发酵红参总皂苷对高糖诱导大鼠肾小管上皮细胞间充质转化的抑制作用及其机制

目的 探讨发酵红参总皂苷（FRGTS）对高糖诱导下肾小管上皮细胞发生上皮细胞-间充质转化（EMT）的抑制作用,并阐明其作用机制。 方法 将大鼠肾小管上皮NRK-52E细胞分为正常对照组（5.5 mmol·L^－1 D-葡萄糖）、高糖组（30.0 mmol·L^－1 D-葡萄糖）、沉默信息调节因子1（SIRT1）抑制剂EX527组（30.0 mmol·L^－1 D-葡萄糖＋10.0 μmol·L^－1.EX527）、FRGTS组（30.0 mmol·L^－1 D-葡萄糖＋25 mg·L^－1FRGTS）和EX527+FRGTS组（30.0 mmol·L^－1 D-葡萄糖＋10 μmol·L^－1 EX527＋25 mg·L^－1FRGTS）。采用免疫荧光法检测各组细胞中E-钙黏蛋白（E-cadherin）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）蛋白表达水平,实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各组细胞中E-cadherin、α-SMA和SIRT1 mRNA表达水平,ELISA法检测培养上清液中Ⅰ型胶原（ColⅠ）水平,Western blotting 法检测各组细胞中SIRT1、转化生长因子β1（TGF-β1）和Smad3 蛋白表达水平。 结果 高糖培养48 h后,与正常对照组比较,高糖组NRK-52E细胞中E-cadherin 蛋白表达水平和mRNA表达水平降低（P<0.01）,α-SMA 蛋白表达水平和mRNA表达水平升高（P<0.01）,NRK-52E细胞上清液中ColⅠ水平升高（P<0.01）,SIRT1 mRNA和蛋白表达水平均明显降低（P<0.01）,TGF-β1和Smad3蛋白表达水平升高（P<0.01）;与高糖组比较,FRGTS组NRK-52E细胞中E-cadherin mRNA表达水平升高（P<0.01）,α-SMA mRNA表达水平降低（P<0.05）,NRK-52E细胞上清液中ColⅠ水平降低（P<0.05）,SIRT1 mRNA和蛋白表达水平均升高（P<0.05或P<0.01）,TGF-β1和Smad3蛋白表达水平降低（P<0.05或P<0.01）;与FRGTS组比较,EX527+FRGTS组NRK-52E细胞中E-cadherin mRNA表达水平明显降低（P<0.01）,α-SMA mRNA表达水平明显升高（P<0.05）,NRK-52E细胞上清液中ColⅠ水平升高（P<0.05）,SIRT1 mRNA和蛋白表达水平明显降低（P<0.01）,TGF-β1和Smad3蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。 结论 FRGTS可通过上调SIRT1表达,进而抑制TGF-β1/Smad信号通路,有效抑制肾小管上皮细胞发生EMT。     

间歇性高糖对大鼠肾小管上皮细胞NRK-52EA转分化的影响

目的:探讨间歇性高糖诱导大鼠肾小管上皮细胞株NRK-52EA转分化干预作用。方法:NRK-52E细胞分为空白组、正常葡萄糖组、高糖组、间歇性高糖组,分别作用72 h后,Western blot检测转化生长因子β1(TGF-β1)、Ⅰ型胶原、金属蛋白酶-2(MMP-2)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)以及甲状旁腺素相关肽(PTHrP)的表达;CM2H2DCFDA试剂盒检测活性氧(ROS)含量。结果:高糖组及间歇性高糖组NRK-52E细胞TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α-SMA以及PTHrP表达均上调;间歇性高糖组TGF-β1、MMP2以及α-SMA表达水平较高糖组高(P均<0.05),其ROS含量也显著高于高糖组(P<0.01)。结论:间歇性高糖能通过氧化应激诱导肾小管导管上皮细胞表达TGF-β1、MMP2,并促进NRK-52EA细胞转分化为α-SMA细胞。     

