闭合性脑损伤后Ast结构及NGF基因表达时间性变化的应用研究

目的：探讨大鼠闭合性颅脑损伤后星形胶质细胞(Astrocyte，Ast)形态学变化及神经生长因子(Nerve growth factor，NGF)基因表达时间性变化规律的法医学意义。方法：本研究脑组织常规固定切片HE染色、GAFP免疫组化染色结合计算机彩色图像分析技术观察分析脑损伤后星形胶质细胞的细胞形态学变化，同时采用RT-PCR法，半定量分析闭合性脑损伤后0h、3h、6h、12h、1d、3d、5d、7d、11d脑组织中NGF mRNA含量的变化。结果：大鼠闭合性脑损伤后Ast形态学随伤后时间的变化有一定的规律性：外伤后0-3 h Ast反应性肿胀最明显，以后随着时间的延长Ast反应性肿胀程度呈降低、肿胀Ast的数目呈减少的趋势，脑干挫伤周围Ast反应较大脑、小脑挫伤周围多见且明显。正常脑组织中存在NGF mRNA，但表达量较低。闭合性脑损伤后脑组织中NGF mRNA表达量显著升高并呈现一定的规律性。     

大鼠闭合性脑损伤后脑组织星形胶质细胞结构及NO、内皮素水平的变化

目的:探讨闭合性脑损伤后脑组织星形胶质细胞(Ast)形态学变化及一氧化氮(NO)、内皮素( ET)水平的变化.方法:36只大鼠随机分为6组,每组6只.其中1组为对照组,免行打击,其他处理同其余5组.其余5组以Marmarou法造成闭合性脑损伤模型,分别于伤后0 min、30 min、60 min、90 min和120 min再次麻醉后处死,迅速断头取脑,在脑干挫伤灶周围取部分脑组织,经HE染色、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组化染色,观察分析脑损伤后Ast的细胞形态学变化,同时检测各组脑组织NO和ET含量.结果:大鼠闭合性脑损伤早期(损伤后30 min), Ast反应性肿胀最明显,随着时间的延长,Ast反应性肿胀程度和肿胀细胞数目逐渐减轻和减少.脑损伤早期(损伤后30 min),脑组织NO水平迅速升高(P＜0.01,以后逐渐降低,但仍高于对照组水平(P＜0.01;损伤后30 min)脑组织ET水平迅速降低(P＜0.01),而后逐渐增加,但仍低于对照组水平(P＜0.01).结论:脑组织NO和ET水平的失衡可能是闭合性脑损伤后脑功能、代谢和结构改变的主要因素之一.     

星形胶质细胞对损伤反应的体外实验研究

目的：研究体外星形胶质细胞（Ast）反应性胶质化的发生、发展过程与规律。方法：体外分离培养Ast,利用划伤的方法,建立Ast对损伤反应的实验模型,通过形态学观察、RT－PCR、免疫细胞化学、原位杂交及图像分析等方法,研究体外Ast对损伤的反应及规律。结果：损伤体外培养的Ast后,观察到反应性胶质化的典型特征,表现为Ast胞体肥大、突变增粗、延长,GFAP免疫细胞化学染色增强;原位杂交、RT－PCR分析表明,GFAPmRNA表达显著提高。上述变化在伤后1d即可见到,5－7d达到高峰。结论：体外分离培养的Ast对损伤表现出活跃的反应,呈现出典型的反应性胶质化特征,其发生、发展过程与规律类似于在体情况下的Ast反应。     

早期丰富环境干预对缺氧缺血性脑损伤新生鼠海马GAP-43表达的影响

目的 探讨早期丰富环境干预对缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain injury, HIBI)新生大鼠海马生长相关蛋白(Growth-associated protein-43, GAP-43)表达的影响.方法 按Rice法制备SD大鼠HIBI模型,随机分为干预组和非干预组,假手术大鼠作为对照组.干预组大鼠于HIBI后第2天开始丰富环境干预,分别于术后第3、7、14、21、28天取各组大鼠脑组织进行免疫组织化学染色和RT-PCR检测,观察不同时间点各组大鼠海马GAP-43及其mRNA表达的差异.结果 非干预组大鼠海马GAP-43及其mRNA表达强于对照组(P＜0.01),干预组海马GAP-43表达于术后第14、21、28天强于非干预组,差异显著(P＜0.05),GAP-43mRNA表达于术后第7、14、21、28天强于非干预组,差异显著(P＜0.05). 结论 早期丰富环境干预可以增强HIBI新生大鼠海马GAP-43及其mRNA的表达,提示GAP-43表达的增多可能参与了丰富环境影响HIBI新生大鼠损伤修复的机制.     

