癌细胞穿透Matrigel胶的能力(在100 μmol/L浓度的GABA作用下,穿透细胞数由(60±10)个降至(43±4)个(P＜0.05),同时胆管癌细胞分泌的基质蛋白酶MMP-2和MMP-9的mRNA和活性下降,这三种效应均成浓度依赖性.结论 GABA抑制胆管癌细胞QBC939的生长并减弱侵袭转移能力,其机制可能与其抑制端粒酶活性和基质蛋白酶MMP-2和MMP-9的分泌和活性有关.     

caspase-3在纳米磁药物靶向治疗胆管移植瘤组织中的表达

目的探讨纳米磁药物靶向治疗胆管移植瘤组织中凋亡相关基因caspase-3的表达。方法建立荷人胆管癌裸鼠模型，随机分为空白对照组、纳米磁药物组（药物浓度为250mg／kg）、纳米磁药物靶向A组（药物浓度为150mg／kg）和纳米磁药物靶向B组（药物浓度为250mg／kg）；取冶疗后第21d的各组肿瘤组织用免疫组化及RT—PCR法测量其中caspase-3的蛋白及mRNA表达量并进行分析。结果纳米磁药物靶向B组中caspase-3的表达量最高，其次依次为纳米磁药物靶向A组、纳米磁药物组，空白对照组几乎没有caspase-3蛋白及mRNA的表达，且各组间差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论磁靶向治疗肿瘤后能引起更多凋亡相关基因caspase-3表达，并且随纳米磁药物剂量增加，caspase-3表达增多。