人免疫球蛋白受体FcγRⅡa的基因克隆及在K562细胞的表达

目的 将外源人免疫球蛋白IgGFe段Ⅱ型受体CD32a分子表达于K562细胞表面，为构建人工抗原递呈细胞提供蓖要前提。方法 自U937细胞RTPCR得到CD3h的cDNA基因，与T载体连接后亚克隆入表达载体pcDNA3．1（＋）。经测序后利用脂质体介导的转染将CD32a分子表达在K562细胞的表面。结果 构建的T载体测序后，Genebank比对证实为CD32a的cDNA分子，免疫荧光和流式细胞仪结果均说明CD32a分子在K562细胞得到表达（96．9％）。结论 获得的人工构建的表达人免疫球蛋白IgGFe受淬的K562细胞。完成人工抗原递呈细胞制备的首要步骤。     

人免疫球蛋白受体FcγRIIa的基因克隆及在K562细胞的表达

目的将外源人免疫球蛋白IgGFc段Ⅱ型受体CD32a分子表达于K562细胞表面,为构建人工抗原递呈细胞提供重要前提。方法自U937细胞RT-PCR得到CD32a的cDNA基因,与T载体连接后亚克隆入表达载体pcDNA3.1(+)。经测序后利用脂质体介导的转染将CD32a分子表达在K562细胞的表面。结果构建的T载体测序后,Genebank比对证实为CD32a的cDNA分子,免疫荧光和流式细胞仪结果均说明CD32a分子在K562细胞得到表达(96.9%)。结论获得的人工构建的表达人免疫球蛋白IgGFc受体的K562细胞,完成人工抗原递呈细胞制备的首要步骤。     

S3核糖体蛋白基因的过表达与K562/DOX细胞耐药性的关系

目的 观察S3核糖体蛋白（S3rp)基因表达的改变对白血病耐药性的影响。通过RT－PCR方法获得含S3rp基因完整开放阅读框架（ORF）的cRNA，并将其克隆到pGEM-T Easy载体里，然后通过亚克隆方法将pGEM-T Easy重组质粒里的S3rp cDNA片段克隆到真核表达载体pcDNA3.1( )中，分别构建正向插入和反向插入的S3rp cDNA重组质粒，进行基因转染。将正义S3rp cDNA真核表达质粒转染K562细胞，使其S3rp基因表达增加，观察其对化疗药物敏感性的改变；将反义S3rp cDNA真核表达质粒转染具有多药耐药（MDR）表型的K562／DOX细胞，阻碍其S3rp基因的表达，观察其对化疗药物耐药性的改变。结果 转染正义S3rp cDNA真核表达质粒后，K562细胞对阿霉素的耐药性比未转染的K562细胞增强5．8倍；转染反义S3rp cDNA真核表达质粒后，K562／DOX细胞对阿霉素的耐药性比未转染的K562／DOX细胞降低69％。结论 S3rp基因过表达在K562／DOX细胞耐药性的形成中起重要作用。     

HLA-E真核表达载体的构建及其在K562细胞中的表达与鉴定

本研究旨在亚克隆HLA-E真核表达载体，并使其在HLA-I类阴性的靶细胞K562细胞上获得稳定表达。首先采用PcR方法从多顺反子表达载体(pG/A2E)扩增出目的片段A2／ E cDNA，与真核表达载体pcDNA3．1( )重组，构建成HLA—E真核表达载体pcDNA3．1( )／A2E，然后采用脂质体转染的方法将重组质粒转入K562细胞，最后经G418筛选及有限稀释，利用抗HLA-E特异的单克隆抗体K0126-3进行FACS检测，以观察HLA—E分子在靶细胞表面的表达情况。结果显示，HLA-E分子在经pcDNA3．1( )／A2E转染的靶细胞表面获得表达(27．76％)，而经空载体pcDNA3．1( )转染的靶细胞则未获得表达。结论：成功构建了pcDNA3．1( )／A2E真核表达载体，并使HLA-E分子在HLA-I类阴性的K562细胞表面表达，为进一步研究HLA-E作用的分子机制以及探索HLA-E与NK受体之间的相互作用和HLA-E体外表达对NK细胞功能的影响奠定了基础。     