TGF-β1/Smad2通路参与IL-17诱导的A549细胞上皮-间质转化

目的:探讨白细胞介素(IL)-17对A549细胞上皮-间质转化的影响及TGF-β1/Smad2信号通路在其中的作用。方法:用不同浓度(0,10,25,50,100ng/ml)IL-17刺激A549细胞48h,RT-PCR检测E-钙黏蛋白(E-cad)、α-平滑肌肌动蛋白(SMA)、TGF-β1的表达。将体外培养的细胞分为3组:对照组、IL-17(100ng/ml)组、IL-17+SB431542组。48h后收集各组细胞,RT-PCR和Western Blot检测E-cad、α-SMA、TGF-β1、Smad2、和p-Smad2的表达。结果:不同浓度的IL-17作用后,E-cad在50ng/ml IL-17组时表达下调,与浓度呈负相关;α-SMA在100ng/ml IL-17组时表达上调;TGF-β1在25ng/ml IL-17组时表达上调,与浓度呈正相关。与对照组相比,IL-17组E-cad表达下调,α-SMA、TGF-β1、p-Smad2表达均增加,Smad2蛋白表达水平无明显变化;与IL-17组比较,IL-17+SB431542组Smad2蛋白表达水平无明显变化,TGF-β1、p-Smad2、α-SMA蛋白表达均降低,E-cad的表达明显增加。结论:TGF-β1/Smad2通路参与IL-17诱导的A549细胞上皮-间质转化。     

地塞米松对马兜铃酸诱导的人肾小管上皮-间充质转化的作用及可能机制

目的探讨地塞米松(Dex)对马兜铃酸诱导的肾小管上皮-间充质转化(EMT)的影响及可能机制。方法体外培养的人肾小管上皮细胞(HKC)分为阴性对照组、马兜铃酸(AA,10μg/ml)作用组、Dex(100μmol/L)作用组、AA(10μg/ml)+无水乙醇(100μmol/L)组、AA(10μg/ml)+Dex(100、10、1、0.1、0.01μmol/L)共同作用组,培养细胞48h,应用激光共聚焦显微镜(CFMS)观察α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E-钙黏素(E-cadherin)的表达,采用Real-timePCR和WesternBlot方法检测α-SMA、E-cadherin、p-Smad3、转化生长因子-β1(TGF-β1)、Smad7mRNA和蛋白的表达。结果 AA作用48h后,CFMS观察发现HKC细胞E-cadherin表达减弱而α-SMA表达增强;地塞米松干预后,E-cadherin表达逐渐增强而α-SMA表达减弱,且呈剂量依赖性。Real-timePCR、WesternBlot结果均显示,与阴性对照组相比,AA组α-SMA、p-Smad3、TGF-β1mRNA和蛋白表达水平均显著增强,E-cadherin、Smad7mRNA和蛋白的表达均减弱(P0.05)。同AA作用组比较,AA+Dex共同作用组随Dex剂量增加,α-SMA、p-Smad3、TGF-β1mRNA和蛋白的表达逐渐减弱,E-cadherin、Smad7mRNA和蛋白的表达逐渐增强(P0.05),而无水乙醇却无此作用。结论 Dex可抑制AA诱导HKC细胞发生EMT,并同时下调EMT过程中TGF-β1和p-Smad3的表达、上调Smad7分子的表达,提示TGF-β1/Smad下调可能是Dex抑制EMT发生的机制之一。     

Smad signal transduction pathway involved in supression of VEGF on TGF-β1 induced EMT of HK-2 cells

目的 探讨血管内皮生长因子(VEGF)抑制转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导HK-2细胞发生肾小管上皮-间充质细胞转化(EMT)的过程中对Smad 2/3,Smad 7信号途径以及SnoN表达的影响.方法 体外培养的HK-2细胞分为:①正常对照组;②TGF-β1(5μgL)阳性对照组;③VEGF165(100μg/L)作用组;④TGF-β1(5 μg/L)+ VEGF165(100 μg/L)共同作用组.采用Western Blot法和RT-PCR分别检测各组细胞p-Smad 2/3和Smad 2/3(共同作用30和60 min),α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Smad 7 、SnoN的表达水平(共同作用48 h).结果 TGF-β1组α-SMA蛋白和mRNA表达与正常对照组比较明显增强,TGF-β1与VEGF165共同作用组α-SMA蛋白和mRNA表达与TGF -β1单独作用组比较明显减弱(P＜0.05).体外HK-2细胞,TGF-β1组刺激30、60 min,与正常对照组比较,(p-Smad 2/3)/(Smad 2/3)比值明显升高,TGF-β1 +VEGF165组与TGF-β1单独作用组相比明显下降,且以30 min时下降明显.TGF-β1组作用48h与正常对照组比较,Smad7蛋白和mRNA表达明显下降,VEGF165+TGF-β1组较TGF-β1单独作用组Smad 7表达明显升高(P＜0.05).VEGF165组与正常对照组相比,α-SMA、(p-Smad 2/3 )/(Smad 2/3)、Smad 7蛋白和mRNA表达的差异无统计学意义(P＞0.05).TGF-β1组SnoN蛋白表达与正常对照组比较明显增强(P＜0.05),TGF-β1与VEGF165共同作用组SnoN蛋白表达与TGF-β1单独作用组相比差异无统计学意义(P＞0.05),各组SnoN mRNA表达差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 VEGF165抑制TGF-β1诱导HK-2细胞EMT的机制可能与直接抑制Smad 2/3磷酸化、上调Smad 7信号表达有关,而与调节SnoN表达无关.     

