少突胶质前体细胞移植对早产儿脑白质损伤的保护作用

脑白质损伤是早产儿最常见的脑损伤形式,以少突胶质前体细胞（OPCs）损伤所造成的髓鞘脱失为特点。脑白质损伤后由于缺乏有效的治疗措施,幸存的患儿多遗留神经系统后遗症。细胞移植是近年来发现的对治疗白质损伤具有应用潜力的措施,目前细胞移植研究中常用的细胞是OPCs。OPCs兼有迁移和髓鞘化能力,是移植治疗最佳的种子细胞。研究发现OPCs移植不仅替代受损的细胞重建白质结构和功能,还能抑制神经元的凋亡,促进内源性神经干细胞的增殖,并促进血脑屏障的修复。但OPCs移植的临床应用还面临许多挑战,如有效性及致瘤风险、免疫排斥等安全性问题。该文就髓鞘发育、OPCs的获取、治疗机制及应用等方面做一综述,并分析了目前OPCs移植的挑战,以期为早产儿脑白质损伤的临床治疗提供新导向。     

少突胶质前体细胞移植治疗早产儿脑白质损伤大鼠模型

目的探讨少突胶质前体细胞(OPCs)移植对治疗早产儿脑白质损伤(WMI)模型大鼠的长期作用。方法将80只3日龄Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组、模型对照组、5 d脑室/白质移植组、9 d脑室/白质移植组、14 d脑室/白质移植组(n=10);除假手术组外其余各组行右侧颈总动脉离断并缺氧80 min制备早产儿WMI模型;采用孕10~12周人胚胎脑组织制备OPCs。各移植组分别在造模后5 d、9 d和14 d将3×105OPCs注入右侧脑室/脑白质中,待大鼠60日龄和90日龄时分别对各组行电镜下脑髓鞘评估和神经功能评估。结果电镜下,大鼠60日龄时各移植组髓鞘损害程度相比模型组略有改善;无论是与同组60日龄大鼠还是与同日龄模型组大鼠比较,90日龄时各移植组的髓鞘均明显增厚,结构破坏更少,其中14 d移植组变化最为明显;但不同移植时间脑室和白质移植组间的髓鞘损害程度未见有明显差异。60及90日龄各移植组大鼠的神经功能缺陷评分(m NSS)均高于假手术组,但均低于模型组(P0.05)。结论 OPCs移植可能对治疗早产儿WMI存在长期效应,延迟移植时间可能增强疗效。     

适于人源少突胶质前体细胞长期体外扩增的较经济的培养方法

目的 细胞替代治疗是髓鞘化障碍疾病的可能有效的治疗方法.而细胞替代治疗必须具有相应的体外培养少突胶质前体细胞的方法.因此,本研究为了提供临床治疗所需的细胞,发展出了一种简单、经济且高效的获得人源少突胶质前体细胞(OPCs)的方法,为临床治疗提供了新的方法.方法 通过磁珠分选的方法得到人源OPCs,将其接种到OPCs增殖培养基中,观察短期(2、4、6、8d)和长期体外培养中OPCs的形态,免疫荧光染色鉴定第4代细胞OPCs特异标志O4、转录因子Sox10和血小板源性生长因子α受体(PDGFαR)的表达情况及诱导后分化为少突细胞的能力,同时观察B27和N1对OPCs生长状态的影响.结果 短期培养时,OPCs具有典型的双极或是三极形态且增殖状况良好.经过4代的长期培养,4代细胞均具有典型双极或三极形态;第4代OPCs免疫荧光染色鉴定90％以上细胞表达OPCs特异标志O4、Sox10和PDGFαR,诱导后,可以分化为少突胶质细胞.可见经过4代的长期培养,OPCs仍保持着初始性状且具有分化为少突细胞的能力并且仍然保持着较高纯度,表明该培养基适合人源OPCs长期培养.结论 使用该培养方法,分离得到的人源OPCs在体外不仅能够稳定培养和扩增,还具有分化为少突细胞的能力.通过这种可重复的方法,可以在体外尽可能简单的稳定获得大量高纯度人源OPCs,为临床应用提供了新的选择.且该方法使用较少的细胞因子,因此为髓鞘化障碍或髓鞘损伤疾病将来的细胞治疗,提供了一种适用于临床的OPCs的稳定高效的较经济的培养方法.     