RHD基因不同转录子表达载体的构建

RHD基因存在多种不同的另路剪接的转录子,本研究分别构建正常mRNA及DEL9和DEL89转录子的表达载体。从Rh(D)阳性新生儿脐血网织红细胞中提取总RNA,分别采用一步法和两步法RT-PCR获取完整目的转录子片段,然后分别克隆至pCR4 TOPO测序载体并测序验证和筛选。用正常RHD cDNA筛选质粒为模板,PCR扩增全长目的基因,然后亚克隆至pcDNA3.1/V5-His TOPO表达载体;DEL9和DEL89转录子直接克隆至表达载体,通过测序验证目的基因序列及插入方向。结果表明,序列分析证实了不同目的基因片段序列和方向正确,表明3种不同RHD转录子的表达载体构建成功。结论:RHD不同转录子表达载体已成功构建,为进一步研究Rh(D)抗原膜表达机理奠定了基础。     

过表达HMGB1蛋白的K562稳定细胞株的建立

本研究目的建立过表达HMGB1蛋白的K562稳定细胞株(K562-HMGB1)及不表达该蛋白的对照细胞株(K562-pcDNA3.1),为研究hm gb1基因在白血病发生及进展中的作用与机制建立基础。从U937白血病细胞提取总RNA,逆转录合成cDNA。以cDNA为模板应用PCR技术扩增hm gb1编码基因,将其连接入PMD18-T vector(PMD18-T-HM BG1vector),并转化至大肠杆菌DH5a中。对氨苄青霉素筛选的阳性克隆进行扩增、质粒抽提,应用限制性内切酶KpnI/XhoI酶切鉴定,最终应用DNA测序得到序列正确的阳性克隆;然后将PMD18-T-HM BG1vector克隆中的hm gb1基因应用限制性内切酶KpnI/XhoI切出,并连接入真核表达载体pcDNA3.1(+),得到重组质粒pcDNA3.1-HM BG1。将pcDNA3.1-HM BG1、pcDNA3.1质粒分别电转染至K562细胞,电转染后48小时后加入终浓度800μg/m l的G418进行药物加压筛选,2周后得到有效转染pcDNA3.1-HM BG1及pcDNA3.1载体的K562细胞株(K562-HM BG1,K562-pcDNA3.1)。通过RT-PCR和W estern b lot技术分别在转录及蛋白表达水平检测K562稳定细胞株中HMGB1蛋白过表达情况,验证建立的K562稳定株的功能。结果表明,成功构建pcDNA3.1-HM BG1表达载体,并转染至K562细胞中,建立了过表达HMGB1蛋白的K562稳定细胞株(K562-HM BG1)。在转录及蛋白水平上验证了该稳定细胞株过表达HMGB1蛋白。结论:已成功建立了过表达HMGB1蛋白的K562稳定细胞株及对照细胞株即K562-HM BG1细胞及K562-pcDNA3.1细胞,为研究hm gb1基因在白血病发生及进展中的作用及机制建立了基础。     

HBVe抗原的构建及其在肝癌细胞中的表达

目的 构建含有HBV e抗原基因的pcDNA3真核表达载体,并在BEL7402肝癌细胞中表达与鉴定.方法 设计合成针对e基因片段的PCR引物序列,以pUC19/3HBV为模板扩增出HBeAg基因片段,克隆到真核表达载体pcDNA3的多克隆位点中,构建pcDNA-HBeAg真核表达载体.然后采用脂质体转染法将其转染人肝癌细胞系BEL7402肝癌细胞,分别运用逆转录PCR和ELISA在RNA水平和蛋白水平检测其在真核细胞中的表达.结果 所克隆HBV e抗原基因片段经测序完全正确;重组质粒转染BEL7402细胞后,检测有HBeAg表达.结论 成功构建pcDNA3-HBeAg真核表达载体,并在肝癌细胞中有效表达,为进一步体外研究HBeAg奠定基础.     