创伤性脑损伤后人脑组织中诱导性一氧化氮合酶蛋白水平的研究

目的:探讨创伤性脑损伤(Traumatic Brain Injury,TBI)后诱导型一氧化氮合酶(induced nitric oxide syn-thase,iNOS)在人脑组织中的表达变化及意义。方法:把38例脑损伤患者以及对照组患者分为7组(包括对照组,伤后0￣6h组、6￣12h组、12￣24h组、24￣48h组、48￣72h组,72h以上组)。用尼氏法染色观察脑损伤后神经细胞病理变化过程,免疫组织化学染色方法观察iNOS阳性细胞的表达变化。结果:尼氏法染色发现损伤区神经细胞减少;免疫组化检测发现伤后不同时相iNOS阳性细胞表达增加,伤后12￣24h达到高峰。结论:脑损伤后神经元的数量减少,损伤区及周围皮质出现iNOS阳性神经元,iNOS阳性细胞的表达与伤后时程有关。     

电针对体外培养星形胶质细胞机械性损伤后反应性胶质化的影响

目的观察电针对体外培养星形胶质细胞(Astrocyte,Ast)机械性损伤后反应性胶质化的影响。方法取新生3d龄SD大鼠的大脑皮层进行Ast原代培养,取第三、四代细胞制作细胞机械性损伤模型,电针刺激,用倒置相差显微镜及免疫细胞化学荧光染色观察细胞生长增殖,细胞形态及胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表达的变化。结果模型组Ast机械性损伤后,细胞增生,体积变大,GFAP表达增强。电针组较模型组细胞增生减少,细胞体积变化不大,GFAP表达较弱。结论电针刺激可以抑制体外培养Ast机械性损伤后的增生,降低细胞内GFAP的表达,即电针可以抑制Ast的反应性胶质化。     

急性闭合性颅脑损伤脑微循环形态学改变的实验研究

目的:研究急性闭合性颅脑损伤后大鼠脑微循环形态学的改变.方法:制作大鼠侧位液压冲击脑损伤模型,脑微血管墨汁灌注、制备透射电镜脑组织标本,观察脑微循环形态学的变化.结果:墨汁灌注示脑外伤后3h微血管的数目和密度均较对照组降低.伤后48h、72h微血管数目和密度均较3h组增加,但仍较对照组低.透射电镜示微血管在伤后3h即有微绒毛的形成,伤后6h微血管内膜不完整,内皮细胞管腔面有微绒毛形成,相邻的微绒毛往往合抱形成小泡.伤后24h～72h,微血管内皮细胞肿胀明显、管腔狭窄呈缝状,细胞核轻度固缩,胞质内线粒体呈空泡状.毛细血管内膜凸凹不平,有断裂.结论:急性颅脑损伤后微循环的改变是导致脑外伤后继发性缺血缺氧的主要原因.     

瘦素对小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及表达Cx43的影响

目的探讨瘦素对局灶性脑缺血再灌注损伤大脑缝隙连接蛋白43(Cx43)表达的影响及瘦素的脑保护作用机制。方法将45只健康雄性昆明小鼠随机分为假手术组、模型组和瘦素组。模型组和瘦素组制备小鼠大脑中动脉局灶性脑栓塞模型,瘦素组于缺血0min时腹腔注射1mg/kg瘦素,缺血2h再灌注24h后评价神经功能状态,脑组织TTC染色测定脑梗死体积,HE染色观察组织病理学改变;原代培养SD乳鼠的大脑皮层星形胶质细胞(Ast),将纯化后的Ast分为对照组、模型组、瘦素100μg/L组和瘦素500μg/L组,制作大鼠大脑皮质星形胶质细胞缺氧复氧模型,MTT法检测星形胶质细胞存活率,Western blot方法检测脑组织及星形胶质细胞中Cx43的表达变化。结果与模型组相比,瘦素组神经功能损伤状态得到改善(P<0.05),脑缺血再灌注后脑梗死体积缩小(P<0.05),脑组织病理学损伤程度减轻,Cx43的表达明显降低(P<0.01);与模型组比较,瘦素100μg/L组Ast存活率提高,Cx43表达减少,但差异均无统计学意义(P>0.05),瘦素500μg/L组Ast存活率显著提高(P<0.01),Cx43表达明显减少(P<0.01)。结论体内和体外实验均提示,瘦素可能通过降低损伤后脑组织中Cx43的表达,减轻脑缺血再灌注损伤。     

