家猪信号转导及转录激活因子基因3、5a及5b的克隆、剪切变体鉴定及组织表达图谱分析

本研究以家猪为材料,克隆了家猪STAT3、STAT5a、STAT5b基因的cDNA全长,序列分析显示:家猪STAT3基因cDNA编码770个氨基酸的蛋白,与人、牛、大鼠、小鼠STAT3氨基酸序列一致性高达99%;STAT5a基因cDNA编码799个氨基酸的蛋白,与人、牛、大鼠、小鼠氨基酸序列一致性分别为分别为96%,97%,95%,和95%;STAT5b基因cDNA编码787个氨基酸的蛋白,与人、牛、大鼠、小鼠氨基酸序列一致性高达98%.同时,还鉴定到STAT3的一种新剪接变体以及STAT5a的三种剪接变体.采用RT-PCR方法,我们进一步检测了这些基因mRNA在成年家猪各组织中的表达情况.STAT3在除了心脏和肌肉以外的其他被检测组织中均有较高的表达水平;STAT5a在肝脏、肾脏、脾脏、肺和卵巢中有较高的表达水平;STAT5b在所有被检测的组织中均有表达.     

猪STAT4、STAT6基因克隆及组织表达研究

本研究以长白猪为材料,克隆了STAT4和STAT6基因的cDNA全长,其中STAT4基因cDNA全长2269 bp,编码748个氨基酸的前体蛋白,与人、牛、大鼠、小鼠等哺乳动物STAT4氨基酸序列一致性分别为97%、98%、96%、96%;STAT6基因cDNA全长2637 bp,编码847个氨基酸的前体蛋白,与人、牛、大鼠、小鼠等哺乳动物的氨基酸序列有很高的同源性,分别为93%、95%、88%和87%.采用RT-PCR方法,本研究对家猪STAT4和STAT6基因进行组织表达分析.结果显示:STAT4在所有组织中都有表达,STAT6在心、肝、脾、肺、肾、肌肉、小肠等组织中有表达.此外,本研究已将家猪STAT4和STAT6基因编码区序列克隆到真核表达栽体pcDNA3.1(+)中,并做了初步功能鉴定.     

家猪BMP-2、BMP-3基因克隆及其组织表达探究

本研究以长白猪(Landrace)肺cDNA为模板,扩增获得猪骨形态发生蛋白BMP-2和BMP-3基因的cDNA全长.BMP-2基因cDNA全长为1742bp,编码395个氨基酸的前体蛋白,与人、牛、绵羊、大鼠、小鼠等的BMP-2基因的氨基酸序列一致性分别94.18%,95.4%,95.2%,90.3%,90.60%;BMP-3基因cDNA全长为1639bp,编码475个氨基酸的前体蛋白,猪与人、牛、绵羊、大鼠、小鼠等的BMP-3氨基酸序列的一致性分别是84.7%、87.7%、82.3%、80.4%、79.5%.采用RT-PCR方法,对BMP-2、3基因在家猪主要组织的表达进行探究.结果显示:BMP-2在所有组织中均有表达;而BMP-3在脑、肺、小肠中表达量较高,其他组织中表达量弱.     

猪黑皮质素受体3和4基因克隆及分析

以长白猪(Landrace)大脑cDNA为模板,克隆长白猪黑皮质素受体3和4基因(MC3R和MC4R).序列分析显示:长白猪MC3R基因cDNA编码具319个氨基酸的前体蛋白,与人、大鼠、小鼠和斑马鱼的氨基酸序列一致性分别为86.4%、83.3%、82%和69.7%;MC4R基因cDNA全长1175bp,编码具332个氨基酸的前体蛋白,与人、大鼠、小鼠的氨基酸序列一致性高达94%以上,与斑马鱼MC4R氨基酸序列享有70.7%的同源性.序列分析显示,猪MC3R和MC4R基因都具有典型的七次跨膜结构域,和短的胞内环和胞外环,且在第五个跨膜域中保守的甲硫氨酸(M)分别替换为异亮氨酸(I)和缬氨酸(V).另外,在猪MC3R和MC4R中还鉴定到保守的半胱氨酸残基,第一个胞内环中保守的PMY基序和N末端的3个N-链接糖基化位点.组织表达图谱分析表明,MC3R主要在大脑和脾中高表达,而MC4R主要在六种检测的组织中都有表达,在肾中表达较弱.     

