过表达TaLEA1和TaLEA2基因提高转基因拟南芥的耐盐性

我国土壤盐碱化日益严重,对我国的粮食安全造成了严重威胁。耐盐基因挖掘对作物耐盐育种非常重要。LEA蛋白家族是一个多基因家族,在植物应对非生物胁迫中发挥重要作用。本课题组前期研究阐明小麦TaLEA1基因在拟南芥中过表达可以提高转基因植物的耐盐性和抗旱性。本研究系统分析了小麦TaLEA2基因表达蛋白的理化性质、基因表达模式及启动子功能区域,并在拟南芥中过表达TaLEA2基因及共表达TaLEA1和TaLEA2基因,分析TaLEA2基因的抗逆功能及2个LEA基因的抗逆效果。结果表明,TaLEA2基因的表达产物属于第3组LEA蛋白,是稳定的亲水蛋白,富含α-螺旋、β-转角等结构。TaLEA2基因在小麦根、茎、叶、花、种子等不同组织中均有表达,盐胁迫条件诱导其高表达。在拟南芥中过表达TaLEA2基因,或过表达TaLEA1和TaLEA2基因都能够提高转基因拟南芥的耐盐性和抗旱性,转基因株系的种子萌发率、根长及叶绿素含量显著高于野生型,且双基因过表达的转基因植物的抗逆能力高于单个基因过表达株系。本研究结果为LEA基因抗逆机理的研究和多基因共转提高植物抗逆性提供了重要信息。     

转TaLEA1基因丹参植株的耐盐与耐旱性

TaLEA1基因是一个从小麦中克隆得到的编码胚胎晚期丰富蛋白的基因,用农杆菌EHA105（含卡那霉素抗性基因表达载体PBI121-TaLEA1）介导的叶盘转化法将其转入丹参（Salviamiltiorrhiza Bunge）组织培养苗中,在50mg/L卡那霉素选择压下连续筛选,并扩繁和生根培养,获得了7个丹参转基因株系。经PCR扩增,初步验证得到6个阳性株系,再继代4次后,Southern杂交结果表明已获得了一个能稳定遗传的转基因株系。该株系在含1%NaCl和8%PEG6000培养基中的生长状态优于野生型,表明转入TaLEA1基因可改善丹参组培苗的耐盐和耐旱性。     

控制基因盐诱导且根系优势表达的小麦启动子Tasipro3克隆及功能分析

在土壤盐胁迫下,小麦根系吸收水分和营养物质的功能受到抑制,从而影响植株的经济产量。因而,开展小麦耐盐育种,提高根系耐盐性是重要途径之一。使耐盐基因在根系中优势表达,并且在盐胁迫下增强表达,将显著提高根系耐盐性。而克隆和鉴定具有双重控制功能的启动子,是实现耐盐基因精准调控的基础。鉴于此,本研究利用Genevestigator在线生物信息学分析软件,筛选到425个盐诱导根系优势表达的探针,并从中选出2个候选探针,用于启动子验证。以1周龄小麦品种中国春的幼苗为材料,将其根系置于200 mmol/L的NaCl溶液中,分别于0 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h和8 h进行根系取样,用于表达模式分析。结果表明,Ta.5463.1.A1_at探针的基因表达模式更符合生物信息学预测的结果,受盐胁迫诱导表达显著上调,且基因优势表达于根系。为进一步验证相应基因启动子的功能,对此探针对应的启动子区进行了克隆,并连接到启动子验证载体中,遗传转化获得转基因拟南芥植株。盐诱导后GUS染色的实验结果表明,该启动子使GUS报告基因在盐处理下表达量显著提高,且主要在根系表达。本研究成功克隆了耐盐遗传改良专用启动子,为小麦分子抗逆育种提供了优异资源。     

