MN血型的高分辨率熔解曲线基因分型——附1例罕见Mc血型的鉴定

目的建立MN血型高分辨率熔解曲线(HRM)基因分型方法,进行MN血型基因分型,并探讨罕见Mc血型的鉴定方法。方法收集2013年1月—6月澳大利亚红十字血液服务中心献血者全血标本150例,提取基因组DNA,并利用HRM基因分型方法对MN血型进行基因分型;对HRM分型结果中出现的变异曲线标本,采用直接测序法对GYPA基因外显子2进行测序分析,确证其基因型;同时,利用单克隆抗-M及抗-N通过血清学方法检测待检标本的表型。结果 150例标本中有149例标本的HRM基因分型结果与表型一致;只有1例标本的熔解曲线形态与3个对照标本均不同,提示在扩增片段存在变异位点,血清学结果显示该标本表型为M+N-;但是,该标本的GYPA基因外显子2测序结果显示其在M抗原的1个特异性SNP位点中存在杂合突变:c.71_72GTAG,p.Gly5Glu,根据该结果判断其基因型为MMc。结论 HRM基因分型方法能对MN抗原进行准确分型。Mc是介于M与N抗原之间的1种抗原,能与大多数抗-M及少数抗-N反应,因此,仅利用1种抗-M和抗-N试剂容易导致Mc抗原的漏检,基因分型方法更容易发现Mc血型。     

中国部分人群Mur血型抗原分布及分子基础的研究

目的调查上海地区和云南地区献血者中Mur抗原阳性的分布频率;研究其基因型和分子基础。方法用已知的抗-Mur抗血清在上海和云南少数民族的献血者中用U型微孔板法筛查Mur表型,得出Mur血型抗原表型在这2种人群中的分布频率。对血清学筛出的Mur阳性标本进行Miltenberger血型基因SSP分型,同时进行GYPB假外显子的PCR扩增和直接测序或克隆后测序分析。结果在1 673名上海献血者中筛选出Mur抗原阳性30例,即Mur抗原表型在上海地区中的频率为1.79%;在201名云南献血者中筛选出Mur抗原阳性7例,即Mur抗原表型在云南地区中的频率为3.48%。对实际获得的28份上海献血者和7份云南献血者DNA的分析显示,27份上海献血者阳性标本及6份云南阳性标本均为GYP(B-A-B)Mur,即为GP.Mur型。其余2例Mur抗原阳性献血者DNA测序结果为1种新的GYP(B-A-B)杂交基因型,我们命名为GYP MiⅢShanghai。突变的位点为GYPB上209CA、220AG、224AG、227AC、内含子3的1TG,推测产生的蛋白序列与GP.Bun一致。结论本文统计了上海地区和云南地区献血者Mur抗原分布频率;同时发现了1种新的Mur抗原相关GYP(B-A-B)基因型。中国人群中Mur抗原阳性表型对应的基因型至少包括GYP MiⅢ和GYP MiⅢShanghai这2型。     

贵州地区布依族人群MNS血型基因GYPA和GYPB的群体遗传学研究

目的 研究贵州布依族人群MNS血型基因GYPA和GYPB的遗传多态性.方法 对随机抽取的138例贵州布依族献血者血样进行MNS血型血清学分型,并通过已建立的基因测序体系对GYPA的第二外显子和GYPB的第三外显子(B4)进行测序.结果 贵州布依族人群的M,N,S和s抗原的基因频率分别为53.26％,46.74％,2.54％和97.46％,同时获得了M,N,S和s相关基因GYPA和GYPB的碱基序列.该研究获得了贵州布依族MNS血型的遗传特点,并与中国汉族人群无明显差异.结论 该研究填补了贵州少数民族布依族MNS血型的血清学与分子生物学数据的空白,提示贵州少数民族和汉族人群间具有较为明显的民族融合特点,此研究还为临床输血、器官移植以及人类的遗传关系和种族迁移的研究打下了基础.     