猪GPR84基因克隆和组织表达图谱分析

本研究以长白猪(Landrace)小肠cDNA为模板,克隆游离脂肪酸家族受体GPR84基因cDNA全长.GPR84基因cDNA全长1243bp,编码396个氨基酸的前体蛋白,与人、大鼠、小鼠、牛等哺乳动物的GPR84氨基酸序列一致性分别为90.2%、83.8%、82.8%、89.4%;结构分析表明猪GPR84含有保守的七次跨膜结构域.采用RT-PCR方法,对家猪GPR84基因进行组织表达分析.结果显示:GPR84在家猪各组织中均有表达.其在下丘脑,肺,肝脏及肠末端分区等组织中表达量较高.     

人SVOP基因的cDNA克隆及表达

SV2和SVOP都是大鼠中包含有12个跨膜结构域的突触小泡蛋白.笔者从人类大脑的cDNA文库中分离得到了一个类似于大鼠突触小泡蛋白SV2和SVOP的人类新基因的全长cDNA序列,它包含一个含有1 646个核苷酸的开放阅读框,编码一个含548个氨基酸的蛋白质.生物信息学分析表明:该基因定位在第12号染色体的12q24.12区域.Northern杂交结果表明:该基因只在人类大脑组织中表达,且与无脊椎动物线虫、疟蚊和果蝇的同源基因有50%的氨基酸同源性,与脊椎动物大鼠和小鼠的同源基因有90%以上的氨基酸同源性.     

人类Neuritin cDNA的克隆和表达

从人胎脑cDNA文库筛选出一条1618bp的cDNA。此cDNA含有一个426bp的最大开放阅读框,编码一个142个氨基酸的蛋白质,预测分子质量为15.3ku。与目前数据库中序列比较,该cDNA与鼠neuritin基因同源性达98％。多组织Northern blot分析显示neuritin在脑组织高度表达。neuritin cDNA的读框片段正确插入到pQE40表达载体中,获得了预期的表达产物,并初步得到了其纯化蛋白。     

猪Akt1、Akt2基因克隆与组织表达图谱分析

为了得到长白猪蛋白激酶Akt1和Akt2基因序列并分析其表达模式,本研究使用RT-PCR方法,首先克隆了蛋白激酶Akt1和Akt2的cDNA.序列分析显示:长白猪Akt1基因的cDNA全长1461bp,编码具480个氨基酸残基的前体蛋白,其氨基酸序列与人,牛,大鼠,小鼠同源性达到97%以上.长白猪Akt2基因cDNA全长为1505bp,编码具481个氨基酸残基的前体蛋白,其氨基酸序列与人,牛,大鼠,小鼠的同源性高达97%以上.SMART分析表明,猪Akt1和Akt2蛋白均包含了与PI-3K结合的PH结构域及2个具有丝氨酸/苏氨酸激酶催化活性的S_TKc结构域.RT-PCR检测结果显示:Akt1mRNA在垂体、心脏、肝脏、脾脏、肌肉组织中高表达,在大脑、小脑、肾脏表达丰度较低.Akt2则在小脑、垂体、心脏、肝脏、脾脏和肌肉组织中高表达,而在大脑和肾脏中表达丰度较低.     

家猪STAT1的基因克隆、剪接变体鉴定及组织表达研究

以长白猪(Landrace)cDNA为模板, 克隆STAT1基因cDNA全长.家猪STAT1基因cDNA全长编码757个氨基酸的前体蛋白, 与人、大鼠、小鼠、牛等哺乳动物的STAT1氨基酸序列一致性分别为95％、908％、896％、916％; 同时, 本研究亦鉴定到家猪STAT1的3种剪接变体(分别命名为STAT1 sv1, STAT1 sv2, 和STAT1 sv3).采用RT PCR方法, 进一步检测了STAT1及其3种剪接变体在成年家猪各组织中的表达情况.STAT1和两种剪切变体(STAT1 sv2 和STAT1 sv3)在家猪组织中广泛表达, 而剪接变体STAT1 sv1则在肺和脾脏中有较高表达水平.     