SD大鼠少突胶质前体细胞系的分离、培养及鉴定

目的获取高纯度的少突胶质前体细胞系,并作鉴定。方法根据星形胶质细胞和少突胶质前体细胞系生长时间的差异,细胞黏附特性的不同,利用振荡分离纯化法获得纯化的SD大鼠少突胶质前体细胞,再用添加了神经营养因子(N2)、血小板衍生生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的无血清培养基传代培养。免疫荧光法对表面抗原进行细胞鉴定。结果获得纯度95%以上少突胶质前体细胞,少突胶质祖细胞A2B5、O4抗体阳性;未成熟少突胶质细胞O4、O1阳性;胶质细丝酸性蛋白(GFAP)均为阴性。结论通过振荡分离纯化法及结合少突胶质细胞定向培养基是培养少突胶质前体细胞的可靠方法;N2、PDGF、bFGF的添加可显著提高细胞产量,并使细胞保持在未成熟阶段。     

线粒体功能障碍与早产儿脑白质损伤的研究进展

早产儿脑白质损伤病因复杂,可导致长期的神经认知行为缺陷,目前尚无特效的治疗手段。越来越多的研究表明,线粒体功能障碍在早产儿脑白质损伤发病过程中起重要作用,可能是脑白质发育障碍的常见亚细胞机制,涉及氧化应激、ATP合成减少、钙稳态失衡。文章将对线粒体在脑神经发育过程中的作用和造成其功能障碍的机制作一综述,希望能够通过保护线粒体功能对早产儿脑白质损伤进行及早干预,为改善存活早产儿神经发育结局提供参考。     

NgR在新生大鼠少突胶质前体细胞系的表达和缺氧缺血后变化的意义

目的：观察NgR在新生大鼠少突胶质前体细胞系（OLPs）的表达和细胞定位，以及缺氧缺血（OGD）损伤后的表达变化，探讨其在OLPs损伤后再生抑制中的作用。方法：采用改良振荡分离纯化法体外培养OLPs，采用其特异性抗体A2B5、O4和O1作细胞鉴定；用NgR抗体检测其在OLPs表达。用含连二亚硫酸钠的无糖培养基制作OLPs OGD模型，MTT法检测各组细胞存活率；用免疫荧光法和免疫印迹法观察NgR在细胞OGD后的变化。结果：OLPs在分离纯化培养后的第1，2和4天均表达NgR，阳性表达位于胞体及突起；细胞OGD后10 min，NgR表达出现增强，30 min后明显升高，与对照组比较差异具有显著性（均P﹤0.05）；MTT结果显示，OGD 30 min，细胞存活率较对照组显著降低（P﹤0.05）。结论：OLPs胞体及突起上均表达NgR；OGD后NgR表达明显增强，细胞存活率显著降低，提示NgR可能参与OGD后OLPs的再生抑制过程。［中国当代儿科杂志，2007，9（5）：445-448］     