小麦分蘖角度TaTAC1基因同源克隆及表达分析

分蘖角度影响植物群体结构、光合效率以及植株的形态建成,最终影响其产量及品质。小麦中关于分蘖角度的研究鲜有报道。前人研究显示,水稻OsTAC1正向调控分蘖角度的大小,玉米Zm TAC1与叶片角度呈正相关。本研究的目的是解析Ta TAC1的表达模式并初步了解该基因的分子遗传机制及其与分蘖角度的遗传关系。本研究以CN16、SM969、Lan2399、SHW-1为材料,利用同源克隆分离获得Ta TAC1,利用生物信息学软件对Ta TAC1进行序列特征分析,应用实时荧光定量PCR对其表达模式进行分析,并进行Ta TAC1蛋白的亚细胞定位分析。结果显示,Ta TAC1长度约1.1~1.2 kb,包括780 bp的完整开放阅读框和320~370 bp的3'-UTR。Ta TAC1的c DNA序列分为2类,其中CN16-2、SM969-2的第10号碱基发生突变,引起终止子提前,导致Ta TAC1表达受阻;Lan2399-2和SHW-1-2在109~115碱基位置有"CGCGCG"片段插入,导致蛋白质β-折叠片减少。表达分析表明,Ta TAC1在分蘖期的叶鞘、茎高效表达,分蘖节其次,叶与根表达量最低。相关分析表明该基因在分蘖节各时期表达量与分蘖角度呈显著正相关,Pearson相关系数为0.677,其他组织表达量与分蘖角度无显著相关性。亚细胞定位分析显示Ta TAC1定位于细胞膜。从上述结果可以推测Ta TAC1在mRNA水平上正向调控分蘖角度,且可能参与生长素极性运输过程从而改变分蘖角度大小。     

小麦TaCO9基因的克隆及功能分析

为了明确TaCO9-1A基因在小麦生长发育中的具体调控机理,该研究以同源克隆的方法成功获得了大麦(Hordeum vulgare)光周期基因HvCO9在小麦(Triticum aestivum)中的直系同源基因TaCO9,并对其进行生物信息学分析、亚细胞定位、转录激活以及表达模式分析;利用农杆菌侵染法转化拟南芥,并对过表达株系进行表型分析。结果表明:(1)TaCO9包含2个外显子和1个内含子,CDS区全长876 bp,编码291个氨基酸,蛋白序列含有特有的CCT结构域,且在不同物种间高度保守。(2)生物信息学分析表明,TaCO9基因编码的蛋白质分子量约为30.7 kD,等电点为6.24;TaCO9的启动子区含有光响应、激素应答和胁迫应答等多种顺式作用元件。(3)亚细胞定位和转录活性分析表明,TaCO9主要定位于细胞核中,且具有转录激活活性。(4)qRT-PCR结果表明,TaCO9基因在各个组织中均有表达,叶片中的表达量最高;在光照14 h条件下TaCO9的表达量显著高于光照10 h和12 h条件下的表达量,且TaCO9在大粒小麦‘西农817’子房与籽粒中的表达量显著高于‘中国春’。(5)经潮霉素筛选成功获得3个转基因拟南芥株系;进一步功能鉴定结果表明,过表达转TaCO9基因拟南芥植株的开花期迟于野生型(对照)3~4 d,但角果和籽粒较野生型大。     

小麦EDR1基因的克隆、鉴定和表达

为了研究普通小麦(Triticum aestivum L.)中是否有EDR1途径存在,根据拟南芥EDR1基因及其同源物设计了一对兼并性引物,用来分离小麦的EDR1同源物.以用小麦叶片RNA合成的cDNA为模板进行RT-PCR扩增,获得了代表小麦EDR1基因(命名为TaEDR1)的627 bp长的cDNA片段(GenBank登录号:AY743662).此后,通过RACE技术成功地获得了编码959个氨基酸的全长TaEDR1基因的cDNA序列.TaEDR1的氨基酸序列与大麦EDR1(标记为HvEDR1)有92%的相同.在TaEDR1的羧基末端有一个高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶催化功能域.因为存在一个推测的核定位基序,这个蛋白可能在细胞核中起作用.首次提供了证明普通小麦中存在EDR1同源物的分子生物学证据.用半定量RT-PCR方法研究了接种小麦白粉病菌[Blumeria graminis(DC.)E.O.Speer f.sp.tritici Em.Marchal,Bgt]后叶片中TaEDR1基因的转录谱.结果表明,在接种白粉病菌后TaEDR1基因在叶片中的转录水平提高.组织特异性表达谱分析证明,小麦TaEDR1基因在叶片、茎、穗、根中均有表达.研究提示TaEDR1可能在小麦防卫应答反应中起作用.     

