常见腹泻病毒的多重荧光RT-PCR检测方法的建立及临床应用

目的：建立能同时检测病毒性腹泻病人粪便中星状病毒(Astrovirus)、A族轮状病毒(Group A Rotavirus)、肠道腺病毒(Enteric Adenovirus)、诺如病毒 GI/GII(Norovirus GI/GII)的多重荧光RT-PCR方法。方法：根据各病毒基因组保守性序列设计引物和探针,建立多重荧光RT-PCR检测方法。对建立的多重荧光RT-PCR方法进行特异性、敏感性、灵敏性实验,并使用该法对256份病毒性腹泻粪便标本进行检测,同时使用基因测序进行验证。结果：成功建立常见腹泻病毒的多重荧光RT-PCR检测方法,对星状病毒、轮状病毒、肠道腺病毒、诺如病毒以外的病原体不发生扩增反应。该法检测星状病毒、轮状病毒、肠道腺病毒、诺如病毒的灵敏度可达500copies/ml。256份标本中：星状病毒、轮状病毒、肠道腺病毒、诺如病毒阳性率分别为3.13%( 8/256),42.97%(110/256),9.38%( 24/256),10.16%(26/256),与基因测序方法检测结果符合率达到100%。结论：该多重荧光RT-PCR检测方法具有快速、灵敏、特异的的优点,可用于临床病原诊断。     

多重巢式和定量PCR联合应用提高SARS病毒检测率

目的寻求一种可靠、可行的对急性严重呼吸道综合征病毒的早期诊断方法.方法应用多重巢式PCR联合荧光实时定量方法,对广州地区91份确诊和疑似病例标本、25份健康志愿者标本同时进行检测.结果25份健康志愿者标本经两种方法检测均为阴性.91份确诊和疑似病例标本经多重巢式PCR方法检测,阳性标本数53例,总阳性检测率58.24%;荧光实时定量PCR检测阳性标本数68例,阳性检出率74.73%;两种方法联合,阳性标本数76例,阳性检出率83.52%.结论多重巢式PCR联合荧光实时定量方法可进一步提高SARS病毒的阳性检出率,也为今后应对可能发生的其它突发性传染病病毒的检测提供分子诊断基础.     

多重荧光定量PCR测定登革热I~IV型方法的建立与初步评价

目的 探讨多重荧光定量PCR 测定登革热Ⅰ～Ⅳ型方法的建立与初步评价。方法 针对登革热Ⅰ～Ⅳ型使用自建的引物探针对反应条件及温度进行调整,且对阳性样本进行不同浓度的稀释,检测自建多重荧光定量PCR 在登革热Ⅰ～Ⅳ型测定中的重复性、灵敏性及特异性。结果 6 份登革热阳性样本通过自建的检测方法来进行检测,全部能够显示明显的S 曲线扩增,且与原有确证方法相比,不同型别的结果一致。其他10 份病毒阳性样本及阴性样本全部没有显示扩增曲线,提示自建的检测方法特异性良好。分别检测登革热Ⅰ～Ⅳ型,变异系数（CV%）值水平范围：0.51～5.51,提示重复性较好。使用自建的多重荧光定量PCR 对登革热不同型别进行检测的平均用时与ELISA 法相比无显著差异（t=1.561,P＞0.05）。通过自建的多重荧光定量PCR 测定通过仪器来完成核酸的自动提取,在仪器当中加样、上机之后不需要另外的操作,充分降低了发生污染的风险。结论 本次研究设计建立的登革热Ⅰ～Ⅳ型多重荧光定量PCR 检测方法,在重复性、灵敏性及特异性方面均较为理想;且相比ELISA 法在加样后无需另外手动操作,更加简易方便。     