Lefty-2蛋白对转化生长因子β1诱导的大鼠肾成纤维细胞NRK-49F转分化的逆转作用及其机制

目的观察Lefty-2蛋白对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的肾成纤维细胞(NRK-49F)转分化的逆转作用,并探讨其机制。方法对照组:NRK-49F不做处理;刺激组:加入TGF-β1(10ng/ml);低剂量治疗组:TGF-β1(10ng/ml)+Lefty-2(10ng/ml);中剂量治疗组:TGF-β1(10ng/ml)+Lefty-2(20ng/ml);高剂量治疗组:TGF-β1(10ng/ml)+Lefty-2(50ng/ml)。通过细胞免疫荧光法观察各组α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤连蛋白(FN)和波形蛋白(Vimentin)的表达水平,通过Western blot法检测各组α-SMA、FN、Vimentin、p-Smad3蛋白、Smad7蛋白的表达水平。结果细胞免疫荧光结果显示,刺激组α-SMA、FN、Vimentin表达量均显著增加,治疗组较刺激组表达量均明显减少。Western blot法结果显示,治疗组α-SMA、FN、Vimentin的表达量较刺激组均下降(P<0.01),而且呈现剂量效应。刺激组p-Smad3蛋白表达上调,治疗组p-Smad3蛋白的表达量较刺激组明显下调(P<0.01);刺激组Smad7蛋白表达下调,治疗组Smad7蛋白的表达量较刺激组明显上调(P<0.01)。结论 Lefty-2蛋白可逆转TGF-β1诱导的NRK-49F的转分化,可降低α-SMA、FN、Vimentin的表达,可能是通过活化Smad7信号通路,抑制Smad3的磷酸化,从而抑制Smad3信号通路来实现的。     

TGF-β/Smad/RUNX3信号通路在糖尿病肾病大鼠肾小管上皮细胞EMT过程中的作用

【摘要】 目的 探讨TGF-β/Smad/RUNX3信号通路在糖尿病肾病（DN）大鼠肾小管上皮细胞 间充质转化（EMT）过程中的作用。 方法 将45只Wistar雄性大鼠随机分成三组：对照组、模型组和实验组,每组各15只,实验组和模型组制备DN大鼠模型。按照实验分组进行给药。末次给药后,用血糖仪检测各组大鼠血糖含量,全自动生化分析仪检测各组大鼠24 h尿蛋白、血尿素氮及血肌酐含量,过碘酸希夫（PAS）、天狼星红（SR）染色观察各组大鼠肾脏组织病理变化,酶联免疫吸附测定（ELISA）检测各组大鼠血清白介素1β（IL-1β）、白介素6（IL-6）表达水平,蛋白免疫印迹（Western blot）检测各组大鼠肾脏组织α-SMA、E-cadherin、TGF-β1、Smad3、Smad4、RUNX3蛋白表达情况。 结果 与对照组相比,模型组大鼠肾小管肥大增生,肾间质有炎症细胞浸润现象,肾间质胶原纤维沉积、24 h尿量、24 h尿蛋白、血糖、血尿素氮、血肌酐浓度、血清IL-1β、IL-6表达量、肾脏α-SMA、TGF-β1、Smad3、Smad4蛋白表达显著升高 (P＜0.05),肾脏E-cadherin、RUNX3蛋白表达显著降低 (P＜0.05);与模型组相比,实验组大鼠肾小管肥大减轻,炎症细胞减少,肾间质胶原纤维沉积、24 h尿量、24 h尿蛋白、血尿素氮、血肌酐浓度、血清IL-1β、IL-6、肾脏α-SMA、TGF-β1、Smad3、Smad4蛋白表达显著降低 (P＜0.05),肾脏E-cadherin、RUNX3蛋白表达显著升高 (P＜0.05)。 结论 β抑制剂可通过抑制TGF-β/Smad通路激活促进RUNX3表达,减少糖尿病肾病大鼠肾间质纤维化及促炎因子分泌,抑制肾小管上皮细胞EMT的发展。     