缺氧缺血未成熟新生鼠脑少突胶质细胞髓鞘化障碍致脑白质损伤的作用

目的观察缺氧缺血(HI)新生大鼠脑白质损伤时少突胶质细胞(OLs)的作用。方法将48只出生3 d的清洁级SD大鼠分为实验组和对照组。实验组大鼠分离右侧颈总动脉、结扎离断,缺氧处理;对照组大鼠分离右侧颈总动脉,不结扎离断,也不进行缺氧处理。术后3 d、7 d、14 d心脏灌注后取其脑组织,各时间点实验组与对照组分别标记为A1/A2,B1/B2,C1/C2。处死大鼠的前24 h腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu),每4 h 1次,连续注射3次。脑组织经固定、脱水处理后冷冻切片。对脑组织切片进行焦油紫(CV)染色,评估脑白质损伤情况。行神经元-神经胶质2型抗原(NG-2)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、Brdu、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)的免疫组织化学染色,观察缺氧缺血性脑损伤新生大鼠OLs的作用。结果 1.CV染色显示脑面积比率:A1组损伤侧与损伤对侧脑面积比率为0.900±0.059、A2组左侧与右侧脑面积比率为0.970±0.015、B1组损伤侧与损伤对侧脑面积比率为0.870±0.039、B2组左侧与右侧脑面积比率为0.920±0.024、C1组损伤侧与损伤对侧脑面积比率为0.730±0.096、C2组左侧与右侧脑面积比率为0.920±0.039,实验组和对照组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。胼胝体面积比率:A1组损伤侧与损伤对侧胼胝体面积比率(0.870±0.028)和A2组左侧与右侧胼胝体面积比率(0.910±0.033)比较差异有统计学意义(P=0.049)。B1组损伤侧与损伤对侧胼胝体面积比率(0.92±0.030)和B2组左侧与右侧胼胝体面积比率(0.92±0.025),C1组损伤侧与损伤对侧胼胝体面积比率(0.83±0.130)和C2组左侧与右侧胼胝体面积比率(0.85±0.076)比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。2.MBP染色:阳性面积占整个胼胝体的比率:B1组损伤侧和损伤对侧为0.32±0.17、0.39±0.20;B2组左右两侧阳性面积占整个胼胝体面积比率为0.51±0.11;C1组损伤侧和损伤对侧为0.71±0.07、0.90±0.10;C2组左右两侧阳性面积占整个胼胝体面积比率为0.88±0.13,各个时间点实验组损伤侧和损伤对侧、实验组和对照组间比较差异均有统计学意义(Pa<0.05)。3.NG-2染色:每高倍镜下阳性细胞数:A1组损伤侧和损伤对侧为23.56±2.93、18.11±3.19;A2组左右两侧20.17±2.38;B1组损伤侧和损伤对侧为27.29±4.81、22.88±5.31;B2组左右两侧20.81±3.24;C1组损伤侧和损伤对侧为22.29±4.27、16.04±4.17;C2组左右两侧14.07±3.29。各个时间点实验组损伤侧和损伤对侧、实验组和对照组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。4.Caspase-3染色:每高倍镜下阳性细胞数:A1组损伤侧和损伤对侧为68.67±6.60、60.04±5.66;A2组两侧40.21±7.93;B1组损伤侧和损伤对侧为59.13±10.22、50.38±11.58;B2组两侧为48.17±4.27;C1组损伤侧和损伤对侧为70.13±16.11、57.00±15.43;C2组两侧62.42±13.56。各个时间点实验组损伤侧和损伤对侧、术后3 d、7 d实验组和对照组间差异均有统计学意义(Pa<0.05)。5.Brdu染色:每高倍镜下阳性细胞数:A1组损伤侧和损伤对侧为149.58±21.12、126.92±7.23;A2组两侧为120.33±7.18;B1组损伤侧和损伤对侧为89.04±20.42、79.79±16.77;B2组两侧为85.83±6.05;C1组损伤侧和损伤对侧为60.08±10.89、53.25±8.02;C2组两侧为50.08±4.78。术后3 d、7 d实验组损伤侧和损伤对侧、实验组和对照组间比较差异均有统计学意义(Pa<0.05)。结论 HI可引起OLs成熟、髓鞘形成障碍,导致脑的低髓鞘化,从而引起脑白质损伤;OLs是缺氧缺血性脑损伤的靶细胞。     