多重连接依赖的探针扩增(MLPA)技术在广州地区RhD阴性献血者基因分型研究中的应用

目的 采用新型Rh血型系统的MLPA检测试剂盒,对广州地区收集的200名RhD阴性献血者进行基因分型.方法 采用传统的血型血清学方法,对RhD阴性献血者进行RhD表型鉴定.提取基因组DNA,采用MLPA检测试剂盒对收集的200名RhD阴性献血者进行RHD基因分型.对于不能明确分型的标本,进行RHD基因直接测序分析.结果 在200名RhD阴性献血者中,采用MLPA方法对196名进行了明确的基因分型.其中,127名为RHD基因缺失(占63.5％);仅检测到包含RHD1227A突变的DEL等位基因有41例,其中38例包含杂合等位基因,其余3例包含纯合等位基因;仅检测到RHD (1-2)-CE (3-9)-D (10)等位基因的有23例,其中19例杂合,4例纯合;3例包含2种不同的RHD等位基因(1条为RHD (1-2)-CE (3-9)-D (10),另1条为RHD1227A);其余2例分别包含杂合的DFR-2(RHD-CE(4) -D)及弱D15型(RHD845A)等位基因.在其余4例直接测序分析的标本中,2例包含杂合的RHD711 delC突变;1例1条等位基因为MLPA检测到的包含RHD1227A突变的DEL等位基因,另1条为包含711delC突变的RHD等位基因;其余1例的1条等位基因为MLPA检测到的RHD (1-2)-CE (3-9)-D (10),另1条为包含新突变的RHD等位基因(1154G ＞T,385Gly＞ Val).结论 MLPA检测试剂盒是适用于中国人群的1种快速、有效的高通量基因分型方法,能够对中国人群常见的各种RHD基因型进行明确分型,适用于参比实验室相关疑难标本的基因分型检测.也可应用于中国人群常见的Del表型检测,使Del表型患者不必再输注RhD阴性血液,节约稀有的RhD阴性血液资源.     

HRM筛查PROC基因突变方法的建立和应用

目的 利用高分辨率熔解曲线(HRM)结合PCR技术,建立遗传性蛋白C缺陷症患者的蛋白C基基因(PROC)突变筛查方法.方法 收集仁济医院2010年4月～2011年6月收治的9例蛋白C缺陷的静脉血栓患者(经测序PROC基因均已知)及其6例确认有PROC基因缺陷的患者家属DNA标本,通过设计HRM引物,用已知PROC突变的DNA标本进行构建,建立PROC基因外显子1,2,3,7,8突变HRM筛查方法.同时对3例疑似PROC基因缺陷患者,进行该方法的验证.结果 PROC基因外显子1,2,7,8区,突变体与野生型通过HRM图形可进行区分.对3例疑似PROC基因缺陷标本,HRM均筛查出突变,经测序2例为相同外显子7区杂合突变c.565C＞T,合并外显子2区杂合同义突变c.66T＞C,另1例为外显子7区杂合缺失c.577～579del,合并外显子1区多态性位点rs1799810 A＞T.综合统计15例已知标本和3例验证标本,HRM对于PROC基因外显子1,2,7,8区准确度分别为100％,94.4％,100％和91.7％.外显子3区由于缺乏突变病例,无法构建,改为直接测序法.结论 该研究建立了HRM结合直接测序法筛查PROC基因变异的方法.该方法能较快速、方便、经济地筛查PROC变异,适用于遗传性PC缺陷症基因诊断.     

高通量MLPA基因分型技术在1个Del表型家系基因鉴定中的应用

目的 对1个Del表型家系作基因鉴定.方法 运用血型血清学方法对先证者及其家系的3名成员作RhD及相关血型抗原鉴定;提取先证者及其父母和妹妹的静脉血DNA.运用高通量红细胞血型基因的多重连接依赖探针扩增技术(MLPA)对先证者及其他成员血型基因作定性及定量分型;用PCR产物直接测序方法对发现的变异作确认.结果 血型血清学检测:先证者为Del表型,其他3名家系成员为正常的RhD阳性个体.MLPA基因分型:先证者有2条包含1227G＞A突变位点的RHD等位基因,而3名家系成员有1条包含1227G＞A突变位点的RHD等位基因及1条正常的RHD等位基因.结论 高通量红细胞血型基因分型的MLPA技术能够对Del表型作明确的基因鉴定,有助于节约宝贵的RhD阴性血液.     