丹酚酸B对高糖培养肾小管上皮细胞转分化的影响及意义

目的：探讨丹酚酸 B 对高糖诱导肾小管上皮细胞分化的影响及可能机制。方法：体外培养大鼠肾小管上皮细胞 NRK52E 随机分为正常糖（NG）组、高渗（HM）组、高糖（HG）组和高糖＋Sal B（HB）组,分别培养24 h;采用免疫酶细胞化学染色对 NRK52E 细胞进行鉴定,MMT 法检测丹酚酸 B 对细胞生长活性的影响,免疫荧光细胞化学和 Western blotting 检测各组 TGF-β1、E-caderin、α-SMA 和 Col-Ⅳ蛋白的表达。结果：与 NG 组相比较,HG 组肾小管上皮细胞中 TGF-β1、α-SMA 和 Col-Ⅳ蛋白表达增多（P ＜0．05）,而 E-cadherin 蛋白表达降低（P＜0．05）;与 HG 组比较,HB 组肾小管上皮细胞中 TGF-β1、α-SMA 和 Col-Ⅳ蛋白表达减少（P ＜0．05）,而 E-cad-herin 蛋白表达增多（P ＜0．05）。结论：丹酚酸 B 对高糖诱导肾小管上皮细胞的上皮－间充质转化（EMT）有明显抑制作用,其机制可能是通过抑制 TGF-β1的表达,改善了肾小管纤维化病变的发生发展。     

曲尼司特对转化生长因子-β1诱导大鼠肾小管上皮细胞转分化作用的影响及机制

目的:探讨曲尼司特对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)转分化作用的影响及机制。方法:应用TGF-β1刺激NRK-52E,分为阴性对照组,TGF-β1诱导组和不同剂量曲尼司特干预组,用流式细胞仪观察曲尼司特干预后NRK-52E的转分化标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和E-钙粘蛋白(E-cadherin)的表达情况。结果:在TGF-β1诱导NRK-52E细胞转分化过程中,曲尼司特能剂量依赖性下调α-SMA表达,上调E-cadherin表达,两者表达呈负相关(r=-0.653)。结论:提示曲尼司特在TGF-β1诱导肾小管上皮细胞转分化中发挥保护作用。     

VEGF对上皮间充质转化的抑制与Smad信号途径及SnoN表达的变化

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)抑制转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导HK-2细胞发生肾小管上皮-间充质细胞转化(EMT)的过程中对Smad2/3,Smad7信号途径以及SnoN表达的影响。方法体外培养的HK-2细胞分为:①正常对照组;②TGF-β1(5μg/L)阳性对照组;③VEGF165(100μg/L)作用组;④TGF-β1(5μg/L)+VEGF165(100μg/L)共同作用组。采用WesternBlot法和RT-PCR分别检测各组细胞p-Smad2/3和Smad2/3(共同作用30和60min),α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Smad7、SnoN的表达水平(共同作用48h)。结果 TGF-β1组α-SMA蛋白和mRNA表达与正常对照组比较明显增强,TGF-β1与VEGF165共同作用组α-SMA蛋白和mRNA表达与TGF-β1单独作用组比较明显减弱(P0.05)。体外HK-2细胞,TGF-β1组刺激30、60min,与正常对照组比较,(p-Smad2/3)/(Smad2/3)比值明显升高,TGF-β1+VEGF165组与TGF-β1单独作用组相比明显下降,且以30min时下降明显。TGF-β1组作用48h与正常对照组比较,Smad7蛋白和mRNA表达明显下降,VEGF165+TGF-β1组较TGF-β1单独作用组Smad7表达明显升高(P0.05)。VEGF165组与正常对照组相比,α-SMA、(p-Smad2/3)/(Smad2/3)、Smad7蛋白和mRNA表达的差异无统计学意义(P﹥0.05)。TGF-β1组SnoN蛋白表达与正常对照组比较明显增强(P0.05),TGF-β1与VEGF165共同作用组SnoN蛋白表达与TGF-β1单独作用组相比差异无统计学意义(P﹥0.05),各组SnoNmRNA表达差异均无统计学意义(P﹥0.05)。结论 VEGF165抑制TGF-β1诱导HK-2细胞EMT的机制可能与直接抑制Smad2/3磷酸化、上调Smad7信号表达有关,而与调节SnoN表达无关。     