小麦耐逆基因-TaLEA2转化拟南芥的研究

研究小麦第3组LEA基因中T aLEA2对耐旱和耐盐性能的影响.将小麦第3组LEA基因T aLEA2连接在双元表达载体pB I121 C aM V 35S启动子下游,构建了能在植物中高效表达的载体pB I121-T aLEA2.通过农杆菌介导的真空渗透法,将其转入野生拟南芥中,经抗性筛选及PCR验证,获得T0代转基因植株,并用不同浓度的PEG 4000和N aC l对转基因拟南芥的耐逆性进行检测.结果表明,这些转基因植株可明显改进拟南芥在10%PEG及0.8%N aC l培养基上的生长状态.在实验条件下,转基因拟南芥的耐旱性及耐盐性均有所提高,提示T aLEA2基因在植物水分调节方面有重要作用.     

小麦TaEDR1基因dsRNAi表达载体的构建及遗传转化

从抗白粉病小麦(TriticumaestivumL.)品系99/2439中分离到一个编码促分裂原蛋白激酶激酶激酶的新基因TaEDR1。为了研究TaEDR1基因在小麦抗白粉菌(Blumeriagraminis(DC.)E.O.Speerf.sp.triticiEm.Marchal)反应中的作用,以单子叶植物高效表达载体pAHC25为基础载体,选择TaEDR1基因编码胞外结构域的、保守性低的cDNA区域作为RNA干扰的目标区段,将这个区段连接成一个反向重复序列(3′→5′//5′←3′),插入到玉米泛素高效启动子Ubi1的下游,构建成双链RNA干扰表达载体pAH-R-TER。利用花粉管通道技术,以高产小麦新品种“周麦18”为受体进行了遗传转化。T0代植株经PPT抗性鉴定、PCR扩增检测,获得了7个转基因植株,为研究小麦TaEDR1基因的功能奠定了基础。     

斑马鱼HO1基因的表达特征及功能研究

实验对血红素加氧酶1（HO1）在斑马鱼发育中的功能进行了研究。多重序列比对结果显示,斑马鱼HO1与哺乳类、鸟类及其他鱼类的HO1氨基酸序列的总体相似性为44.1%86.8%,血红素结合标签相似性为87.5%95.8%。对斑马鱼早期胚胎和成鱼各组织进行RT-PCR检测,结果显示HO1转录本母源存在,HO1 mRNA的表达水平在尾芽期前较低,到咽囊期迅速上升并稳定在较高水平。HO1基因在斑马鱼成鱼多个组织中均有表达,在肝脏、脾、鳃、肾中的表达量较高。WISH结果显示,HO1基因在斑马鱼胚胎的卵黄合胞层、眼和血液中的表达量较高。利用超表达和基因敲降技术发现,注射HO1 mRNA使HO1基因过表达对斑马鱼早期胚胎发育无明显影响。注射HO1 MO使HO1基因表达抑制可导致斑马鱼胚胎出现发育迟缓、围心腔水肿、尾部消失等不同程度的畸形。HO1 MO导致的斑马鱼胚胎发育异常可被HO1 mRNA回复。利用Real-Time PCR研究发现,HO1基因表达抑制可导致IGF1表达量显著下降,IGFBP1表达量显著升高。这些结果表明斑马鱼HO1基因可通过调节IGF信号途径调控胚胎的正常发育。       

