碳酸盐碱、pH对中国对虾幼虾的致毒效应

实验结果表明,ｐＨ为８．６、９．０、９．３和９．５时,中国对虾（Ｐｅｎａｅｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）幼虾２４ｈ半致死碱度（ＬＣ５０）分别为２２．００、１１．６６、６．５７和３．２８ｍｍｏｌ／Ｌ;随着碱度、ｐＨ的升高,中国对虾幼虾的存活率下降。碱度和ｐＨ对幼虾的致毒效应应具综合作用,ｐＨ８。６～９．０时,ＨＣＯ３＾－、ＣＯ３＾２－共同影响幼虾的存活率;ｐＨ９．０～９．５时,ＯＨ＾－协同ＣＯ３＾２－影     

碳酸盐碱度胁迫下凡纳滨对虾基因的差异表达

以广盐性养殖的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)为研究对象,采用抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)和定量PCR的方法,研究其在高碳酸盐碱度胁迫下转录组水平的基因表达差异,以期从基因组水平研究对虾对高碳酸盐碱度胁迫的适应机制。结果表明,以高碳酸盐碱度(20 mmol/L)胁迫第4天凡纳滨对虾鳃组织和低碱度(2 mmol/L)对照组鳃组织为材料,通过斑点杂交筛选,发现鳃组织中有158个克隆子表达上调,291个克隆子表达下调。挑选150个高表达差异的克隆子进行测序,获得100个序列,其中50个得到成功注释。经过GO分析,这些注释的差异基因主要分为8大类群,其中碳酸酐酶基因(CA)、Na+-K+-ATPase基因(NKA-α)等与离子调控相关的基因表达量上调,而溶菌酶基因等与先天免疫相关的基因表达量下调,这些结果表明高碳酸盐碱度胁迫下,凡纳滨对虾以增加离子调控的方式进行酸碱平衡的调控,同时其免疫功能受到抑制。此外,还对CA和NKA-α两个基因在鳃和触角腺中的时空表达规律进行了研究,发现高碳酸盐碱度胁迫9 d过程中,两个基因在鳃组织中的表达均呈现先高表达后回落的现象,而在触角腺中NKA-α基因则一直维持较高表达水平,说明CA和NKA-α基因在凡纳滨对虾高碳酸盐碱度适应离子调控中起着关键作用,同时还发现除了鳃组织之外,触角腺同样参与了调控。本研究从转录水平初步筛选了高碳酸盐碱度胁迫下凡纳滨对虾的表达差异基因,探索了凡纳滨对虾的耐盐碱机制,对培育适于盐碱地水产养殖的优良品种有着重要的意义。     

中国对虾V-ATPase c亚基基因的克隆及其在高pH胁迫下的表达分析

采用RACE技术克隆了中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)V-ATPase c亚基基因,命名为FcVHA-c基因,检测该基因在高pH胁迫下的基因应答,并采用RNAi技术验证其功能。基因分析表明, FcVHA-c基因cDNA全长为2128 bp,开放阅读框483 bp,编码160个氨基酸,预测蛋白分子量为16 kD,理论等电点7.82,具有4个跨膜结构域。同源性和系统进化分析表明, FcVHA-c具有较高的保守性,其中与南美白对虾(Penaeus vannamei)同源性最高,为99%,与南美白对虾首先聚为一支。组织表达分析显示, FcVHA-c基因在中国对虾各个组织中均有表达,在鳃中表达量显著高于其他组织(P<0.05)。pH 8.8胁迫下,该基因的表达量在12 h达到峰值,为对照组的1.206倍,在48 h达到最低值,为对照组的0.166倍;pH 9.2胁迫下,该基因表达量在1 h达到峰值,为对照组的1.577倍,在12 h达到最低值,为对照组的0.104倍。结果表明,高pH对该基因具有一定的抑制作用。干扰结果显示,高pH胁迫下干扰组较对照组的死亡率显著增高(P<0.05),表明该基因表达量越高,越有利于中国对虾的存活。本研究结果表明, FcVHA-c基因参与了高pH胁迫下中国对虾的离子调控,高pH胁迫抑制FcVHA-c基因的调控能力。     