组蛋白去乙酰化酶1在慢性鼻窦炎上皮细胞中的表达及其对鼻黏膜上皮间质转化的影响

背景 慢性鼻窦炎是耳鼻喉科常见的慢性炎症性疾病.通常不伴鼻息肉的慢性鼻窦炎(chronic rhinosinusitis without nasal polyps,CRSsNP)更常见,其病因及发病机制尚不清楚.目的 研究组蛋白去乙酰化酶1(sirtuin 1,SIRT1)在CRSsNP上皮细胞中的表达,并探讨其对转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导鼻黏膜上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响.方法 采用免疫组织化学染色、Real-time PCR、Western blot观察SIRT1在CRSsNP和正常对照筛窦黏膜上皮中的表达情况.对正常鼻黏膜上皮细胞进行原代培养,并予TGF-β1处理,通过Western blot检测SIRT1过表达对EMT相关蛋白(E-cadherin、α-SMA、N-cadherin、Vimentin)表达的影响.结果 与对照组相比,CRSsNP组SIRT1表达减少(P<0.001).TGF-β1下调鼻黏膜上皮中SIRT1的表达,同时E-cadherin表达减少,α-SMA、N-cadherin、Vimentin表达增加,这一效应可被SIRT1过表达所逆转.结论 SIRT1抑制TGF-β1诱导的鼻黏膜上皮EMT,可能在CRSsNP的病理生理过程中起重要作用.     

The effect and mechanism of dexamethasone on AA induced epithelial-mesenchymal transition in HKC cells

目的 探讨地塞米松( Dex)对马兜铃酸诱导的肾小管上皮-间充质转化(EMT)的影响及可能机制.方法 体外培养的人肾小管上皮细胞(HKC)分为阴性对照组、马兜铃酸(AA,10μg/ml)作用组、Dex(100μmol/L)作用组、AA(10 μg/ml)+无水乙醇(100 μmol/L)组、AA( 10 μg/ml )+Dex( 100、10、1、0.1、0.01 μmol/L)共同作用组,培养细胞48 h,应用激光共聚焦显微镜(CFMS)观察α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E-钙黏素(E-cadherin)的表达,采用Real-time PCR和Western Blot方法检测α-SMA、E-cadherin、p-Smad 3、转化生长因子-β1(TGF-β1)、Smad 7 mRNA和蛋白的表达.结果 从作用48 h后,CFMS观察发现HKC细胞E-cadherin表达减弱而α-SMA表达增强;地塞米松干预后,E-cadherin表达逐渐增强而α-SMA表达减弱,且呈剂量依赖性.Real-time PCR、Western Blot结果均显示,与阴性对照组相比,从组α -SMA、p-Smad 3、TGF-β1 mRNA和蛋白表达水平均显著增强,E-cadherin、Smad 7 mRNA和蛋白的表达均减弱(P＜0.05).同AA作用组比较,从+Dex共同作用组随Dex剂量增加,α-SMA、p-Smad 3、TGF-β1 mRNA和蛋白的表达逐渐减弱,E-cadherin、Smad7 mRNA和蛋白的表达逐渐增强(P＜0.05),而无水乙醇却无此作用.结论 Dex可抑制从诱导HKC细胞发生EMT,并同时下调EMT过程中TGF-β1和p-Smad 3的表达、上调Smad 7分子的表达,提示TGF-β1/Smad下调可能是Dex抑制EMT发生的机制之一.     