多重巢式和定量PCR联合应用提高SARS病毒检测率

目的寻求一种可靠、可行的对急性严重呼吸道综合征病毒的早期诊断方法。方法应用多重巢式PCR联合荧光实时定量方法，对广州地区91份确诊和疑似病例标本、25份健康志愿者标本同时进行检测。结果25份健康志愿者标本经两种方法检测均为阴性。91份确诊和疑似病例标本经多重巢式PCR方法检测，阳性标本数53例，总阳性检测率58．24％；荧光实时定量PCR检测阳性标本数68例，阳性检出率74．73％；两种方法联合，阳性标本数76例，阳性检出率83．52％。结论多重巢式PCR联合荧光实时定量方法可进一步提高SARS病毒的阳性检出率，也为今后应对可能发生的其它突发性传染病病毒的检测提供分子诊断基础。     

实时荧光定量PCR技术在食源性细菌检测中的应用效果评价

【目的】探讨应用实时荧光定量PCR技术在食源性细菌检测中应用效果。【方法】分别应用细菌培养法,PCR检测法,实时荧光定量PCR方法对987例群体食源性食物中毒腹泻患者和疑似患者的粪便或呕吐物2084份样品进行食源性病原体检测。【结果】检测2084个感染性腹泻标本,细菌培养法阳性检出率45.2%,普通PCR检测法阳性检出率63.4%;采用实时荧光PCR技术阳性检出率90.1%。实时荧光定量PCR检测法阳性检出率显著高于细菌培养检测法和普通PCR检测法,相比较均有显著性差异（P〈0.05）。【结论】实时定量荧光定量PCR技术准确、快速、简便、特异性强,在食源性细菌检测中,能为突发食源性食物中毒事件提供更早的控制措施并争取时间。     

小鼠诺如病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立小鼠诺如病毒(murine norovirus,MNV)实时荧光定量PCR检测方法,为建立MNV规范化检测方法提供依据。方法根据NCBI公布的60个MNV病毒株核酸序列设计特异性引物,构建标准阳性质控品,建立MNV实时荧光定量PCR方法,并进行特异性、灵敏度、重复性及稳定性评价。用该方法对766只送检小鼠的盲肠内容物样品进行检测,初步了解北京地区实验小鼠MNV感染状况。结果成功建立MNV实时荧光定量PCR检测方法,该方法特异性好,与同种属人类诺如病毒(Hu No Vs)、猫杯状病毒(FCV)均无交叉反应,检测灵敏度可达101copies/μL。批内及批间CT值变异系数均小于2%。应用该方法在766份小鼠盲肠内容物样品中检出301份MNV核酸阳性样品,阳性率39.3%。结论建立的MNV实时荧光定量PCR检测方法特异性好,灵敏度高,重复性好,可以用于MNV的快速定量检测。     

多重实时荧光定量PCR检测急性肝炎患者HBV和HCV方法的建立与意义分析

目的建立一种新的可以快速筛查急性肝炎患者HBV和HCV感染的多重实时荧光定量PCR方法。方法收集596例急性肝炎患者血清或血浆样本,应用自主构建的多重实时荧光定量PCR方法同时检测HBV和HCV,同时应用HBV和HCV单管检测试剂进行检测分析。结果新建立的多重实时荧光定量PCR体系,可以有效地检测HBV和HCV的阳性质控品及阳性样本。多重实时荧光定量PCR体系特异性较好,检测HBV和HCV时,两者之间无交叉反应,且以多种血浆病毒的核酸样品为模板进行检测时结果全为阴性;多重实时荧光定量PCR体系检测HBV、HCV的灵敏度分别为20 IU/ml、50 IU/ml;多重实时荧光定量PCR体系精密度好,检测HBV、HCV的CV值分别为0.11%、0.096%。在检测临床样本时,多重复合体系检测血清或血浆中HBV和HCV的检出率与单独检测HBV和HCV具有很好的一致性,且HBV和HCV的一致率分别达到97.7%(k=0.952)、98.8%(k=0.976);同时有6例样本出现HBV和HCV共感染。结论新型多重实时荧光定量PCR方法对快速检测及筛查HBV和HCV较快捷,而且特异性好、灵敏度高、精密度好。因此多重实时荧光定量PCR方法对2种肝炎病毒的检测具有重要意义。     