脑缺氧缺血时少突胶质细胞损伤的机制

缺氧缺血是造成新生儿脑白质损害的常见原因 ,与脑瘫、智力低下等神经功能障碍密切相关。少突胶质细胞是脑白质的重要成分 ,故研究少突胶质细胞对缺氧缺血性损伤机制及其防治对策具有重要的临床意义。　　一、少突胶质细胞少突胶质细胞是中枢神经系统髓鞘形成细胞 ,它包绕神经纤维轴突而形成髓鞘 ,对轴突正常快速电传导等功能起重要作用。少突胶质细胞的前体细胞主要来源于前脑脑室下区 (SVZ) [1] 。依据抗原表达、形态和功能 ,少突胶质细胞系可分为先祖细胞、早期少突胶质祖细胞、晚期少突胶质祖细胞、未成熟少突胶质细胞、成熟少突胶质…     

细菌脂多糖诱导活性小胶质细胞对少突胶质前体毒性作用的体内研究

目的 探讨细菌脂多糖(LPS)诱导活性小胶质细胞(MG)激活对少突胶质前体(preOLs)毒性作用.方法 2日龄SD大鼠随机分为假手术组和脑室周围白质软化(PVL)模型组,每组24只.脑立体定位仪下对PVL组新生大鼠经脑室注人LPS 1μg/g,建立感染型PVL新生大鼠动物模型;对假手术组新生大鼠经脑室注入相同体积的无菌PBS.于造模后第5天处死取脑,分别进行光镜下脑白质病理评估、硝酸还原法检测NO含量、还原比色法检测O-2含量、免疫组织化学染色检测过氧亚硝酸盐(ONOO-)含量以及OL前体的存活率.结果 与假手术组相比,LPS诱导可引起新生大鼠的脑白质严重损伤(Z=7.498,P=0.000),脑内O-2含量(42.822±3.600比187.717±8.566,t=26.907,P=0.000)明显增加,NO含量[(1.097±0.079)μmol/gprot比(2.878±0.183)μmol/gprot,t=34.728,P=0.000]、ONOO-含量[(0.000±0.000)%比(11.000±1.732)%]均显著增加,脑白质内O4阳性OL前体[(11.513±0.775)%比(3.353±0.442)%,t=16.013,P=0.000]大量减少.结论 从体内确认LPs诱导OL前体的死亡通路,是通过LPS诱导MG激活,促使生成大量NO、O-2和ONOO-,作用于OL前体,导致OL前体的死亡.     

脑源性神经营养因子与早产儿脑白质损伤中少突胶质细胞的关系

早产儿脑损伤以脑室周围白质损伤及其髓鞘化障碍为特征,脑室周围白质损伤主要形式为脑室周围白质软化(periventricular leukolamacia,PVL),且主要是未成熟少突胶质细胞的消耗导致PVL.未成熟少突胶质细胞成熟、成髓鞘过程对于早产儿脑白质损伤的预后有重要影响.脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是脑中含量最丰富的神经营养因子,在脑中分布广泛.BDNF主要通过与特异性受体酪氨酸激酶B结合起作用,影响少突胶质细胞的发生及成髓鞘过程.该文主要讨论BDNF与早产儿缺氧缺血脑白质损伤中少突胶质细胞关系的研究进展.     

早产儿脑白质损伤大鼠模型海马组织差异多肽谱分析

目的 观察早产儿脑白质损伤大鼠模型海马组织多肽谱差异表达,探索早产儿脑白质损伤机制。方法 将20只新生Sprague-Dawley大鼠随机分为对照组和模型组（n=10）。模型组幼鼠在生后2 d行右侧颈总动脉永久结扎术,术后缺氧2 h;假手术组幼鼠分离右侧颈总动脉,但不行结扎和缺氧。采集两组大鼠脑组织标本并分离海马组织,采用液相色谱串联质谱联合串联质谱标记法检测两组大鼠海马组织多肽谱,将两组中差异表达多肽进行生物信息学分析,推断其在神经系统发育和功能中的作用。结果 共鉴定并量化4 164条多肽,其中262条多肽存在差异表达（倍数变化绝对值≥ 2.5）,164条多肽表达上调,98条多肽表达下调。前体蛋白ELN、PCLO、MYO15a、MAP4和MAP1b的差异表达多肽最多,可能在早产儿脑白质损伤的发病机制中具有重要意义。早产儿脑白质损伤模型大鼠的海马区CDK5信号通路被激活。结论 MAP1b等前体蛋白的差异表达多肽可能是早产儿脑白质损伤过程中参与神经系统发育和功能的关键生物活性多肽,CDK5信号通路激活可能与早产儿脑白质损伤有关。     