一个与鸭繁殖性能相关卵巢差异表达基因的分离分析

本文用mRNA差异表达显示技术,分离分析了繁殖准备期金定鸭(Anas platyrhynchos domesticus)和绿头野鸭(Anas platyrhynchos)卵巢差异表达基因.通过卵巢组织RNA提取、反转录、mRNA差异显示PCR扩增、PAGE和银染检测扩增产物、差异带回收纯化、T载体连接转化和克隆测序分析,获得一个可能与鸭繁殖性能有关的卵巢差异表达基因片段,片段大小882bp.同源性分析表明,其序列与发情期羊卵巢cDNA(同源性为96%)、褐家鼠睾丸cDNA(同源性为83%)有很高的同源性.基因家族摸体分析表明,该序列的部分片段分别与Sox-5基因、转录因子USF基因、性别决定因子SRY、Cdx A基因都有90%以上的同源性典型摸体.由上述分析,我们推测该cDNA片段与鸭繁殖性状有关.     

蒙古鮊ob基因的克隆与组织表达特异性的初步研究

根据已知的人和鼠ob基因序列设计引物,通过运用RT-PCR技术首次从蒙古鮊脂肪组织的RNA中扩增获得ob基因片段,并经序列分析证实为ob基因编码区438 bp的序列.不同物种同源性比较表明ob基因序列具有很高的保守性:蒙古鮊与人、猪和鼠的ob基因核苷酸编码序列的同源性分别为82.9%、84.0%和99.1%;蒙古鮊ob基因编码的蛋白leptin氨基酸序列与人、猪和鼠氨基酸同源性分别为80.8%、78.8%和95.9%.用RT-PCR技术分析组织ob基因的表达特异性,结果表明:ob基因在脂肪和肝脏组织中的表达量最大,在心脏、脾脏、肌肉、脑、卵巢中的表达量次之,在肾脏中仅微量表达,而在精巢和肠道组织中则不表达.     

人RS21-C6基因的克隆及其原核表达

从小鼠胸腺细胞克隆的新基因RS21-C6的cDNA648bp与人表达序列标签(EST)数据库进行同源性比较,得到71个EST片段,通过EST拼接获得一致性序列,经设计引物,并采用RT-PCR方法,从人新生儿脐带血单个核细胞、肝脏、淋巴结及Jurkat细胞系cDNA中扩增出一700bp的片段,利用快速扩增cDNA末端(RACE)方法,扩增其5′和3′端序列,得到此基因的全长序列(1118bp),其中包含一个513bp的开放阅读框,编码170个氨基酸.该基因在核酸水平与小鼠基因的同源性为83%,其演绎蛋白水平的一致性为75%,相似性为83%.此基因的GenBank登录号为AF210430.此外,已成功表达此基因的谷胱甘肽巯基转移酶(GST)-RS21-C6融合蛋白,其表达量占总菌体蛋白的32.5%.     

猪Akt3基因克隆、序列分析及组织表达图谱研究

本研究以长白猪(Landrace)肌肉cDNA为模板,克隆得到长白猪Akt3基因.序列分析结果显示:长白猪Akt3基因cDNA全长1493bp,编码一个含479个氨基酸的前体蛋白,与人、牛、小鼠和大鼠的氨基酸序列一致性分别为100%、100%、99.58%、99.79%,具有高度保守性.氨基酸结构分析显示,长白猪Akt3基因都具有典型的Pleckstrin homologous domain(PH)结构域和丝氨酸/苏氨酸磷酸化激活位点.组织表达图谱分析结果显示:Akt3基因在所有检测的家猪组织中均有表达.此外,本研究还将Akt3基因编码区序列克隆转入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,为下一步功能验证做准备.     

一个与油菜黄化相关的未知功能基因克隆及表达

以构建的油菜幼叶黄化突变体Cr3529消减文库中一个未知功能的差异表达基因片段为基础,应用RACE-PCR技术,扩增并克隆到两个cDNA全序列,分别命名为BnCr4和Bn-Cr4-1.测序结果显示,BnCr4编码区序列大小为1395 bp,编码465个氨基酸,而BnCr4-1编码区序列长1311 bp,编码437个氨基酸.BLAST结果表明它们与拟南芥中的一个未知功能基因的cDNA同源性分别为87%和80%.功能预测显示它们含有与蛋白质的修饰作用有关的多个活性位点,如磷酸化、糖基化、酰胺化以及磷酸泛酰巯基乙胺结合位点,可能是一种新的与cAMP介导的蛋白质磷酸化与去磷酸化作用有关的蛋白.Northen杂交结果显示该基因在Cr3529子叶期和幼叶期的表达高于野生型油菜,显示该基因的表达与突变性状紧密相关.最后,原核表达了BnCr4,得到了与预计分子量相同的融合蛋白.     