人regucalcin和红色荧光蛋白融合基因的构建及表达

目的:构建人regucalcin(RGN)全长cDNA的真核表达载体pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo,观察RGN及红色荧光蛋白(DsRed)在人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2细胞)中的表达。方法:RT-PCR技术扩增获得人HK-2细胞RGN全长cNDA,将扩增的产物进行T-A克隆,经酶切、DNA测序鉴定正确,将RGN基因酶切后构成pDsRed-RGN,再将RGN基因与DsRed一起酶切构建成pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo的真核表达重组质粒。用脂质体将重组质粒转染入HK-2细胞,激光共聚焦显微镜观察重组质粒的表达情况。结果:RT-PCR扩增获得人HK-2细胞,其RGNcDNA全长897bp,构建完成真核表达重组质粒pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo,经DNA测序与GenBank中的人RGNcDNA序列一致。经zeocin(zeo)筛选获得稳定表达重组质粒的单克隆细胞株。激光共聚焦显微镜观察到转染重组质粒的细胞中有红色荧光蛋白的表达。结论:本实验成功构建了pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo真核表达质粒,并发现其在HK-2细胞中表达。     

日本血吸虫(中国大陆株)14-3-3信号蛋白的真核表达

目的从日本血吸虫成虫cDNA中扩增出信号蛋白Sj14-3-3编码基因，并亚克隆至真核表达载体pcDNA3．1( )，旨在制备重组诊断抗原和分子疫苗。方法提取日本血吸虫成虫总RNA，分离mRNA，RT-PCR法制备cDNA．并扩增出Sj-4-3-3编码基因，通过线性TA克隆载体pGEM-T连接，亚克隆至真核表达载体pcDNA3．1( )，经转染至COS-7细胞中表达，Western blotting鉴定。结果RT-PCR产物、pGEM-T-Sj14-3-3及pcDNA3．1( )-Sj14-3-3分别经双酶切后均获得一特异性基因片段，经SDS-PAGE及Western blotting鉴定后的分子量为29kD。结论真核表达重组质粒pcDNA3．1( )-Sj14-3-3在COS-7细胞中的表达产物是一分子量为29kD的蛋白，并能被抗Sj14-3-3单克隆抗体识别。     

S100A4基因载体的构建及其在人胃癌细胞系中的表达

目的 克隆S100A4 cDNA,构建pcDNA3.1-S100A4重组表达载体,转染胃癌细胞系MKN1,观察S100A4在胃癌细胞中的表达情况。方法 Trizol法提取人胃上皮细胞GES-1的总RNA,逆转录反应获得含S100A4基因的cDNA。聚合酶链反应GenBank获得S100A4基因序列,并设计引物,利用聚合酶链反应(PCR)扩增出分子量为327 bp的产物。构建pMD18-T simple-S100A4重组质粒,转化JM109菌。菌液测序成功后,提取质粒,进行BamHⅠ/HindⅢ双酶切,酶切产物回收纯化,连接表达载体pcDNA3.1,构建pcDNA3.1-S100A4真核表达载体。利用脂质体介导转染方法将纯化的表达载体转染到胃癌细胞系MKN1中,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染后MKN1细胞中S100A4 mRNA表达水平。结果 PCR产物连接克隆载体的测序结果与GenBank公布的无突变序列一致,HindⅢ/BamHⅠ双酶切可以成功构建真核表达载体pcDNA3.1-S100A4;在胃癌细胞系MKN1中转染pcDNA3.1-S100A4表达载体,以转染pcD...     

导入外源MGMT cDNA增加K562细胞对尼氮芥的耐药性

骨髓抑制是限制氯乙基亚硝脲类药物(CENUs)化疗剂量的关键因素。本实验以K562细胞作为骨髓细胞的转基因模型,把人MGMT cDNA构建到逆转录病毒载体并转导K562细胞,观察细胞在转导前后的MGMT基因表达水平及其对尼氮芥[1-(4-amino-2-methyl-5-pyrimidinyl)methyl-3(2-chloroethyl)-3-nitrosourea,ACNU]耐药性的变化。结果表明转导细胞K562-MGMT~ 的MGMT基因表达水平有显著的提高,对ACNU的耐药性也较转导前的K562细胞有大幅度提高。实验提示,用基因转移的方法使骨髓细胞大量表达MGMT基因,有可能增加骨髓细胞对CENUs的耐药性,防止CENUs引起的骨髓抑制。     

转导野生型p53的K562细胞出现生长抑制和凋亡

把重组有编码野生型p53的逆转录病毒载体转导到p53蛋白缺失的K562细胞,以观察野生型p53蛋白在K562细胞表达后对K562细胞增殖和凋亡的影响。应用RT-PCR和Western印迹杂交方法检测K562细胞p53表达,应用流式细胞仪计数检测细胞的增殖,采用梯形DNA和细胞形态学方法检测细胞凋亡变化。研究结果表明:感染pLXSN-p53病毒24小时后,K562细胞p53表达阳性,K562-p53细胞的生长受到抑制,少数细胞进入凋亡状态。结论提示,野生型p53可促进p53表达阴性的K562细胞生长抑制与凋亡。     