RhD变异型个体的表型类型和基因突变机制研究

目的:探讨RhD变异型个体的表型类型和基因突变机制。方法:收集2013年1月至2015年10月间经我中心用血清学方法确证的48例RhD变异型孕妇和献血者的血液标本,应用常规血清学方法进行Rh抗原分型后,提取血样DNA,用多重连接依赖探针扩增(multiple ligation-dependent probe amplification,MLPA)对入选的48例受检者的RHD进行检测,分析RHD的杂合性和外显子突变情况,并将MLPA检测结果与常规血清学结果进行对比。对比结果不一致的标本进行RHD外显子全长测序,并对其中新发现的等位基因进行克隆测序。结果:48例标本中,CcDee 20例(41.7%)、ccDEe 12例(25%)、CCDee 11例(22.9%)、CcDEe 5例(10.4%)。MLPA检出RHD单条等位基因突变(即杂合性为Dvd型)的38例,其中包含点突变18例、RHD/CE杂交替换20例;涉及两条等位基因突变(即杂合性为DvDv型)的10例,其中包含点突变合并RHD/CE杂交替换9例、碱基缺失合并RHD/CE杂交替换1例。MLPA能够明确其RhD变异型别的有41例(85.4%,41/48),包括弱D15型(845A)等位基因14例、RhDⅥtype 3等位基因22例;7例通过测序分析得以明确。发现2例新的等位基因,分别为79-81del CTC、689GA。结论:CcDee是RhD变异型人群的主要表型,弱D15和RhDⅥtype 3是受检人群的主要RhD变异型,点突变和RHD/CE的杂交替换是主要的分子机制,79-81del CTC和689GA为本研究发现的2个新等位基因。     

GPA,GPB分子相关基因GYPA,GYPB外显子全长序列直接测序方法的建立及应用评价

目的 建立人类GPA,GPB分子相关基因GYPA,GYPB外显子全长序列的DNA直接测序方法,并将此方法应用于RBC血型MNS抗原的分析.方法 以整群随机抽样法选择从2011年11月至2012年5月在本中心无偿献血的175例健康成年人的全血样品为研究对象.以血清学方法与序列特异引物聚合酶链反应(PCR-SSP)方法鉴定其MNS血型.根据GenBank提供的NG-007470与NG-007483基因参照序列为依据,自行设计GPA相关基因GYPA全部外显子的7对引物与GPB相关基因GYPB全部外显子的5对引物,探索最佳反应体系与PCR扩增条件,且能同时扩增2个基因全长外显子碱基序列,使用ABI3730XL DNA测序仪进行序列分析,以Oli6installer分析软件分析碱基序列.结果 所建立的测序方法可于同一反应体系、相同PCR扩增条件同时检测GPA,GPB相关基因GYPA,GYPB外显子全长序列,并准确分析本组血液样本的MNS血型的特征.基因测序结果与血清学分析及PCR-SSP鉴定结果完全一致.结论 首次建立了稳定、精确、简捷的基因直接测序分型方法,可用于检测MNS血型基因型,并分析GPA,GPB肽链中氨基酸序列的多态性,为MNS血型系统的研究以及人类群体遗传学及分子进化的研究等方面提供广泛的应用价值.     