高糖状态下肾小管上皮细胞肌肌醇加氧酶表达变化对TGF-β1表达的影响

目的:探讨高糖状态下肌肌醇加氧酶(MlOX)表达变化对肾小管上皮细胞TGF-β1表达的影响.方法:①在体外培养大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E.应用不同浓度高糖刺激NRK-52E细胞48 h,观察MIOX、TGF-β1 mRNA和蛋白表达的改变;②观测不同浓度TGF-β1刺激NRK-52E细胞48 h后MIOX mRNA和蛋白表达的变化;③应用针对MIOX基因的ASODN干涉NRK-52E细胞抑制MIOX基因表达后再用高糖刺激.观测其对TGF-β1 mRNA和蛋白表达的影响.结果:①不同浓度(15、30mmol/L)高糖刺激NRK-52E细胞48 h后MIOX、TGF-β1 mRNA和蛋白表达增加;②不同浓度(1、5、10、25 mmol/L)TGF-β1刺激NRK-52E细胞48 h后MIOX mRNA和蛋白表达无明显变化;③针对MIOX基因的ASODN干涉NRK-52E细胞使MIOX基因表达下降.同时NRK-52E细胞TGF-β1 mRNA和蛋白的表达也下降.结论:本研究结果提示,高糖刺激肾小管上皮细胞能使MIOX、TGF-β1 mRNA和蛋白表达增加,而且MIOX表达异常可能通过影响细胞因子TGF-β1的表达在糖尿病肾病中起作用.     

lncSIL通过EZH2/P21/CDK6信号通路负向调控TGF-β1诱导的肺泡上皮细胞间质转化

目的 研究在转化生长因子β1(TGF-β1)诱导肺泡上皮细胞间质转化(EMT)进程中lncSIL的作用及其相关信号通路。方法 采用Western blot法研究沉默lncSIL后对TGF-β1诱导EMT进程中细胞标志蛋白E-钙黏蛋白(E-cad)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)表达的影响;通过RNA pulldown分析lncSIL相互作用蛋白,并检测过表达或沉默lncSIL后对其靶基因组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶(EZH2)以及下游因子P21蛋白(P21)和细胞周期蛋白依赖性激酶6(CDK6)表达的影响,并结合流式细胞术分析lncSIL对细胞周期进程的作用。结果 沉默lncSIL后,间质细胞标志蛋白α-SMA和Col I表达升高,肺泡上皮细胞标志蛋白E-cad表达下降;RNA pulldown实验结果显示EZH2是与lncSIL相互作用的靶蛋白,并且沉默lncSIL后EZH2表达升高,其下游基因P21表达下调,CDK6表达上调,同时S期细胞的数量显著升高;过表达lncSIL时,EZH2与CDK6表达下调,P21表达上调,同时S期细胞的数量明显降低。结论 ln...     

TGFβ1-Smad信号通路参与IL-33诱导的A549细胞上皮间质转化

目的:探讨TGFβ1-Smad信号通路在IL-33诱导的A549细胞上皮间质转化中的作用。方法:体外培养人肺泡上皮细胞来源的A549细胞株,将传代培养的细胞分为对照组、TGFβ受体抑制剂(LY2109761)组、IL-33组、IL-33+TGFβ受体抑制剂(LY2109761)组。给予相应处理,24h后收集各处理组细胞。RT-PCR和Western blot检测转化生长因子β1(TGFβ1)、上皮细胞标志物E钙黏素(E-cad)和间质细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达水平。Western-blot检测Smad信号通路Smad3、p-Smad3的表达水平。结果:与对照组比较,TGFβ受体抑制剂组Smad3蛋白,p-Smad3蛋白,TGFβ1、E-cad、α-SMA的mRNA及蛋白表达表达水平均未见明显变化(P>0.05);与对照组比较,IL-33组Smad3蛋白表达水平无明显变化(P>0.05),但p-Smad3蛋白表达水平明显升高(P<0.05),TGFβ1mRNA及蛋白表达明显升高(P<0.05),E-cad mRNA及蛋白表达明显降低(P<0.05),α-SMA mRNA及蛋白表达明显升高(P<0.05);IL-33+TGFβ受体抑制剂组与IL-33组比较,Smad3蛋白表达水平无明显变化(P>0.05),但p-Smad3蛋白表达水平明显降低(P<0.05),TGFβ1的mRNA及蛋白表达未见明显改变(P>0.05),E-cad的mRNA及蛋白表达明显升高(P<0.05),α-SMA的mRNA及蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论:TGFβ1-Smad信号通路参与IL-33诱导的A549细胞上皮间质转化。     

