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《食品与发酵工业》2017,(1):37-43
将来源于Paenibacillus campinasensis G1-1的木聚糖酶编码基因成功整合到毕赤酵母GS115基因组上,构建了高产木聚糖酶XynG1-1的毕赤酵母工程菌。采用响应面法对该工程菌的发酵条件进行优化。首先使用Design-Expert软件进行Plackett Burman实验设计筛选出影响产酶量的3个主要因素,即甲醇含量、生物素含量和培养时间。在此基础上使用Design-Expert软件进行Box-Behnken实验设计,通过响应面分析得出优化的发酵培养条件为:甲醇含量2.28%,培养时间37.29 h,生物素4 mg/L,酵母粉20 g/L,蛋白胨20 g/L,YNB 30 g/L,装液量100 m L/L,转速250 r/min、温度28℃、磷酸缓冲液pH 6.0。经实验验证,优化后的培养条件下胞外重组酶活达到707.2 IU/m L,与响应面预测结果一致,较优化前木聚糖酶酶活提高了7.9倍,较原始菌株产酶量提高了19.8倍。经10 L发酵罐扩大培养之后,重组木聚糖酶的酶活达到2 703 IU/m L。因此,该研究有效提高了木聚糖酶XynG1-1的发酵产量,并且,该重组酶保持了良好的酶学性质,可为工业化生产及应用奠定基础。 相似文献
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对植酸酶毕赤酵母基因工程菌的营养条件和发酵条件进行研究.结果表明,其最佳培养基配方为(g/100 mL):葡萄糖5.00,玉米浆3.00,KCl 0.05,MnSO4·7H2O 0.03,FeSO4·7H2O 0.03,MgSO4·7H2O 0.07,KH2PO4 0.02;其最佳培养条件为:发酵初始pH 6.0,发酵温度31℃,用250 mL三角瓶,装液量为40 mL,菌体的接种量为10%(v:v),发酵周期60 h.在最佳发酵条件下,植酸酶活力提高3.57倍,高达5 462 u/mL. 相似文献
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TAT-SOD是TAT蛋白转导结构域与SOD的融合蛋白质。作者以2007年构建的产TAT-SOD重组毕赤酵母菌为出发菌株,通过摇瓶实验研究不同温度、初始pH、诱导剂浓度等因素对蛋白质表达的影响。通过比色分析法测定菌体浓度、超氧阴离子自由基清除法测定酶活、SDS-PAGE分析目的蛋白质TAT-SOD的浓度;并采用定量PCR法分析表达菌株的目的基因的mRNA变化规律,从而研究长期保藏重组毕赤酵母菌株表达TAT-SOD的适合性及其条件优化。研究结果表明,摇瓶发酵的最佳条件下(YPDM培养基,体积分数1.0%诱导剂浓度,诱导温度30.0 ℃,初始pH值7.0),发酵液上清酶活水平为753 U/mL,是未优化初始酶活水平的5.1倍,其中pH值优化使TAT-SOD表达水平提高到原始值的3.4倍。7.0的初始诱导pH值的mRNA水平是对照组pH 4.0的3.5倍。这些结果说明,长期保藏的重组毕赤酵母菌株仍然适合表达TAT-SOD,发酵条件会对毕赤酵母的TAT-SOD表达造成显著影响,影响表达水平的最主要因素是目的蛋白质的mRNA水平变化。 相似文献
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含硫氨基酸是所有生物生长繁殖不可缺少的氨基酸。尽管毕赤酵母在工业发酵中作为重要的表达菌株,但是其含硫氨基酸的生物合成途径尚未明了。作者采用生物信息学及表型分析的方法,阐明了毕赤酵母含硫氨基酸的生物合成途径。结果表明,毕赤酵母可通过O-乙酰同丝氨酸及O-乙酰丝氨酸与无机硫元素合成含硫氨基酸,甲硫氨酸与半胱氨酸也可通过转硫途径实现相互转化。另外毕赤酵母cys3Δ突变菌株在未添加半胱氨酸的合成培养基中对硒代甲硫氨酸表现出显著的抗性。综上所述,未来有望应用毕赤酵母表达硒蛋白用于蛋白质三级结构的分析。 相似文献