水稻OsRab7耐盐功能的初步鉴定及其表达载体的构建

Rab7是一个GTP结合蛋白,隶属于Rab家族,该家族在调控膜泡的运输、结合以及细胞内膜结构的组织中行使重要作用。本实验通过RT-PCR技术从盐敏感水稻品种‘日本晴’(‘Nipponbare’)获得了OsRab7基因全长序列,成功构建了原核表达载体pET-32a-OsRab7。在IPTG诱导下,该蛋白高效表达,并明显缓解了高盐环境(4.5% ～8.5% NaCl)对大肠杆菌的生长胁迫。为进一步研究该基因的功能,将OsRab7在大肠杆菌中的表达蛋白纯化,并利用p1301B(pCAMBIA1301改造载体)构建了植物表达载体,成功转化来源于水稻株系‘中花11’(盐敏感)的愈伤组织,为探讨其在水稻中的表达模式和功能分析及应用于水稻耐盐品种的改良奠定了一定的基础。     

费尔干猪毛菜病程相关蛋白基因（SfPR-1）的克隆及在盐胁迫下的表达分析

利用抑制消减杂交法从藜科猪毛菜属盐生植物费尔干猪毛菜（Salsola ferganica）中分离得到了一个盐胁迫响应的cDNA片段,结合SMARTTMRACE技术获得了费尔干猪毛菜病程相关蛋白基因的cDNA,命名该基因为SfPR-1（GenBank登录号：JQ670917）。序列分析表明,SfPR-1长817 bp,含有501 bp的阅读框、65 bp的5＇-UTR和251 bp的3＇-UTR,编码166个氨基酸,分子质量为18.01 kD,理论等电点为9.37。通过BLAST同源序列比对分析,结果显示该基因编码的蛋白与已知甜菜、拟南芥、烟草及玉米的病程相关蛋白PR-1同源性分别为73.6%、57.8%、55.5%和53.9%,且具有PR-1家族特有的6个半胱氨酸保守结构域。半定量RT-PCR和实时荧光定量RT-qPCR分析表明,该基因在盐胁迫后表达呈明显上调,初步推测病程相关蛋白基因SfPR-1可能与费尔干猪毛菜的耐盐性相关。     

人脂素基因LIPIN1在酵母中的异源表达及细胞功能分析

脂类代谢调控是维持生物体能量平衡的重要环节,脂类代谢调控的紊乱与肥胖症、糖尿病和高血压等疾病密切相关。脂素基因三LIPIN1是诱导脂肪细胞分化、调控脂类合成的关键基因．其编码的磷脂磷酸酶（phosphatidate phosphatase,PAP）在人体三酰甘油合成中起关键作用,是维持人体脂类平衡的重要保障。此外,该基因还作为重要的转录辅激活因子参与多种生长及营养代谢调控。多种生物中均有类似功能的基因被发现,暗示了其功能的多样性及物种间的保守性。该文利用酿酒酵母在脂类代谢研究中性状易于表征、同源基因剧刖功能明确的优势,通过同源重组技术构建脂素缺陷型酵母,探索脂素基因在维持酵母正常生长及脂类合成中的重要作用,并通过功能互补及生物信息学技术对比分析了人源LIPIN1基因与酵母PdH1基因编码蛋白在结构和功能上的保守性,为脂素基因LIPIN1的细胞功能研究提供基础数据。     

转TaLEA基因小黑杨无性系生长性状变异研究

以6年生的10个转TaLEA基因和1个非转基因小黑杨无性系为材料,对其生长量、干形、叶片性状、皮孔性状等15个指标进行测定分析。方差分析与遗传参数计算结果表明：11个小黑杨无性系间各性状达极显著差异水平（P＜0.01）,各指标表型变异系数处于1.92%~39.98%,遗传变异系数与表型变异系数接近,重复力处于0.621~0.987,表明基因的转入对无性系各性状的生长有一定的影响,但这种影响主要由遗传因素控制。表型相关分析结果表明转基因小黑杨生长量与干形性状、叶片性状、皮孔性状均呈不同程度的相关性,表明多指标共同作用,控制植株生长发育;利用综合评定法,当入选率为10%,初步选出XL-1和XL-9等2个优良无性系,2个无性系的树高、胸径分别比CK高16.55%和15.38%,比平均值高13.38%和19.46%,遗传增益分别为12.18%和17.42%。本研究为转基因杨树的良种选育提供重要的理论依据。     