深圳市2014-2015年病毒性腹泻病原学特征和流行病学分析

目的 了解深圳地区5种主要腹泻病毒的流行状况、分布特征和病原学特点.方法 收集2014年4月-2015年12月市级哨点医院的腹泻粪便标本,采用多重荧光PCR方法进行病毒检测,应用描述性流行病学方法对监测结果进行分析.结果 共采集腹泻粪便标本600份,病毒核酸阳性130份,检出率为21.67％,诺如病毒核酸阳性株检出率最高,为62份(10.33％),其次是轮状病毒、星状病毒、札如病毒和腺病毒;其中札如病毒核酸阳性检出率男女差异有统计学意义(P＜0.05);各年龄段均有腹泻病毒核酸检出,1～4岁组和30～39岁组腹泻病毒核酸的总检出率最高,分别为34.38％(22/64)和29.59％(29/98),＞60岁组检出率最低为11.94％ (8/67);流行病学资料显示,深圳市全年各月份均有病毒性腹泻发生,1月、2月和3月的检出率较高,而8月份的检出率最低.结论 深圳市病毒性腹泻全年均可发生,各年龄组男女均可感染,2014-2015年深圳市的优势病毒是诺如病毒Ⅱ型和轮状病毒,5岁以下婴幼儿是腹泻病毒监测的重点人群.     

婴幼儿腹泻的病毒学检测分析

目的:了解婴幼儿秋冬季腹泻中轮状病毒、星状病毒及肠道腺病毒的感染情况.方法:对2006年10月至2007年3月的182例急性水样腹泻婴幼儿的粪便标本,采用金标快速试剂盒检测轮状病毒抗原;采用酶免疫吸附测定法(EIA)检测星状病毒抗原及肠道腺病毒抗原.结果:182例标本中轮状病毒检出率35.2%(64/182);星状病毒检出率5.5%(10/182),4例合并轮状病毒感染:肠道腺病毒检出率3.3%(6/182),2例合并轮状病毒感染.结论:轮状病毒仍是婴幼儿秋冬季腹泻最主要致病原;星状病毒感染是婴幼儿病毒性腹泻的第二位病因;有混合性病毒感染发生.     

诺瓦克样病毒实时荧光定量PCR检测方法研究

目的建立贝类中GⅡ型诺瓦克样病毒的实时荧光定量PCR检测方法。方法针对GⅡ型诺瓦克样病毒保守序列,设计出简并引物与探针,建立GⅡ型诺瓦克样病毒实时荧光定量PCR检测方法。并用该方法和常规PCR法对127份贝类标本进行检测。结果研究方法对GⅡ型诺瓦克样病毒检测准确和重复性好,灵敏度为10拷贝。标准曲线的线性范围为101~105拷贝,相关系数为0.9986,并且对贝类标本的检出率显著高于常规PCR。结论本研究建立了GⅡ型诺瓦克样病毒的实时荧光定量PCR检测方法,可用于贝类中GⅡ型诺瓦克样病毒污染状况及其突发事件的快速定量检测。     

昆明市幼儿病毒性腹泻病原学监测分析

目的了解云南省昆明市病毒性腹泻的病原谱特征,探索其流行规律,以期为病毒性腹泻患儿临床治疗及制定有针对性的防控措施提供参考。方法采集2018年1月至2019年12月因腹泻就诊的昆明市5岁以下患儿粪便标本,用实时荧光定量PCR方法进行核酸检测,检测轮状病毒、诺如病毒、腺病毒、星状病毒及札如病毒,并分析各种病毒的流行病学特征。结果共收集病例418例,男性患儿258例,女性患儿160例,男女性别比1.61∶1,男性患儿检出率为69.38%,女性患儿检出率为63.75%,男女检出率之比为1.09∶1。患儿主要集中在散居儿童及人口集中的托幼机构。感染科腹泻病毒核酸检出率高达83.43%。腹泻幼儿年龄主要集中在<2岁年龄段,1~<2岁年龄组轮状病毒核酸检出率男性达83.33%,女性达86.54%。轮状病毒、诺如病毒在冬春季流行;札如病毒、星状病毒、腺病毒春季高发;腺病毒在夏季高发。结论昆明市5岁以下婴幼儿病毒性腹泻仍以轮状病毒及诺如病毒为主要病原体,尤其要防范冬春季腹泻病高发期轮状病毒及诺如病毒引起的暴发及流行。应针对不同病毒发病高峰时间,制定有针对性的防控方案,采用不同的应对措施。     