瘦素对早产儿脑白质损伤模型大鼠远期空间记忆能力的影响

目的通过观察瘦素对早产儿脑白质损伤模型大鼠空间记忆的影响,探索其神经保护作用。方法将80只新生大鼠随机分为假手术组(n=27)、模型组(n=27)和瘦素干预组(n=26),模型组和瘦素干预组大鼠制备早产儿脑白质损伤模型,瘦素干预组于造模后立即给予生理盐水稀释的瘦素(100 μg/kg),连续4 d。观察各组大鼠存活情况并监测体重变化,21日龄后通过Morris水迷宫实验观察各组大鼠空间记忆能力。结果各组新生大鼠存活率比较差异无统计学意义(P0.05)。至生后10 d内,瘦素干预组大鼠体重接近假手术组,但低于模型组(P0.05);10 d后瘦素干预组生长速度加快,体重超过模型组和假手术组,但差异无统计学意义(P0.05)。定位航行训练结果显示:实验第2天开始,各组平台潜伏期比较差异有统计学意义(P0.05);从第4天开始,瘦素干预组平台潜伏期接近假手术组,短于模型组(P0.05)。空间搜索实验结果显示:与假手术组比较,模型组穿越平台次数减少,平台潜伏期延长(P0.05);与模型组比较,瘦素干预组穿越平台次数增加,平台潜伏期缩短(P0.05),且与假手术组比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论瘦素干预可以减轻早产儿脑白质损伤的空间记忆障碍,对早产儿脑损伤具有神经保护作用,值得进一步研究。     

新生期缺氧缺血性脑白质损伤大鼠模型比较研究

目的 探讨3种不同方式建立的新生期缺氧缺血性脑白质损伤大鼠模型的异同,为深入研究早产儿脑白质损伤选择理想的动物模型提供理论基础.方法 对3日龄Wistar大鼠采用3种不同的缺氧缺血方法建立脑白质损伤模型,分别为:左侧颈总动脉结扎伴低氧(6％O2) 30 min、左侧颈总动脉结扎伴低氧(6％O2)4 h和双侧颈总动脉结扎伴低氧(8％O2)30min.比较各组大鼠脑病理形态学变化、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)免疫组织化学染色以及眼部变化.结果 左侧颈总动脉结扎伴低氧(6％O2)30min侧脑室周围白质组织结构稀疏模糊但无坏死灶;左侧脑室周围白质区GFAP免疫染色强度[(5 021.63 ±358.92) OD]增加程度最低(P ＜0.000 1),MBP免疫染色强度[(18488.63 ±1 822.62) OD]降低程度最低(P＜0.000 1);左侧睁眼时间延迟.左侧颈总动脉结扎伴低氧(6％O2)4 h侧脑室周围白质区可见坏死灶;GFAP免疫染色强度为[(6 069.13 ±458.61) OD],MBP免疫染色强度为[(15003.38 ±1 559.11) OD];左侧睁眼时间延迟.双侧颈总动脉结扎伴低氧(8％O2)30 min双侧脑室周围白质区见囊性坏死灶;左侧GFAP 免疫染色强度[(6 194.50 ±432.69) OD]增加程度最高(P ＜0.000 1),MBP免疫染色强度[(10119.35±735.16) OD]降低程度最显著(P＜0.000 1);双侧睁眼时间延迟且双眼出现白内障改变.结论 左侧颈总动脉结扎伴低氧30 min方法更适宜轻型脑白质损伤研究;左侧颈总动脉结扎伴低氧(6％O2)4 h及 双侧颈总动脉结扎伴低氧(8％O2) 30 min更适于严重的脑室周围白质软化病例研究.     