中国明对虾NHE3基因克隆及其在pH胁迫下的表达

为研究钠/氢交换体(Na+/H+-exchanger,NHE)在中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)响应pH胁迫过程中发挥的作用,首先采用静水毒性实验方法确定了中国明对虾酸碱半致死pH,然后利用RACE技术克隆了中国明对虾Na+/H+-exchanger isoform 3(命名为FcNHE3)基因,并通过荧光定量PCR及RNA干扰技术分析了其在pH胁迫下的表达特征及功能。结果显示,72 h酸性半致死pH和碱性半致死pH分别为5.2和9.1。克隆获得FcNHE3基因(Gen Bank:MF373587)cDNA序列全长3508 bp,开放阅读框2805 bp,编码934个氨基酸,具有信号肽和12个跨膜结构域;蛋白同源分析发现,FcNHE3与青蟹(Carcinus maenas)同源性最高,达到74%;系统进化分析显示,FcNHE3与三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)和青蟹亲缘关系最近。荧光定量PCR分析表明,FcNHE3基因在鳃组织中表达量显著高于其他组织(P0.05);酸性半致死pH(pH 5.2)胁迫下,FcNHE3基因在整个胁迫过程中显著上调表达(P0.05);碱性半致死pH(pH 9.1)胁迫下,FcNHE3基因在前48 h显著下调表达(P0.05),12 h表达量最低,仅在72 h出现上调表达。RNA干扰后,FcNHE3基因表达受到抑制,pH 5.2胁迫下对虾存活率相比对照组显著下降。研究表明相较于高pH胁迫,FcNHE3基因在中国明对虾响应低pH胁迫过程中可能发挥更重要的调节作用。     

pH、氨氮胁迫对中国对虾HSP90基因表达的影响

研究了pH、氨氮胁迫对中国对虾Fenneropenaeus chinensis血细胞、肝胰腺、鳃和肌肉组织HSP90基因时空表达的影响.分别将中国对虾暴露于pH7.0、9.0的水体中148h和不同氨氮浓度的水体中96h,结果表明,pH（7.0,9.0）胁迫条件下中国对虾鳃、肌肉和血细胞HSP90基因表达均上调,肝胰腺HSP90基因表达对两种pH胁迫差异明显：pH7.0胁迫条件下,HSP90基因表达3h达峰值后明显降低;pH 9.0胁迫时,HSP90基因表达水平逐渐升高,整个胁迫过程中均显著高于对照组（P＜0.05）,说明中国对虾肝胰腺组织是高pH胁迫的响应器官.6mg/L氨氮浓度组鳃和肌肉组织HSP90基因表达水平24h达最高值,分别为对照组的5.46和1.55倍;各胁迫组肝胰腺和血细胞HSP90基因表达水平分别于6h和48h达到最高值,为对照组的1.33～2.08倍和2.20～5.45倍.肝胰腺组织对氨氮胁迫表现敏感,短时间内（6h）通过上调HSP90基因表达水平保护细胞;鳃组织HSP90基因表达波动范围最大,说明鳃组织需要更高表达量的HSP90保护细胞.当氨氮浓度持续48～96h维持在2～6mg/L,各组织HSP90基因表达水平显著降低.     

中国明对虾MKK3 基因cDNA 克隆及其在氨氮胁迫下的表达

采用RACE技术克隆获得中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)丝裂原活化蛋白激酶激酶3(MKK3)基因全长c DNA序列,并对该序列进行分析。结果表明,该基因全长为1434 bp,开放阅读框长1011 bp,5′非编码区长33 bp,3′非编码区长390 bp,将该基因命名为Fc MKK3。推测该基因编码336个氨基酸,分子量为37.89 k D,理论等电点为6.08。同源性和系统进化分析表明,Fc MKK3基因与丽蝇蛹集金小蜂(Nasonia vitripennis)和地中海实蝇(Ceratitis capitata)的相似性分别为69%和68%,与其他节肢动物MKK3聚为一类。荧光定量RT-PCR结果表明,Fc MKK3基因在肌肉中的相对表达量最高,其次为鳃。氨氮胁迫后该基因在中国明对虾肠、鳃、胃、心脏、肝胰腺、肌肉和血细胞中的表达量均显著增加,并有不同的时空表达趋势,表明Fc MKK3基因可能在中国明对虾应对非生物胁迫反应的过程中起着重要的作用。     