猪色素上皮衍生因子的电子克隆及序列分析

用鼠的色素上皮衍生因子cDNA序列在猪的ESTs库进行BLASTn搜索,得到一系列不同大小的ESTs片段,经拼接得到完整cDNA序列.序列分析显示该cDNA长1 425 bp,有一个1 242 bp的开放阅读框,编码413个氨基酸,5’非编码区长53 bp,3’非编码区长130 bp,有一个加尾序列和多聚腺苷酸尾巴.其核苷酸序列与牛、人和鼠的同源性分别为89%、87%和82%,氨基酸的同源性分别为89%、87%和84%,且有保守的糖基化位点、半胱氨酸位点和serp in基序,说明所克隆的cDNA序列为猪的PEDF全长cDNA.     

小麦(Triticum asetivum L.)杂交种下调表达的GTP结合蛋白基因TaRab的克隆与鉴定

杂种优势的形成与杂种一代中亲本基因的表达方式改变有关.为深入研究小麦杂种优势形成的分子机理,利用通过抑制性差减杂交(SSH)方法获得的小麦Rab类GTP结合蛋白基因片段为探针,筛选普通小麦品系3338三叶期叶片cDNA文库,获得了一个小麦Rab家族基因TaRab.同源性比较和序列分析显示,该基因与拟南芥Rab类GTP结合蛋白基因具有90%氨基酸序列相似性.结构分析表明,它具有GTP结合蛋白4个典型结构以及Rab家族成员特有的YYRGA结构域.半定量RT-PCR表达检测结果显示,TaRab基因在叶片的表达水平要高于其他组织器官.研究还发现,该基因在三叶期、分蘖盛期的根系和叶片中为杂种下调表达.采用电子定位方法,将TaRab基因初步定位在7B染色体的着丝粒区域和C-7DS5-0.36两个区域.在此基础上,对Rab蛋白基因差异表达与杂种优势表现的关系进行了讨论.     

猪PSMD13基因的克隆与表达谱分析

为了研究猪PSMD13基因功能,采用SMART-RACE技术对猪PSMD13基因5′和3′端进行扩增,并对其进行序列分析和组织表达分析。结果表明,得到猪PSMD13基因全长1476bp的cDNA序列,其基因编码376个氨基酸,与人、小鼠、蛙、鲐鱼的PSMD13氨基酸序列分别有97%、94%、77%、85%的同源性,含有1个PINT保守结构域和1个类似的PCI domain结构域,无信号肽序列。组织表达分析结果表明,猪PSMD13在背最长肌、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、卵巢、子宫、睾丸、胚胎和脂肪等组织均有表达。     

重组小鼠14-3-3蛋白theta亚型的构建

目的 克隆编码14-3-3蛋白质θ亚型的cDNA,制备该蛋白质的基因重组蛋白质.方法 参照小鼠14-3-3蛋白质θ亚型mRNA结构设计引物,以小鼠脑总RNA为模板,RT-PCR法克隆编码14-3-3蛋白质θ亚型的cDNA,插入原核表达质粒pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21(DE3)使其表达谷胱甘肽S转移酶(GST)为标签的融合蛋白质,以凝血酶定点分解融合蛋白并采用Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化目的 蛋白.结果 RT-PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离可见约800 bp条带,序列分析表明重组质粒pGEX-1433theta中的插入子为738 bp,编码245个氨基酸,其核苷酸及氨基酸序列与Pubmed NM-011739展示的结果一致.重组质粒pGEX-1433theta在BL21(DE3)中的表达量随IPTG诱导时间递增,融合蛋白质为可溶性组分.亲和层析纯化的14-3-3theta在SDS-PAGE上表现为单一条带,表观相对分子质量为30 ku.每L培养菌液可收获4mg基因重组型小鼠14-3-3theta.结论 克隆了编码小鼠14-3-3蛋白质θ亚型的cDNA,制备了高纯度基因重组型小鼠14-3-3theta,为进行单克隆抗体的制备奠定了坚实的基础.