骨髓基质细胞脑内移植对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑白质的保护作用

目的：探讨骨髓基质细胞 (BMSCs)脑内移植对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑白质损伤的保护作用。方法：34只7日龄新生SD大鼠，随机分为正常对照组（n＝10）、HIBD组（n＝12）和移植组（n＝12），后两组大鼠结扎左颈总动脉后低氧暴露2 h制作HIBD模型，移植组大鼠在HIBD后24 h在大鼠脑立体定位仪下，将体外培养3~5代的SD大鼠BMSCs用Hochest 33324标记24 h后脑内移植于左侧海马。日龄45 d时处死大鼠，用荧光显微镜观察BMSCs在脑内的存活及BMSCs的O4的阳性表达。行髓鞘碱性蛋白（MBP）检测左侧胼胝体和皮质下白质MBP表达，行O4免疫组织化学检测左侧侧脑室周围和皮质下白质O4的表达。结果：BMSCs移植后37 d，移植部位及左侧皮层区（损伤侧）均可见到胞核蓝色的BMSCs，移植细胞表达O4的阳性率为（3.70±1.09）%。HIBD组左侧（损伤侧）胼胝体和皮质下白质MBP染色变浅，有不同程度的髓鞘脱失改变，左侧侧脑室周围和皮质下白质O4阳性细胞数较对照组明显减少，差异均有显著意义（P<0.01）。移植组胼胝体和皮质下白质MBP染色较深，部分有髓鞘脱失改变，相同部位O4阳性细胞数较对照组稍减少，比HIBD组明显增加，其差异有显著意义（P＜0.01）。结论：BMSCs脑内移植对HIBD新生大鼠脑白质损伤具有保护作用。     

17β-雌二醇抑制高氧所致少突前体细胞凋亡

目的探讨高氧及配对免疫球蛋白样受体B(Pir B)对大鼠体外少突前体细胞(OPCs)的影响,以及17β雌二醇(E2)的保护作用。方法用逆转录定量酶联反应(RT-q PCR)检测OPCs的Pir B m RNA和蛋白表达,用si RNA沉默OPCs的Pir B,高氧刺激后再用E2处理,通过3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)比色法和流式细胞术测定OPCs细胞存活率和凋亡率。结果高氧导致OPCs凋亡增加和活性降低,E2能够明显下调Pir B的表达,E2处理或沉默Pir B能够明显减少高氧所致的OPCs凋亡、增加细胞存活率。结论高氧导致OPCs的凋亡,而E2能够保护高氧所致的OPCs凋亡。     

先天性心脏病脑白质损伤研究进展

先天性心脏病(congenital heart disease,CHD)是最常见的出生缺陷疾病.近年来,随着心脏外科技术的显著提升,复杂性CHD新生儿和婴幼儿的生存率已经明显提高.然而,神经性后遗症仍然常见并且高达25％ ～55％.CHD术后大脑损伤最主要的是白质(white matter,WM)损伤.研究表明,以脑室周围WM软化病为特点的WM损伤常见于CHD婴幼儿尤其是心脏外科术后.既往人们认为这是由于术中体外循环和外科手术操作引起.然而,随着外科手术、医疗诊断技术的不断进步和基础研究的不断深入,人们发现CHD患儿WM损伤是术前、术中、术后多重因素综合作用的结果.这些患儿生长发育后期出现的运动障碍、注意力和学习等方面的缺陷给家庭和社会带来巨大经济负担,降低了人口素质.因此,探究CHD患儿WM损伤的原因、机制和防治方法成为近年CHD脑损伤研究热点,也可能成为未来进一步显著改善CHD患几神经发育损伤的重要研究方向.