酪氨酸激酶抑制剂对转染p15基因的K562细胞的作用

本研究探讨酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼（imatinib）和p15基因克隆联合作用对K562细胞的增殖、细胞周期及凋亡等的调控作用。用RT—PCR扩增p15基因，胶纯化回收后连接到T载体测序，确认序列正确后构建p15-pcDNA3．1载体，将p15-pcDNA3．1与空载体分别以脂质体转染入p15基因突变的K562细胞，经筛选得到G418抗性的K562细胞株；用Western blot检测转染后P15蛋白的表达；用肌法测定细胞存活率；流式细胞术检测细胞周期和凋亡。结果表明：从对照K562细胞中扩增的DNA片段，在第174—180位点有7个碱基缺失，这证实对照K562细胞中p15基因部位基因缺失。表达外源性P15蛋白的p15-pcDNA3．1-K562细胞株生长速度明显慢于对照K562细胞株；流式细胞术显示G0／G1期细胞增多，S期细胞明显减少；p15-pcDNA3．1-K562细胞与伊马替尼联合应用后凋亡细胞比例明显上升，册法显示细胞存活率较对照细胞明显下降。结论：表达外源P15蛋白联合应用伊马替尼对抑制K562细胞增殖及促凋亡方面具有协同作用。     

RNA特异性干扰bcr-abl融合基因联合p27基因克隆对K562细胞的影响

本研究旨在探讨RNA干扰抑制慢性髓系白血病bcr-abl融合基因表达,以及RNAi和p27基因克隆联合作用对K562细胞的细胞增殖、细胞周期及凋亡等的调控作用。以细胞系K562为研究对象,合成并转染针对K562细胞bcr-abl融合基因融合位点的21nt siRNA,应用Northern blot法检测bcr-abl融合基因的表达,Western blot法检测BCR-ABL蛋白及凋亡相关蛋白BCL-xL的表达;同时应用RT-PCR扩增p27基因,构建P27-pcDNA3.1载体,转染p27基因入缺失p27基因的K562细胞,经筛选得到G418抗性的K562细胞株;经Western blot证实有P27蛋白表达后,联合应用RNA干扰及p27基因克隆,通过MTT法及流式细胞仪等检测联合作用后对K562细胞的细胞增殖、细胞周期及凋亡等的调控作用。结果表明,RNA干扰组K562细胞bcr-abl融合基因的表达水平明显下降,转染24小时时有18.4%的K562细胞发生凋亡,细胞凋亡相关蛋白BCL-xL的表达水平下调,出现明显的G1期阻滞;表达外源性P27蛋白的P27-pcDNA3.1-K562细胞株生长速度明显慢于对照K562细胞株。流式细胞仪检测显示,G0/G1期细胞增多,S期细胞明显减少;RNA干扰与p27基因克隆联合作用于K562细胞后,凋亡细胞比例明显上升(33.4%)。MTT法显示,细胞存活率较单纯p27-K562细胞组及RNA干扰-K562细胞组均明显下降(p0.01和p0.05)。结论:特异性siRNA分子可以抑制bcr-abl融合基因的表达,诱导K562细胞分化或凋亡。RNA干扰联合p27基因克隆对抑制K562细胞增殖及促凋亡方面具有协同作用。     

CML28树突状细胞核酸疫苗的构建及其表达研究

为了构建负载CML28的核酸疫苗，并在树突状细胞中进行表达，用分子克隆的方法，从K562细胞中克隆出CML28的cDNA全长，将其亚克隆至pGEM—T载体，经测序后酶切，克隆至真核表达载体pcDNA3．1HisA，将重组质粒pcDNA3．1HisA—CML28进行酶切分析和测序鉴定；从正常人外周血中分离外周血单个核细胞（PBMC），在IL-4和GM—CSF条件下诱导分化为树突状细胞（DC），并进行鉴定；用电穿孔的方法将重组质粒pcDNA3.1 HisA—CML28导入到DC中，Western Blot检测His-CML28融合蛋白的表达。结果表明：经酶切分析和测序鉴定，重组质粒pcDNA3.1 HisA—CML28含有正确的CML28全长序列；经电穿孔导入Dc后，重组质粒能表达His—CML28蛋白。结论：成功构建了CML28树突状细胞核酸疫苗。     