斑节对虾过氧化氢酶基因全长cDNA克隆及表达分析

过氧化氢酶(catalase,CAT)是一种重要的抗氧化酶,防止过氧化氢对机体的氧化应激。该研究以斑节对虾( Penaeus monodon) 肝胰腺转录组中筛选获得的CAT基因片段为基础,利用RACE 技术获得斑节对虾CAT基因（PmCAT）cDNA全长。该基因cDNA全长为1 909 bp,开放阅读框为1 563bp,编码520个氨基酸。PmCAT推导的氨基酸序列与其他动物氨基酸序列具有高度的一致性。实时定量PCR结果显示,PmCAT基因在斑节对虾的不同组织中均有表达,其中在鳃的表达量最高,肝胰腺和胸神经次之。在硫酸铜（CuSO4）胁迫下,PmCAT基因在肝胰腺中的表达量显著下调（P0.05）,在第24和第48小时恢复正常表达量;在pH 7.0胁迫下,PmCAT表达量在第12小时升高达最大值（P0.05）,然后恢复到正常水平;在pH 9.0胁迫下,PmCAT基因表达显著低于正常组（P0.05）。研究表明,PmCAT基因参与斑节对虾氧化应激和对环境毒理的适应性反应。     

斑节对虾Pellino基因的克隆及其在不同胁迫条件下的表达分析

Pellino蛋白家族,是一类高度保守的E3泛素连接酶,在泛素化和先天性免疫中发挥重要作用。该研究通过RACE技术得到斑节对虾(Penaeus monodon)泛素连接酶Pellino基因的c DNA全长。该基因序列全长1 961 bp,编码区序列长1 299 bp,编码432个氨基酸,5’非编码区(UTR)为89 bp,3’UTR为573 bp。通过qRT-PCR技术,研究了PmPellino基因在斑节对虾不同组织中的表达水平,并研究了其在不同浓度氨氮胁迫下和不同微生物刺激下的表达情况。结果显示,PmPellino基因在各组织中均有表达,在鳃组织中表达量最高。急性氮氮胁迫后,PmPellino在肝胰腺中的表达量显著上调(P<0.01),但在鳃中的表达被抑制(P<0.01)。哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)可显著激活PmPellino在鳃中的表达,抑制其在肝胰腺中的表达。鳗弧菌(V. anguillarum)可显著抑制PmPellino在肝胰腺中的表达,而对PmPellino在鳃中的表达无显著影响。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)可以显著激活PmPellino在肝胰腺和鳃中的表达。结果表明PmPellino可以激活免疫应答通路,在免疫防御中发挥重要作用。     

盐度、pH值和碱度对凡纳滨对虾受精卵孵化率的影响

以进口凡纳滨对虾所产的受精卵为材料,在相同孵化水温(29.5℃)、不同盐度(20、25、30、35、40)、不同pH值(7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)及不同碱度(2.23 mmol/L、2.79 mmol/L、3.35 mmol/L、3.90mmol/L、4.46 mmol/L)条件下,进行凡纳滨对虾受精卵的孵化试验。试验结果表明:凡纳滨对虾受精率的孵化率与盐度呈密切相关,以海水盐度为30的孵化效果最佳,平均孵化率达到87.7%,盐度低至20或高至40时均不能孵化出无节幼体;凡纳滨对虾受精卵的孵化效果与海水的pH值密切相关,微碱性的海水有利于受精卵的正常发育,孵化率表现较佳,其中以海水pH值8.0的孵化效果最佳,受精卵的平均孵化率为85.85%,海水pH值过低或过高都不利于胚胎的发育,受精卵的孵化率都有不同程度的下降;受精卵的孵化效果与海水碱度的变化没有显著的相关性,在2.23～4.46 mmol/L的碱度范围内,受精卵的平均孵化率介于85.35%到85.95%之间,各碱度梯度组之间的孵化率无显著差异。     