高分辨率熔解曲线在ABO血型基因526位点单核苷酸多态性检测中的应用

目的建立高分辨率熔解(HRM)曲线检测ABO血型基因526位点单核苷酸多态性(SNP)的方法。方法随机提取35例待检血型标本的DNA,运用HRM曲线检测ABO血型基因526位点的SNP,通过PCR-DNA测序以及血型血清学试验验证HRM检测结果的准确性。结果 35例血型标本中,共检出526位点杂合子13例,纯合子22例。经测序分析和血清学试验验证13例G/C杂合中B型8例、AB型5例,22例CC纯合子中A型10例,O型12例。HRM法检测结果与测序结果及血清学结果相符。结论 HRM法是一种低成本、简便、准确的SNP检测技术,有望成为临床ABO血型基因分型的新方法。     

RhCE抗原基因分型和表型不一致与等位基因变异的相关性研究

目的 探讨变异RhCE抗原的分子背景及RHCE基因的遗传学特征与基因多态性.方法 采用单克隆抗-C、-c、-E和-e试剂检测10373例RhD阳性和635例RhD阴性献血者的RhCE表型;选择942例标本PCR-SSP技术做RHCE基因分型,对基因分型与血清学分型不一致标本采用PCR-SSP检测22个主要RHCE变异等位基因,部分RHCE等位基因采用测序技术鉴定.结果 共有54例标本(占94.27％)基因分型结果与血清学表型结果不一致,经PCR-SSP检测出22种与弱表达抗原相关的RHCE等位基因变异体,经血清学复检有36例标本RhCE抗原存在弱反应或极弱反应.结论 在血清学检测时表达弱反应的RhCcEe抗原标本中检出多种RHCE等位基因类型,变异的等位基因可以影响基因分型预测血型抗原的准确性:RhCE表型和基因型不一致的原因可能由变异的等位基因或未发现的等位基因引起.     

无偿献血者弱D61标本基因分析

目的 对本市献血者中筛查到的1例D^el标本进行基因检测,分析造成其血清学表型的分子基础。方法 献血者EDTA抗凝血分离白膜层提取核酸用于基因分型和外显子编码序列分析,红细胞用于血清学检测,采用试管法和微柱凝胶法做血清学分型,采用基因分型试剂盒做基因分型,通过测序分析基因编码的外显子多态性,确定基因突变的位点或类型。结果 血清学检测结果本例标本RhD表型为D^el,RhCE表型为CCEe,荧光定量PCR结果显示本例标本RHD编码基因外显子均为阳性,排除弱D15和RHD^*DEL1[RHD(1227G>A)],RHD编码基因外显子序列分析结果显示,该标本在外显子编码序列的第28位发生点突变,为弱D61,基因型为RHD^*01 W.61[RHD(28C>T)]。结论 在本市无偿献血者中发现1例弱D61。     

罕见B(A)血型的鉴定

目的观察2例罕见B(A)血型的血清学特征并研究其分子机制。方法用血型血清学鉴定2例献血者标本ABO血型,用序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)基因分型和直接测序确定其基因型。结果 2例献血者血型血清学检测结果均表现为B(A)亚型的特点。标本1基因分型为BO2,测序结果为第7外显子B基因发生640AG突变,符合B(A)04/O02的基因型特点;标本2基因分型为BO1,测序结果为第7外显子B基因发生700CG突变,符合B(A)02/O01的基因型特点。结论2例标本均为B(A)表现型,基因型分别为B(A)04/O02和B(A)02/O01。     

GYP mRNA基因可变剪接对MNS血型糖蛋白GPA和GPB在细胞表面定位的影响

目的 分析MNS血型相关基因GYPA、GYPB mRNA剪接体多态性,探讨各种剪接体编码的GPA和GPB蛋白异构体的亚细胞定位与MNS血型抗原表达的相关机理。方法 随机选取无偿献血者10份血液,提取外周血总mRNA,反转录为cDNA后,以巢式PCR方法扩增GYPA、GYPB基因的开放阅读框并进行Sanger测序,碱基序列与GYPA(NCBI:NM＿002099)、GYPB(NCBI:NM＿002100.5)比对。得到的GYPA、GYPB开放阅读框的野生型及各种剪接异构体编码序列后,通过融合PCR技术分别与绿色荧光蛋白(GFP)编码基因融合并克隆后转染到HEK293细胞进行过表达,通过聚焦激光扫描显微镜监测GPA-GFP和GPB-GFP融合荧光蛋白的亚细胞定位。结果 2例标本的GYPA mRNA中缺失外显子1与外显子2,预测的GPA蛋白异构体缺失2～26位氨基酸,GYPB mRNA全长序列完整。6例标本的GYPA mRNA完整,GYPB mRNA中缺失外显子2,预测的GPB蛋白异构体缺失13～45位氨基酸,其他外显子序列完整。1例标本的GYPA mRNA完整,GYPB mRNA的外显子5...     