p16基因克隆联合伊马替尼对慢性粒细胞白血病K562细胞作用的研究

目的：探讨p16基因克隆联合伊马替尼对慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞的增殖、周期及凋亡等的调控作用。方法：RT-PCR扩增p16基因，胶纯化回收后连接到T载体测序，序列正确后构建p16-pcDNA3．1载体．将p16-pcDNA3、1与空载体分别以脂质体转染入p16基因缺失的K562细胞。经筛选得到G418抗性的K562细胞株．Westernblot证实转染后有p16蛋白表达。MTT法检测细胞存活率，流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。结果：反复测序发现，从K562细胞中扩增的DNA片段属于非特异性扩增。证实K562细胞中p16基因缺失。转染p16基因后表达外源性p16蛋白的p16-pcDNA3、1-K562细胞株生长速度明显减慢；伊马替尼作用于已转染p16-pcDNA3、1的K562细胞．其细胞存活率与伊马替尼作用未转染K562细胞及单纯转染p16-pcDNA3．1的K562细胞相比均明显降低。转染p16基因后G0／G1期细胞增多，S期细胞明显减少，p16．pcDNA3．1-K562细胞与伊马替尼联合应用后凋亡细胞比例明显上升。结论：p16基因抑制K562细胞增殖并调节其周期，外源p16联合应用伊马替尼对抑制K562细胞增殖及促凋亡方面具有协同作用。     

真核表达质粒PcDNA3.1（＋）-带有白蛋白信号肽的Vasostatin（120-180aa）的构建及其在体内外细胞中的表达

目的构建真核表达质粒PcDNA3.1（＋）-带有白蛋白信号肽的Vasostatin（120-180aa）并了解其在体内外真核细胞中的表达。方法将带有白蛋白信号肽的Vasostatin（120-180aa）的逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）产物克隆至pcDNA3.1（＋）真核表达载体上,经酶切鉴定及测序分析证明构建成功后,以脂质体介导法转染体外培养的真核293T细胞及注射入鼠骨骼肌细胞中,了解其在体内外真核细胞中的表达情况。结果我们获取了包含带有白蛋白信号肽的Vasostatin（120-180aa）成熟肽及HA抗原在内的一段cDNA片段,并成功地与真核表达载体PcDNA3.1（＋）连接,经测序表明,其中含有的带有白蛋白信号肽的Vasostatin（120-180aa）成熟肽的序列与Genebank上报道的序列完全一致。即我们成功构建了真核表达质粒PcDNA3.1（＋）-带有白蛋白信号肽的Vasostatin（120-180aa）。之后,在转染了该质粒的体外真核293T细胞的上清液中及骨骼肌注射了该质粒的鼠血液中,利用Western-blot法检测到了目的基因的蛋白质。结论带有白蛋白信号肽的真核表达质粒PcDNA3.1（＋）-Vasostatin（120-180aa）增强了蛋白分泌表达能力,这为进一步应用该质粒治疗全身新生血管类病奠定了一定基础.     

kir3dl1启动子表达调控载体的构建及其在K562细胞中的活性

为了分析kir3dl1基因核心启动子区域的功能并明确其表达调控机制，构建了kir3dl1基因启动子．荧光素酶报告载体，分析其在K562细胞中的活性。采用PCR方法从含有kit3dl1基因转录起始位点5’侧翼区的质粒中扩增kir3dl1基因核心启动子序列，插入经Bg1II和NcoI双酶切的荧光素酶报告载体pGL3-Basic；采用阳离子脂质体SuperFect包裹荧光素酶报告重组子转染K562细胞，应用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性；采用MTT法检测脂质体-DNA复合物对细胞存活率的影响。结果表明：成功构建了含有254bp的kir3dl1基因核心启动子序列的荧光素酶报告重组子3DL1-luc254并通过酶切及基因测序方法的鉴定；荧光素酶报告重组子在K562细胞中的荧光素酶活性明显高于阴性对照，且荧光素酶活性、相对活性持续3天无明显衰减。转染了3DLl-luc254报告质粒的K562细胞存活率在76％-92％之间。结论：成功构建了kir3dl1基因启动子-荧光素酶报告载体，本研究采用的转染系统能够有效地在K562细胞中进行基因转染，kir3dl1基因核心启动子在K562细胞中具有较高活性。