深圳市龙华区2019年札如病毒基因分型以及进化分析

目的 分析2019年深圳市龙华区札如病毒的基因型别,掌握辖区内札如病毒的流行情况。方法 采用实时荧光定量PCR对283份龙华区感染性腹泻疫情样本进行轮状病毒、诺如病毒和札如病毒核酸检测,对札如病毒阳性样本核酸采用RT-PCR（反转录-聚合酶链式反应）扩增,并对扩增产物进行序列测定和遗传进化分析。结果 2019年龙华区共发生感染性腹泻聚集性疫情24起,共采集283份样本。其中由诺如病毒引起15起（占62.5%）,札如病毒引起4起（占16.6%）,札如和诺如病毒共同引起1起（占4.1%）,未检测出病原体4起（占16.6%）。283份感染性腹泻疫情样本中,诺如病毒检测阳性率为17.7%（50/283）;札如病毒阳性率为8.1%（23/283）,轮状病毒未检出,所有病例无混合感染情况。23例札如阳性样本有5例VP1条带扩增成功,扩增效率为21.7%,基因亚型鉴定分析结果表明2株为GII.3型,3株为GII.4型。结论 在2019年龙华区腹泻疫情方面,GⅡ.3和GⅡ.4型是札如病毒的主要型别。诺如依然是龙华区感染性腹泻中引起散发和暴发的首要病原体,星状,轮状,腺状仅在散发病例中发现,而札如已成为引起急性腹泻病的重要病原体,应尽快开展龙华区对札如病毒的常规检测和进一步的分子分型工作。     

东莞市病毒性腹泻病原学分析

目的了解东莞市病毒性腹泻的病原学分布情况。方法收集2010年7月至2012年9月东莞市东华医院感染性腹泻患者的粪便样品,采用ELISA方法检测轮状病毒,采用Realtime RT-PCR方法检测诺如病毒,采用RT-PCR方法检测星状病毒,采用Realtime PCR方法检测腺病毒。结果检测粪便样品共224份,诺如病毒、轮状病毒、腺病毒、星状病毒检测阳性率分别为17.9%、11.6%、4.5%,0.4%,总检测阳性率为31.3%。对其中22份轮状病毒阳性样品进行血清分型,结果G血清型中,G1型10株,G2型1株,G3型8株,G9型3株。P血清型中,P6型1株,P8型12株,9株未能分型。40株诺如病毒全部为GⅡ型。1株星状病毒经测序分析为1型。结论东莞市腹泻病毒主要感染3岁以下的婴幼儿,诺如病毒和轮状病毒为主要病原体,轮状病毒的分布呈多样性,以G1型为主。     

浙江省急性腹泻患儿中肠道病毒检测分析研究

目的 探讨浙江省急性腹泻患儿的常见病毒组成.方法 采集5岁以下（≤5岁）急性腹泻患儿的811份粪便标本,采用ELISA方法检测A组轮状病毒（RV）,应用多重PCR方法同时检测B/C组RV、诺如病毒（NoV）、札如病毒（SaV）、肠道腺病毒（AdV）、星状病毒（AstV）,并利用RT-PCR对RV的阳性标本进行G、P分型.结果 811份粪便样本中,RV、NoV、SaV、AdV 及AstV总的阳性比例分别为25.52%、18.37%、4.44%、2.71%和1.23%;65份（8.01%）混合感染标本中以RV和NoV混合感染所占比例最大（56.92%）; 116份RV的G/P分型中,G3型（37.93%）、G1型（32.75%）和P[8]型（57.76%）是RV的优势型别,且G3/P[8]（27.59%）是混合感染最主要的组合.结论浙江省五种常见腹泻病毒及其混合感染的流行状况,为临床治疗和疾病监测提供参考价值.     