PCR-高分辨熔解曲线法在Kidd血型基因分型中的应用

目的:探讨PCR-高分辨熔解曲线(HRM)法在Kidd血型基因分型中的应用。方法:采用简单随机抽样法,选择2019年10月至11月,于深圳市血液中心参加无偿献血的256例献血者为研究对象。本组献血者年龄为18～60岁;男性献血者为142例,女性为114例。采用血型血清学试验方法对本组献血者全血标本的红细胞抗原表型进行检...     

广州地区人群中RHD* 960A突变型等位基因的鉴定及血型血清学与分子生物学特征分析

目的分析广州地区人群中RHD*960A突变型等位基因个体的血型血清学与分子生物学特征。方法收集RhD变异型标本,采用2种不同的单克隆抗-D试剂鉴定RhD血型,抗球蛋白凝胶卡法进行直接抗球蛋白试验,并用RhD抗原表位检测试剂盒(D-Screen)检测RhD抗原表位;此外,采用Rh血型分型卡检测Rh CE抗原;采用多重连接酶依赖的探针扩增(MLPA)方法检测RHD及RHCE基因型;对MLPA方法无法给出检测结论的标本,进行RHD基因全部10个外显子的PCR扩增及产物直接测序。结果发现3例RhD变异型标本,直抗阴性,初步血清学结果显示RhD抗原弱阳性表达,RhD抗原表位检测结果显示其红细胞与RhD抗原epD6.6、epD8.2和epD9.1表位特异性单克隆抗体无凝集反应,与其余表位抗体呈弱阳性凝集反应;RHCE抗原分型1例为CCee,其余2例为Ccee;RHD基因的MLPA基因分型显示其基因型为正常的RHD/d(即未鉴定出其携带的突变型RHD等位基因),后续RHD基因外显子直接测序发现其第7外显子携带c.960GA(p.Leu302Leu)同义突变,RHCE基因MLPA基因分型结果与血清学表型一致。结论首次在广州地区人群中发现了RHD*960A突变型等位基因个体,并进行血清学抗原表位和基因型检测,其血清学表现为部分D。     

多重连接探针扩增技术在2例罕见Rh部分D表型等位基因检测中的应用

目的 探讨多重连接依赖探针扩增(MLPA)技术在2例罕见Rh部分D表型等位基因检测中的应用.方法 选择2012年4月和9月外院送广州血液中心进行RhD血型鉴定的2例受检者全血样本作为研究对象.对其进行常规血清学方法鉴定RhD血型后,提取全血标本的DNA.采用MLPA技术对上述2例受检者的RHD和RHCE基因进行检测,分析RHD和RHCE基因的外显子拷贝数、点突变、基因缺失及杂交融合情况,并将MLPA技术检测结果与常规血清学及序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)检测结果进行对比.结果 受检者全血标本MLPA结果显示其RHD、RHC、RHc基因拷贝数均为1.0,RHE基因拷贝数为0,RHe基因拷贝数为3.0,D03-380T、D03-455A、D04-602C、D05-667T、D04-514A、D05 787G基因外显子拷贝数均为0,即RHD基因外显子3～5完全缺失.PCR SSP结果亦显示受检者RHD基因外显子3～5缺失,检出C、c、e基因;血清学结果显示受检者红细胞与2种单克隆抗D在试管中均有2+的凝集,Rh血型其他抗原分型为C+ c+E e+.2例受检者全血标本MLPA技术,常规血清学及PCR-SSP检测结果基本一致.结论 2例受检者属中国人群中首次发现的Rh部分DⅥtype 4型血型;MLPA技术作为检测基因点突变、基因缺失、等位基因杂交融合和基因拷贝数的新技术,可用于Rh血型D抗原变异型的等位基因检测.     