改良大鼠弥漫性脑损伤实验模型

目的 改良弥漫性脑损伤动物模型,建立一种简单实用的闭合性弥漫性颅脑损伤动物模型.方法 改良marmarou打击装置建立大鼠弥漫性颅脑损伤动物模型,脑组织的病理学改变使用渡银染色及HE染色法检测.结果 损伤呈全脑局部弥漫性分布,有出血、神经细胞肿胀、胶质细胞嗜酸性变、脑组织疏松、神经细胞变性坏死、嗜神经现象.结论 改良的marmarou闭合性大鼠颅脑损伤模型可作为闭合性弥漫性颅脑损伤研究的病理实验基础.     

创伤性脑损伤活体脑片不同时相的脂质过氧化损伤

目的 观测创伤性脑损伤后不同时间大鼠脑组织的脂质过氧化损伤.方法 70只SD大鼠随机分为假损伤组(n=10)和脑损伤组,损伤组按伤后1、6、24、48、72和168 h观察时间点分为6个亚组(n=10).用Feeney氏自由落体撞击法制作重型颅脑损伤模型.利用激光扫描共聚焦显微镜观察损伤后不同时间荧光探剂2,7-二氯氢化荧光素(H2DCFDA)与碘化丙啶(PI)标记的活体脑片细胞内脂质过氧化物的动态变化和细胞死亡程度.结果 ①1、6、24 h损伤组脂质过氧化物明显增加(P<0.05),48 h达到峰值,之后下降,72 h已显著下降(P<0.05),168 h恢复正常水平.②1、6 h损伤组神经细胞死亡明显增加(P<0.05),24 h达到峰值,之后维持不变,24、48、72及168 h各损伤组之间细胞死亡无明显差异(P>0.05).③脂质过氧化物引起神经细胞死亡.结论 创伤性脑损伤早期(<72h)脑组织即发生脂质过氧化反应引起神经细胞死亡,并且将持续一周.脂质过氧化物在创伤性脑损伤的继发损害中起重要作用.     

不同载铁状态下HL-60细胞转铁蛋白受体和铁蛋白mRNA的表达

目的:探讨不同载铁情况下HL-60细胞中转铁蛋白受体(TfR)mRNA和铁蛋白(Fn)mRNA的表达情况.方法:取HL-60细胞分5组培养.FeCl3-20组和FeCl3-40组培养液中加入FeCl3,终浓度分别为20 μmol/L,40 μmol/L;DFO-50和DFO-100组培养液中分别加入去铁胺(DFO)50 μmol/L,100 μmol/L;对照组用单纯培养液,不加FeCl3或DFO.分别于细胞培养12 h、24 h和48 h收集细胞,采用RT-PCR半定量法测定TfR mRNA和Fn mRNA的相对表达量.结果:与对照组比较,DFO-50和DFO-100组TfR mRNA表达量随培养时间的延长而升高,Fn mRNA表达量变化不大(P＞0.05).FeCl3-20和FeCl3-40组TfR mRNA的表达随培养时间的延长,先增高后降低,Fn mRNA的表达则逐渐降低.结论:TfR 和Fn 不同程度地参与了HL-60细胞铁代谢过程.     