2006年秋冬季青岛地区婴幼儿病毒性腹泻病原分析

目的 了解青岛地区引起婴幼儿病毒性腹泻的主要病原组成及其流行情况.方法 2006年9～12月,采集青岛市儿童医院婴幼儿病毒性腹泻大便样品共38份,采用胶体金法检测轮状病毒;采用RT-PCR法检测星状病毒和人杯状病毒.结果 在38份样品中检测到轮状病毒7份,阳性率为18.42%;检测到星状病毒4份,阳性率为10.53%; 检测到人杯状病毒6份,阳性率为15.79%.其中1份混合感染星状病毒和人杯状病毒,1份混合感染轮状病毒和星状病毒,未发现轮状病毒和人杯状病毒的混合感染.结论 2006年秋冬季,引起青岛地区婴幼儿感染性腹泻的3种主要病毒中,以轮状病毒为主,其次为人杯状病毒和星状病毒.     

荧光定量PCR同步检测人类疱疹病毒6,7,8型方法的建立

目的:建立同步检测人类疱疹病毒6,7,8型(HHV-6,-7,-8)的多重荧光定量PCR方法。方法:分别针对HHV-6,-7,-8的U67、U36、ORF65基因设计3对引物和3种Taq Man-LNA探针,构建三重荧光定量PCR反应体系,用于同步扩增HHV-6,-7,-8。分别应用HHV-6,-7,-8质粒建立对应标准曲线,并对多重荧光定量PCR方法进行线性范围、灵敏度、特异性、重复性和扩增效率等方法学评价。以DNA测序法为参考方法,检测45例疑似HHV感染者外周血单个有核细胞(PBMC)中的HHV-6,-7,-8,对多重荧光定量PCR方法进行临床特异性和敏感性评估。结果:多重荧光定量PCR方法检测HHV-6,-7,-8的线性范围均在10⁶-106-10⁽¹¹⁾Copies/L,相关系数均>0.99,灵敏度为8×10(11)Copies/L,相关系数均>0.99,灵敏度为8×10⁵Copies/L,最低检测限为5×105Copies/L,最低检测限为5×10⁵Copies/L,无非特异性扩增,线性范围内HHV-6,-7,-8的批间、批内变异系数(CV)均<5.5%;与单重荧光定量PCR相比,检测HHV-6,-7,-8质粒含量的相关性分别为0.980,0.987,0.965。以DNA测序方法为金标准,多重荧光定量PCR检测HHV-6,-7,-8的特异性均为100%,灵敏度分别是93.1%、80%、100%。结论:多重荧光定量PCR能够对HHV-6,-7,-8进行同步、快速和准确的定量检测,将在输血安全筛查方面有着广泛的应用前景。     

系统性红斑狼疮合并深部真菌感染多重荧光定量PCR检测研究

目的 建立系统性红斑狼疮(8LE)合并白念珠菌和黄曲霉感染的多重荧光定量PCR检测技术,为其诊断提供快速、敏感、特异的方法.方法 通过ATCC公布的白念珠菌及黄曲霉的基因序列,应用分子生物学软件设计两对引物和Taqman探针,通过检测狼疮患者合并白念珠菌及黄曲霉等深部真菌感染,怀疑深部真菌感染样品各20例,以及非白念珠菌及非黄曲霉微生物样品20例.以评价该法阳性率、敏感性、特异性.结果 多重荧光定量PCR检测SLE合并白念珠菌和黄曲霉感染的阳性率及特异性均为100%;而该法和真菌培养法敏感性分别为75.00%和40.00%,且有统计学差异(P<0.05).结论 基于Taqman探针技术的实时荧光PCR检测体系,可同时检测SLE患者合并白念珠菌和黄曲霉深部真菌感染.具有快速、灵敏度高、特异性强、可定量等优点.