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为实现新型CGTase在毕赤酵母中的高效表达,提取嗜热芽孢杆菌CHB1基因组DNA为模块,PCR扩增野生型基因CGT1,编码680个氨基酸。将该基因进行密码子优化CGT2,与野生型基因CGT1分别插入分泌型载体pPICZαA转化毕赤酵母GS115,获得两株酵母工程菌GS115/pPICZαA-CGT1和GS115/pPICZαA-CGT2;经甲醇诱导表达120 h后,CGT2活力达0.62U/mL,是优化前CGT1(0.37 U/mL)活性的1.7倍;进一步对GS115/pPICZαA-CGT2进行摇瓶发酵条件优化,确定其最优发酵条件为:pH 6.5、28℃、200 r/min、每24小时补加体积分数1.5%的甲醇诱导,120 h后其胞外酶活力达到1.26 U/mL,是优化前的两倍。 相似文献
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通过共表达分子伴侣的策略提高漆酶在毕赤酵母中的产量。前期基于Pichia pastoris密码子偏好性,合成了来源于Cerrena sp. WR1的漆酶基因,克隆至pPIC9K,转化Pichia pastoris GS115,得到重组菌株PP-L。在PP-L中,分别过量表达蛋白质折叠(BIP、ERO1)、囊泡运输(SEC53、SEC1)、胁迫应激(HAC1、GCN4)相关的6种分子伴侣。结果显示,共表达这6种分子伴侣对分泌表达漆酶的菌株PP-L的正常生长没有影响;共表达BIP使重组菌胞外酶活提高359%,共表达ERO1胞外酶活反而降低22%;共表达其它4种分子伴侣对胞外酶活提高18%~53%。组合共表达BIP和HAC1的重组菌P1较PP-L胞外酶活提高了602%,酶活达到3 896 U/L。推测由于强化内质网中BIP水平进而提高了蛋白质折叠能力,从而提高其分泌效率。该研究结果将有助于发酵法生产漆酶的工业化。 相似文献
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为获得高产量、高活性的葡萄糖氧化酶(GOD)酵母表达菌株,优化了GOD的T132S/T56V双突变编码序列,将之克隆到表达载体pGAPk上得到表达载体pGAPk-h2-GOD,以pGAP启动GOD基因的表达。将pGAPk-h2-GOD上的pGAP启动子替换为pGCW14和pAOX1,并对pGCW14启动子进行改造,得到3种pGCW14的改造体,最终得到包括pGAPk-h2-GOD在内的6种不同启动子的重组表达载体。将这6种载体转化毕赤酵母GS115,建立了一种简便高效的筛选方法初步筛选出GOD重组菌株,再对筛选到的转化子进行发酵培养,测定发酵上清液的GOD酶活力,以此来比较各种启动子启动效率的强弱。结果显示:pGCW14的启动效率是pGAP的3~5倍,改造后的启动子pGCW14+G20A/C-467T(0.767)和pGCW14-UA(0.689)的启动效率较原始的pGCW14(0.574)都有明显的提高,尤其pGCW14+G20A/C-467T启动效率最高,比原始pGCW14提高了32.5%左右。与诱导型启动子pAOX1(1.187)相比,pGCW14+G20A/C-467T(1.109)的启动效率仅比其低6.6%左右。结论:改造后的启动子可望在毕赤酵母组成型高效表达的研究应用中具有一定的前景。 相似文献
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利用革胡子鲶鱼的加工副产物鲶鱼头/鱼排,在高压浸提液的基础上,经分步酶解再发酵,制备鱼味美拉德反应香料基料.结果表明:经过分步酶解法,酶解液中游离氨基酸总量是高压浸提液的6.09倍,其中谷氨酸含量由0增加至6.67 mg/100 g,天冬氨酸、丝氨酸、蛋氨酸含量分别是高压浸提液的3.10、82.71、8.43倍;利用单... 相似文献