过量表达大叶补血草LgNHX1基因对拟南芥耐盐性的影响

利用植物表达载体pCAMBIA1301和农杆菌GV3101将LgNHX1(全长1 656 bp)基因在拟南芥中过量表达.在含30 mg/L潮霉素的培养基上筛选获得LgNHX1的纯合转化子,并对其进行了分子鉴定和耐盐性分析.结果显示,经PCR和RT-PCR鉴定,野生型植株(对照)没有出现扩增条带,而转基因株系有相应的扩增条带,表明LgNHX1的确已经整合到拟南芥的基因组中,并已正常转录.在不同盐浓度处理下,转基因株系生长情况好于野生型对照;转基因植株地上部分和根的干重、鲜重相对高于野生型对照,但差异没有达到显著水平;当盐浓度达到150-200 mmol/L时,两个特基因株系的Na+含量显著高于野生型,K+含量极显著高于野生型.以上结果表明,过量表达LgNHX1基因可能增强了拟南芥将Na+区隔化至液泡的能力,提高了转基因拟南芥的耐盐能力.     

表达肌醇甲基转移酶基因载体的构建及转基因烟草的耐盐性研究

构建了肌醇甲基转移酶（Imtl）基因的植物表达载体pDH5．通过农杆菌（Agrobacterium）介导,获得了转基因烟草（NicotianatabacumLev．SR1）植株,在附加1．2％－1．5％NaCl的生根培养基MSr（MSO＋3g／L蔗糖＋7g／L葡萄糖）上可生根。生化分析表明,不具有芒柄醇（D－ononitol）合成途径的烟草鲜叶片积累了100－654nmol／g的芒柄醇,新产生了一个代谢分支。Western杂交分析证明Imtl基因在烟草中的表达,从而为植物耐盐的基因工程育种提供了一条新途径。     

小麦胁迫相关基因W1的克隆及表达模式分析

应用噬菌体原位杂交技术从干旱胁迫诱导的小麦cDNA文库中克隆到一个胁迫诱导的基因片段别。删全长cDNA为901bp,其中,编码区长498bp,编码166个氨基酸。Southern杂交表明,W1是一个低拷贝基因。RT—PCR结果表明,W1受干旱、低温的诱导,但不受高盐的诱导。氨基酸序列分析发现W1有一个USP保守区（pfam00582）。同源性分析发现W1与一个水稻胁迫诱导蛋白（NM_001061239）的同源性为83％,但该类蛋白的功能尚无报道。肼是小麦第1个被克隆的胁迫相关蛋白基因,该基因的克隆有助于阐明小麦的抗逆机制,并为今后培育抗逆性小麦品种提供候选基因。     

Expression of a sweet cherry DREB1/CBF ortholog in Arabidopsis confers salt and freezing tolerance

Dehydration responsive element binding protein 1 (DREB1)/C-repeat binding factor (CBF) induces the expression of many stress-inducible genes in Arabidopsis. We have previously reported the identification of three DREB1/ICBF homologs from sweet cherry (Prunus avium). To identify the function of these homologs, one of the genes, CIG-B, was transformed into Arabidopsis. In one of the transgenic plant lines, the DREB1/CBF target gene cor15a was induced in the absence of stress treatment. The cor15a-overexpressing transgenic plant exhibited mild growth retardation and had greater salt and freezing tolerance than did the wild-type and the transgenic lines in which cor15a was not induced. These results suggest that this sweet cherry DREB1/CBF homolog has a function similar to that of DREB1/CBF.