Abstract：

Objective To establish a rapid, sensitive and specific method based on multiplex fluorescent quantitative PCR for detection of deep infections with Candida albicans and A spergillus flavus in patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Methods Two pairs of primers and Taqman probes were designed according to the gene sequences of Candida albicans and A spergillus flavus available in American Type Culture Collection. The positivity rate, sensitivity and specificity of the multiplex fluorescent quantitative PCR-based method for detecting the fungal infection was tested in 20 specimens from SLE patients with Candida albicans and A spergillus flavus infections, 20 specimens from SLE patients with suspected deep fungal infections, and 20 microbial samples other than Candida albicans or A spergillus flavus. Results The multiple fluorescence quantitative PCR-based method showed a positivity rate and specificity of both 100% for detecting Candida albicans and Aspergillus flavus infections in the SLE patients. This method resulted in a detection sensitivity of 75%, significantly higher than that of fugal culture method (40%, P<0.05). Conclusions The multiplex fluorescent real-time PCR-based method allows rapid, quantitative and simultaneous detection of deep Candida albicans and Aspergillus flavus infections with high sensitivity and specificity in SLE patients.     

运用降落PCR同时快速检测NV、EV71和CoxA16病毒

目的运用降落聚合酶链反应(touchdown PCR,TD-PCR)技术快速从腹泻、手足口病人粪便标本中同时检测诺如病毒(Norovius,NV)、肠道病毒71型(Enterovirus 71 EV71)和柯萨奇病毒A组16型(Coxsachie virus,CoxA16),并评价该技术用于检测这3种病毒的效能和敏感性。结论根据touchdown PCR原理设计TD-PCR程序,试验选择最佳反应条件,与普通PCR扩增效果进行评价。用10倍稀释检验TD-PCR方法的灵敏度,并用轮状病毒、札幌病毒、星状病毒、伤寒杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、香港海鸥形菌检测该方法的特异性。结果 TD-PCR能在一个反应条件下同时检测NV、EV71和CoxA16,扩增片段条带清晰,检测效果明显优于普通PCR,测序证实了3组片段的特异性,3种病毒cDNA的最低检测浓度分别为4.775μg/ml、2.360μg/ml、43.273μg/ml。检测该方法特异性时,其他病原体未见特异性条带扩增。结论成功建立的TD-PCR方法可同时检测腹泻和手足口病人粪便中NV、EV71和CoxA163种病毒,为快速检测相关病原体、科学防治腹泻和手足口病疫情暴发提供了可靠手段。     

156例儿童医院感染性腹泻病原学分析

目的探讨我院医院感染性腹泻（Infectious diarrhea,ID）致病菌的分布,为院内ID防治提供理论依据。方法对2010年1-12月156例院内ID患儿的粪便标本进行常规检查,细菌培养,并采用免疫胶体金标法检测轮状病毒（Rotavirus,RV）抗原;逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）法检测诺如病毒（Norovirus,NV）核酸,星状病毒核酸及肠腺病毒核酸。结果156例患儿细菌感染10例（占6.4％）,真菌感染5例（占3.2％）,检出RV阳性74例（占47.4％）,NV阳性24例（占15.4％）,星状病毒阳性2例（1.3%）,肠腺病毒阳性6例（3.8%）;RV和NV病毒院内感染阳性率男女性别差异无统计学意义（P〉0.05）,不同年龄组间RV及NV阳性率差异无统计学意义（P〈0.05）。RV、NV在不同季节的发病差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论婴幼儿院内ID病毒多于细菌,病毒中轮状病毒占首位,应根据病原菌分布情况积极采取预防与控制措施,降低医院ID发病率。