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细菌漆酶具有良好的热稳定性和抗碱性环境能力,在工业废水处理和染料脱色方面具有很大的潜力。通过研究短小芽孢杆菌W3菌株的CotA漆酶基因在大肠杆菌中重组表达的酶学性质,对其发酵培养基进行优化,以提高产量。利用分子手段实现CotA漆酶基因在大肠杆菌中的重组表达,并利用BP神经网络建模和萤火虫算法寻优对CotA漆酶发酵培养基进行优化,最后重组表达的CotA漆酶进行染料脱色研究。结果表明,重组菌株表达的CotA漆酶具有良好的热稳定性和耐碱能力,最适反应pH值为3.5,最适反应温度为80 ℃。重组CotA漆酶对底物ABTS具有良好的亲和能力,Km为0.247 mmol/L,Kcat为41.32 s -1。在适宜条件下的重组CotA漆酶的表达量为1 915.3 U/L,使用BP神经网络和萤火虫算法优化培养基获得最佳的发酵培养基配方为:蛋白胨1.16 g/dL、酵母粉0.428 g/dL、NaCl 1.06 g/dL、CuSO 4 0.274 mol/L和甘油(体积分数)0.931%。优化过的培养基产CotA漆酶酶活为3 088.68 U/L,相比未优化之前提高了61.26%。重组表达的CotA漆酶对孔雀石绿和酸性蓝129脱色效果明显,达到90%脱色率。短小芽孢杆菌W3来源的CotA漆酶具有良好的酶学性质和工业应用前景。利用BP神经网络偶联萤火虫算法寻优是CotA漆酶发酵培养基优化的有效手段。 相似文献
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将Bacillus sphaericus 2297蛋白酶基因sph进行毕赤酵母密码子优化后,进行全基因合成,并构建了重组酵母菌P. pastoris X33-ppicZalphA-sph,对重组酶进行酶学性质研究。结果表明,重组酶的最适反应温度和最适反应pH为40 ℃和8.0,且其为20~30 ℃中保温10 h仍有80%以上的酶活力、在pH7.0~9.0条件下孵育24 h,仍能保持60%以上的酶活性。K+、Sr2+对酶活有明显激活作用,而Fe3+、Ba2+对酶活有明显抑制作用;重组蛋白酶SPH在极性常数为0.8~3.1的25%的正丁醇、环己烷、二甲苯中孵育6 d后,仍能保留50%以上的酶活性。本研究为B. phaericus 2297和B. phaericus DS11蛋白酶有机溶剂耐受性机制的研究奠定基础。 相似文献
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Rhodococcussp.经发酵培养可合成分泌胆固醇酯酶。对该菌种进行诱导及发酵条件的优化,确定其培养基为(%):蛋白胨1.3,KCl 0.5,牛肉膏0.1,Na2HPO40.632,MgSO40.06,油酸0.4,卵磷脂0.25,Triton X-100 0.16;最适培养条件为:pH7.4,250 mL三角瓶中装量40 mL,接种量6.0%,摇床转速180r/min,30℃培养24h。在最适培养基及最适培养条件下,胆固醇酯酶比活力可达到5.47 U/mg。酶学性质研究结果表明,该酶的最适温度为40℃,最适pH为7.0。 相似文献
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本文研究了一株枯草芽孢杆菌KC-WQ的胞外分泌物的抑菌效果及功效成分。实验发现枯草芽孢杆菌KC-WQ对大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella enterica subsp. enterica)和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)均有明显的抑菌效果,其中对沙门氏菌的抑制效果最为显著。在此基础上,采用酸沉淀法分离抗菌成分,通过薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析结构发现,该菌株分泌抗菌物质为脂肽类,分子量分布在1030.5~1491.4 Da之间,主要由伊枯草菌素(Iturin)、表面活性素(Surfactin)和芬荠素(Fengycin)组成,最小抑菌浓度为0.8 mg/mL。该脂肽成分经热处理(105 ℃,20 min)后,仍保持良好的抗菌效果。采用响应面法对KC-WQ的发酵条件进行优化,得到最佳发酵条件为:初始pH为6.0,发酵温度为36 ℃,摇床转速为208 r/min,预测粗产物产量为1.311 g/L,后经实验验证,实际产量可达1.236 g/L。上述结果表明,枯草芽孢杆菌KC-WQ具有良好的抗菌性能和加工性能,可作为抑菌成分,在食品保藏和抗菌包装材料开发中具有应用前景。 相似文献