补肾消渴方对糖尿病肾病模型大鼠TGF-β_1/Smad信号通路的影响

目的:观察中药补肾消渴方煎剂对高脂高糖联合链脲菌素(STZ)诱导的糖尿病肾病模型大鼠肾脏TGF-β_1/Smad信号通路的影响,探讨其作用的机制。方法:健康雄性SD大鼠随机分为正常对照组(6只)给予常规饲料和生理盐水灌胃,模型对照组、补肾消渴方组和肾炎康复片组采用高脂高糖联合小剂量STZ(30 mg/kg)腹腔注射的方法建立糖尿病肾病模型大鼠。模型对照组(6只)给予生理盐水灌胃;补肾消渴方组(7只)给予补肾消渴方水煎剂浓缩液灌胃4.2 g/(kg·d);肾炎康复片组(7只)将肾炎康复片研磨溶于生理盐水中灌胃2.4 g/(kg·d)。灌胃8周末收集大鼠尿液,测定24 h尿微量白蛋白排泄率(UAER);处死大鼠,腹主动脉采血测定血清中的肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)含量;光镜观察HE染色肾脏病理改变;应用免疫组化和Western blot检测肾组织转化生长因子(TGF-β_1)、Smad2、Smad 3、P-Smad2、P-Smad3、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白的表达。结果:补肾消渴方组大鼠血Scr、BUN和24 h UAER较模型对照组明显下降(P0.01)。肾脏病理结果显示补肾消渴方组肾组织病理改变较模型对照组明显减轻。肾组织免疫组化显示补肾消渴方肾组织TGF-β_1、α-SMA蛋白的表达较模型对照组均有降低(P0.01)。肾组织Western blot实验结果显示补肾消渴方组较模型对照组肾组织TGF-β_1、P-Smad2、P-Smad3、α-SMA蛋白表达明显降低(P0.01)。结论:补肾消渴方可能是通过抑制糖尿病肾病大鼠肾组织TGF-β_1/Smad信号通路、下调TGF-β_1、P-Smad2、P-Smad3、α-SMA蛋白的表达而起到降低蛋白尿、改善肾脏肾功能的作用。     

益气养阴活血方对高糖诱导的NRK-52E细胞代谢记忆的影响

目的探讨益气养阴活血方通过转录共激活因子P300(P300)、沉默调节因子1(SIRT1)对高糖诱导的肾小管上皮细胞(NRK-52E细胞)代谢记忆的影响。方法将NRK-52E细胞按照低糖组、高糖组、短暂高糖组、高糖+中药血清治疗组、短暂高糖+中药血清治疗组进行分组干预后,免疫组化法检测细胞α-平滑肌激动蛋白(α-SMA)和E-钙黏蛋白(E-Cadherin)表达,RT-PCR法检测P300、SIRT1 mRNA表达。结果 (1)高糖组NRK-52E细胞α-SMA表达显著升高,E-Cadherin随着高糖刺激时间增加表达逐渐降低。短暂高糖组α-SMA表达较正常组仍有明显升高,E-Cadherin表达较正常组略微减少。中药血清干预后α-SMA表达减弱,高糖刺激时间越短,干预效果越明显,中药血清干预后E-Cadherin表达明显增加。(2)高糖刺激后SIRT1 mRNA表达相对降低,P300mRNA表达相对增加,与低糖组比较差异均有统计学意义(P0.05)。高糖组与短暂高糖组比较,SIRT1 mRNA与P300 mRNA表达均未见明显差异(P0.05)。高糖+中药血清治疗组与高糖组比较,SIRT1 mRNA表达相对增加,P300 mRNA表达相对降低,差异均有统计学意义(P0.05)。短暂高糖+中药血清治疗组与短暂高糖组比较,SIRT1 mRNA表达相对增加,P300表达相对降低,差异均有统计学意义(P0.05)。高糖+中药血清治疗组与短暂高糖+中药血清治疗组比较,SIRT1与P300 mRNA表达均未见明显差异(P0.05)。结论益气养阴活血方可能抑制P300,同时刺激SIRT1表达,并通过组蛋白乙酰化修饰改变抑制炎症相关基因转录,减轻NRK-52E细胞凋亡及肾损伤,改善代谢记忆。     