高分辨率熔解曲线法检测药物性耳聋相关线粒体12S rRNA突变

目的建立一种基于高分辨率熔解曲线(HRM)技术的药物性耳聋相关线粒体12S rRNA基因1494CT和1555AG突变快速检测方法。方法采用定点诱变克隆策略构建突变质粒DNA标准品;建立突变位点靶序列PCR扩增及HRM分析方法,并检测106例非综合征耳聋患者标本,以DNA直接测序法进行验证。结果建立的HRM检测方法能准确检出线粒体12S rRNA基因1494CT和1555AG突变,各基因型HRM曲线特征明显且易于分析判断;106例非综合征耳聋患者标本中检出6例1555AG突变,检测结果与DNA测序结果一致。结论建立了药物性耳聋相关人类线粒体12S rRNA基因1494CT和1555AG突变HRM检测方法,操作简单快速、结果准确可靠,可应用于人群筛查和临床常规分子诊断。     

Mur基因分型方法的建立及西安地区无偿献血者的频率分布

目的建立Mur基因分型的方法,同时检测西安地区无偿献血人群中Mur血型的基因频率。方法根据Mur基因序列特异性设计引物,建立了Mur血型的基因检测方法。同时对379例西安地区无偿献血者进行GYP(BA-B)Mur基因检测,检出的阳性样本用抗-Mur进行确认,并随机抽取20例基因检测阴性的样本,用抗-Mur检测作为对照。结果建立的Mur基因检测方法的检测结果与血清学检测结果吻合,证明该方法具有很好的特异性。西安市无偿献血者样本379例,检出Mur阳性4例,Mur抗原在西安地区无偿献血人群中的频率为1.05%。结论建立的Mur基因分型方法可以替代血清学的方法用于鉴定Mur血型抗原,对于了解人群分布频率,筛查和提供相合的血液,保障临床输血安全具有重要的作用。     

西安地区献血人群MNS血型基因多态性研究

目的了解西安地区人群MNS血型基因的多态性。方法随机选取陕西西安地区献血人群200(人)份血样,以血型血清学鉴定其MN和Ss表现型;同时提取全血中的DNA,对血型糖蛋白相关基因GYPA的内含子(intron)-2、3及外显子(exon)-2与GYPB的exon-3(B4)序列扩增后测序;分析本组人群MNS等位基因的多态性并与不同地区人群的M基因各型的构成比作比较。结果本组人群的MN、Ss血型血清学定型与基因测序分型结果完全一致,其中M、N、S、s基因频率分别为0.467、0.533、0.053和0.947,MG、MT基因频率分别为0.415和0.052;本组人群M基因各型的构成比与北京和深圳人群不同;GYPA intron-2的第59与60位碱基处插入T,发生率为20.5%(41/200)。结论西安地区献血人群MNS血型基因具有多态性,对这种多态性的了解有助于本地区临床科学、合理输血以及开展人类群体遗传学特征及分子生物学的研究。     

Mur血型分子诊断方法的建立与应用

目的建立Mur血型的分子生物学诊断方法。方法根据Mur血型的分子背景,设计特异性引物,采用PCR-SSP技术,优化反应体系及扩增参数,建立Mur血型分子检测方法;同时采用标准抗血清、标准细胞,用血清学方法予以验证并初步应用于献血者Mur血型的检测。结果建立了Mur血型PCR-SSP检测方法,用以检测14份已知抗-Mur阳性或阴性的献血者标本,同时用血清学方法平行检测:抗-Mur阳性11/11、抗-Mur阴性3/3,结果完全一致;用本法对随机抽取的107名献血者血样检测,检出2例阳性,同时采用标准抗血清用血清学方法所做的复核结果也完全一致。结论所建立的Mur血型PCR-SSP检测方法可以准确地检出Mur抗原,弥补了Mur血型血清学检测方法的局限性,有助于Mur血型检测方法的标准化、规范化。