膀胱移行细胞癌中间隙连接蛋白Cx43mRNA、Bcl-2mRNA和Bax mRNA的表达及其相关性研究

目的 探讨间隙连接蛋白Cx43、Bcl-2及Bax在膀胱移行细胞癌(BTCC)中的表达及其意义.方法 用半定量RT-PCR的方法检测Cx43、Bcl-2及Bax在35例BTCC和21例癌旁组织中的表达情况,并分析其与BTCC临床病理因素的关系.同时取正常膀胱组织15例做对照.结果 BTCC组织中Cx43 mRNA的表达比值[Cx43/人肌动蛋白(β-actin)]为(0.34±0.37),低于BTCC癌旁组织中的(0.79±0.70)和正常膀胱组织的(0.81±0.47),差异有统计学意义(P＜0.01);Bcl-2 mRNA表达比值为(0.35±0.43),高于癌旁组织中的(0.16±0.33)和正常膀胱组织的(0.15±0.23),差异有统计学意义(P＜0.01).癌旁组织与正常膀胱组织Cx43 mRNA及Bcl-2 mRNA的表达比值比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).Cx43 mRNA在BTCC病理分级G3的表达为(0.30±0.16),G2的表达为(0.54±0.22),G1的表达为(0.60±0.25),3个级别比较差异有统计学意义(P＜0.05).Bcl-2 mRNA在BTCC病理分级G3的表达为(0.47±0.15),G2的表达为(0.35±0.11),G1的表达为(0.24±0.10),3个级别间比较差异有统计学意义(P＜0.01).复发BTCC组织中Bcl-2 mRNA的表达水平(0.40±0.15)高于初发癌组织(0.28±0.11),差异有统计学意义(P＜0.05).Bax mRNA在BTCC组织、癌旁组织及正常膀胱组织中的表达水平比较,差异无统计学意义(P＞0.05).Bax mRNA的表达水平与BTCC患者的肿瘤分期、病理分级以及肿瘤有无复发比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 Cx43 表达下调与BTCC的发生、进展及其恶性特征有关,Cx43基因可能与凋亡相关基因Bcl-2(或Bcl-2/Bax)在BTCC的发展中起拮抗作用,与细胞的凋亡过程有关.     

肺癌外周血中EGFR mRNA、SP-D mRNA、LUNX mRNA表达的临床意义

目的:应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测肺癌患者肿瘤组织和外周血中EGFRmRNA、SP-DmRNA、LUNXmRNA的表达,探讨其作为肺癌微转移检测分子标志物的可行性。方法:应用RT-PCR技术检测40例非小细胞肺癌组织和15例肺良性病变组织中EGFRmRNA、SP-DmRNA、LUNXmRNA的表达;检测40例肺癌患者外周血中靶基因的表达,并以15例良性肺疾病患者和10名健康人外周血作为对照。结果:40例肺癌患者病理组织中EGFRmRNA、SP-DmRNA、LUNXmRNA的表达率为77.5%(31/40)、100%(40/40)、100%(40/40),外周血中EGFRmRNA、SP-DmRNA、LUNXmRNA表达阳性率分别为55.0%(22/40)、52.5%(21/40)和57.5%(23/40);对照组中15例肺良性病变患者病理组织中EGFRmRNA表达率为13.3%(2/15),无SP-DmRNA和LUNXmRNA表达,15例肺良性病变患者和10名健康人的外周血中无EGFRmRNA、SP-DmRNA、LUNXmRNA表达。结论:EGFRmRNA、SP-DmRNA、LUNXmRNA作为检测肺癌组织及肺癌外周血微转移的分子标志物具有良好的敏感度和特异性;三者表达与肺癌TNM分期、组织学类型和癌细胞分化程度关系密切。     

环氧化酶2和乙酰肝素酶mRNA在肾癌中的表达

目的探讨环氧化酶2（COX 2）和乙酰肝素酶（Hpa）mRNA在肾癌（RCC）组织中的表达,分析其与RCC发生发展及预后的关系。方法采用逆转录-聚合酶链反应(半定量RT PCR)方法检测56例RCC组织标本及28例癌旁正常组织标本中COX 2 mRNA与Hpa mRNA的表达（β actin作为定量标准物）,观察其在RCC组织和癌旁组织中的表达差异以及与临床病理参数和预后的关系。结果56例RCC组织中COX 2 mRNA与Hpa mRNA阳性率分别为73.2％和67.9％,均高于癌旁正常组织（χ2＝17.719,χ2＝21.429,P均＜0.05）;COX 2 mRNA阳性表达率G1～G2高于G3～G4（χ2＝30.727,P＜0.05）,COX 2 mRNA表达与患者预后不相关（χ2＝0.890,P＞0.05）;Hpa mRNA阳性表达率与RCC病理分级、临床分期、淋巴转移密切相关（χ2＝7.718,χ2＝3.963,χ2＝3.852,P均＜0.05）,Hpa mRNA表达与患者预后相关（χ2＝12.72,P＜0.05）;COX 2 mRNA与Hpa mRNA的阳性表达不相关（r＝-0.244,P＞0.05）。结论COX 2 mRNA高表达是RCC发生的早期分子事件;Hpa mRNA高表达与RCC进展、转移、预后等密切相关。     