益肾降浊冲剂对慢性肾功能衰竭大鼠肾小管上皮细胞转分化的影响

目的观察益肾降浊冲剂对慢性肾衰(CRF)大鼠肾小管上皮细胞向间充质细胞转分化(EMT)的影响,探讨其延缓CRF进展的作用机制。方法采用单侧肾切除加阿霉素重复注射建立慢性肾衰大鼠模型,随机分为假手术组、模型组、缬沙坦、益肾降浊冲剂治疗组。治疗组分别予缬沙坦、益肾降浊冲剂灌胃8周,Masson染色观察肾小管间质胶原沉积的程度,免疫组化检测肾小管上皮细胞TGF-β1、α-SMA的表达。结果模型组残肾肾小管出现萎缩、扩张、胶原染色阳性面积明显高于假手术组,TGF-β1、α-SMA的表达明显上调(P<0.01);缬沙坦组、益肾降浊冲剂组胶原染色阳性面积及TGF-β1、α-SMA的表达量均明显低于模型组(P<0.01);益肾降浊冲剂组胶原染色阳性面积减少及TGF-β1、α-SMA的表达量均明显低于缬沙坦组(P<0.05)。结论益肾降浊冲剂能通过抑制CRF残肾小管上皮细胞TGF-β1的表达、进而抑制EMT及胶原的沉积,作用优于缬沙坦。     

晚期糖基化终产物对高糖诱导NRK-52E细胞的转分化作用

目的：探讨晚期糖基化终产物（AGEs）对高糖诱导大鼠肾小管导管上皮细胞株NRK-52E的转分化干预作用。方法：大鼠肾小管导管上皮细胞株设空白组（不给葡萄糖）、高糖组（25mmol/L葡萄糖）、AGEs干预组（100mg/LAGEs）、高糖AGEs干预组（100mg/LAGEs＋25mmol/L葡萄糖）,培养72h后,用Westernbolt检测转化因子β1（TGF-β1）、Ⅰ型胶原、金属蛋白酶2（MMP2）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及甲状旁腺素相关肽（PTHrP）在NRK-52E细胞的表达,活性氧（ROS）含量应用CM2H2DCFDA试剂盒检测。结果：高浓度葡萄糖上调TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α-SMA以及PTHrP表达,AGEs显著上调高浓度葡萄糖状态下TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α-SMA和PTHrP表达,提高ROS含量。结论：AGEs可以促进高浓度葡萄糖诱导肾小管导管上皮细胞转分化。     

黄芪对高糖腹透液诱导大鼠腹膜间皮细胞EMT中TGF-β1/Smads信号通路的影响

目的 观察黄芪对高糖腹透液诱导大鼠腹膜间皮细胞EMT中TGF-pl/Smads信号蛋白的影响,探讨黄芪对腹膜纤维化的阻抑作用与机制.方法 实验分为5组,每组10只.阴性对照组:每日腹腔注射生理盐水20 mL/只,共35d;模型组:每日腹腔注射4.25％葡萄糖腹透液20 mL/只,共35 d;黄芪低、中、高剂量组:于造模第16天开始每日腹腔注射黄芪腹透液(腹透液中加入黄芪注射液,分别含黄芪生药终浓度10、20、40 mg/mL)20 mL/只,共20d.HE染色观察腹膜病理改变;快速免疫组化法检测腹膜组织TGF-β1、CollagenⅠ、CollagenⅢ、FN、E-cadherin、α-SMA的表达;Western blot检测腹膜组织TGF-β1、E-cadherin、α-SMA、Smad2/3、p-smad2/3、Smad7蛋白的表达;RT-PCR检测TGF-β1、E-cadherin、α-SMA、Smad7mRNA表达.结果 ①模型组PMCs呈圆形或柱形,有脱落,间皮下基质增生,大量成纤维样细胞及单核、巨噬细胞浸润,纤维素样物质沉积,腹膜组织TGF-β1、CollagenⅠ、CollagenⅢ、FN表达上调,黄芪各干预组上述变化有改善,以高剂量组作用较为明显;②模型组EMT标记蛋白α-SMA表达上调,E-cadherin表达下调,高、中剂量黄芪组能一定程度地逆转腹膜组织E-cadherin表达下降与α-SMA高表达;③模型组Samds信号蛋白p-smad2/3、Smad7表达上调,黄芪可不同程度地下调p-smad2/3高表达,增强Samd7的表达,高剂量组作用较为显著.结论 高糖腹透析液可促使PMCs EMT的发生,黄芪很可能通过抑制TGF-β1,并作用于Smads信号转导通路正、负反馈环路中的Smad2/3、Smad7关键信号蛋白,阻抑PMCs EMT的发生.