胃癌组织中基质金属蛋白酶-2和E-钙黏附素检测

目的:探讨胃癌组织中基质金属蛋白酶 -2(MMP- 2)和E 钙黏附素 (E- CD)的表达。方法:采用原位杂交法,检测 72例胃癌(其中复发 39例)组织中MMP- 2mRNA和E- CDmRNA的表达,并观察 2者与浸润深度和淋巴结转移之间的关系。结果:胃癌组织中MMP -2mRNA和E CDmRNA的阳性表达与浸润深度和淋巴结转移有关。复发患者的 2种胃癌组织 (复发前手术切除标本;本次胃镜活检标本)与非复发胃癌组织标本的MMP 2mRNA和E- CDmRNA的阳性表达率差异有统计学意义(MMP 2:P<0. 01;E CD:P<0. 05)。MMP- 2mRNA阳性表达的胃癌组织中E CDmRNA的阳性表达率低于MMP 2mRNA阴性表达的胃癌组织, 2者呈负相关 (r=-0. 273,P<0. 05)。结论:MMP- 2mRNA和E- CDmRNA的表达与胃癌的浸润、转移及复发有关。检测MMP- 2mRNA和E- CDmRNA在胃癌患者胃镜活检组织中的表达可能有助于判断预后及胃癌转移复发潜能。     

丹参对LDL受体及apoA－Ⅰ mRNA水平的影响

研究了丹参对高脂喂饲大鼠的血清脂质水平、肝低来度脂蛋白（ＬＤＬ）受体ｍＲＮＡ和载脂蛋白（ａｐｏ）Ａ－ＩｍＲＮＡ水平的影响，以及对培养的人成纤维细胞上述两种ｍＲＮＡ水平的影响。发现丹参能升高鼠肝及人成纤维细胞ＬＤＬ受体ｍＲＮＡ水平，但降血清总胆固醇及ＬＤＬ胆固醇作用不明显。提示ＬＤＬ受体可能存在翻译或翻译后水平的调节。丹参对鼠肝及人成纤维细胞ａｐｏＡ－１ｍＲＮＡ水平未见有影响。     

桂枝汤对脾虚大鼠NFAT mRNA,IL-4 mRNA,IFN-γ mRNA的干预作用

目的:采用RT-PCR方法来探讨桂枝汤对脾虚NFAT mRNA,IL-4 mRNA,IFN-γ mRNA的影响以及干预Th1/Th2细胞漂移的机制.方法:40只大鼠随机分为空白对照组(A组)、脾虚组(B组)、桂枝汤大剂量组(C组)和桂枝汤小剂量组(D组)等4组,每组10只;用规范的脾气虚证大鼠模型造模方法将B,C和D组大鼠造模,B,C和D组分别用蒸馏水、桂枝汤大剂量、桂枝汤小剂量灌胃,标本采集后用RT-PCR检测NFAT mRNA, IL-4 mRNA和IFN-γ mRNA表达水平.结果:脾虚组的NFAT mRNA,IL-4 mRNA表达上调;而IFN-γ mRNA表达下调,经桂枝汤大、小剂量组治疗后,NFAT mRNA,IL-4 mRNA表达下调,IFN-γ mRNA表达上调.结论:桂枝汤对Th1/Th2细胞漂移作用途径可能是通过下调NFAT mRNA的表达,恢复了IFN-γ mRNA正常转录水平,进而下调IL-4 mRNA的表达,使脾虚大鼠Th1/Th2细胞达到一种新的平衡.     

肝癌组织GPC3 mRNA与AFP mRNA的表达

目的: 探讨肝细胞肝癌(HCC)中GPC3 mRNA与AFP mRNA的表达以及二者单独和联合检测的诊断价值.方法: 半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测HCC 41例,其他肝肿瘤15例,健康人11例肝组织标本中两个基因的表达.结果: GPC3 mRNA在HCC、癌旁、其他肿瘤、远离HCC与正常肝组织的相对表达量分别为78.9±35.5,30.6±21.6,36.6±25.2,23.8±15.5;而AFP mRNA的相对表达量依次为61.2±32.6,31.5±23.6,29.0±24.7,21.2±15.9;各基因在HCC与其他组织间表达差异显著(P<0.01).以各自远离癌灶与正常组织相对表达量的上限(x 1.96s)为界值,HCC中GPC3 mRNA,AFP mRNA的高表达比率分别为80.5 %与63.4 %,而两者联合检测的比率达92.7 %.AFP mRNA与血清AFP水平和HCC分级有关,GPC3 mRNA的表达与HCC的分级及侵袭性有关.HCC中两个指标相对表达量无显著相关性(r=-0.145,P=0.365).结论: GPC3 mRNA可能是一个潜在的特异性HCC标记,与AFP mRNA联检可提高HCC筛查与诊断的比率.