斑节对虾MKK7基因的克隆及在不同胁迫条件下的表达分析

丝裂原活化蛋白激酶激酶7（MKK7）是JNK（c-Jun N-terminal kinase）信号通路的关键调控因子,参与调节细胞对各种胞外刺激的反应。本研究利用RACE技术克隆获得了斑节对虾（）,其全长为2710 bp,包括14 bp的5''非编码区（UTR）、1295 bp的3''UTR和1401 bp的开放阅读框（open reading frame,ORF）,编码466个氨基酸。多重序列比对和系统进化树分析结果表明,基因聚为一支并且具有最高的同源性（99.14%）。定量表达结果表明,Staphylococcus aureus）组和鳗弧菌（Vibrio harveyi）组,这两种组织中的表达量均显著低于对照组。两组低盐（17、3）胁迫后,肝胰腺和鳃组织中的PmJNK在各组的表达均受到抑制,表明MAPK信号转导通路可能在斑节对虾免疫防御和盐度应激过程中发挥重要作用。     

中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)p38 MAPK基因克隆及表达分析

应用RACE克隆技术获得中国对虾(Fenneropenaeus chinensis) p38 MAPK基因全长cDNA序列,并对该序列进行分析.结果显示,中国对虾p38 MAPK基因全长为1563 bp,开放阅读框长1098 bp,5′非编码区长122 bp,3′非编码区长343 bp,将该基因命名为Fcp38.氨基酸序列分析推测,该基因编码365个氨基酸,分子量为41.77 kDa,理论等电点为5.68.同源性分析表明,Fcp38基因与凡纳滨对虾和日本囊对虾的p38相似性最高,为98％.通过比对发现,该基因除含p38家族特有的标志性Thr-Gly-Tyr双磷酸化位点和底物结合位点Ala-Thr-Arg-Trp,还具有p38家族关键功能位点ED.系统进化分析显示,Fcp38与凡纳滨对虾和日本囊对虾的p38聚为一支.荧光定量PCR结果显示,Fcp38基因在肠、鳃、胃、心脏、淋巴、肝胰腺、肌肉、血细胞中均有表达,以在肌肉中表达量最高.氨氮胁迫后,该基因在中国对虾肌肉、血细胞、鳃、心脏、肠和胃中的相对表达量均显著增加,且有不同的时空表达趋势,表明Fcp38基因可能在中国对虾应对环境胁迫过程中起着重要作用.     

The responsive expression of a caspase gene in Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis against pH stress

Caspases are a family of proteases, which play an important role in apoptosis. To evaluate the relationship between apoptosis and pH stress in crustaceans, a caspase gene (FcCasp) was cloned from the Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis. The full length of FcCasp was 1329 bp with a 972 bp ORF, encoding a polypeptide of 323 amino acids with a calculated molecular weight and pI of 36.0 kDa and 6.27 respectively. The deduced amino acid sequence of FcCasp contained a potential active site (QACRG pentapeptide) conserved in most caspases and two profile hits (p20 and p10 domain profile). Comparison of amino acid sequences revealed that FcCasp had an overall similarity of 76–83% with other penaeid shrimp caspases. The amino acid sequence of recombinant FcCasp protein expressed in Escherichia coli was identified by matrix‐assisted laser desorption/ionization‐time of flight‐mass spectrometer analysis. High‐level expression of FcCasp in six different tissues was detected by real‐time polymerase chain reaction after exposure to pH stress for 96 and 148 h. TUNEL analysis indicated that apoptosis began to appear in F. chinensis hepatopancreas exposed to extreme pH for 12 h. The amount of apoptosis seems positively correlated with the length of exposure to the pH stressor. The results suggested that FcCasp was involved in the response to environmental pH stress.     

拥挤条件下中国明对虾肝胰脏蛋白质双向电泳条件优化与分析

以中国明对虾为试验对象,优化了拥挤应激条件下中国明对虾肝胰脏蛋白质双向电泳的条件,并分析了关联的差异蛋白质。试验结果表明,中国明对虾肝胰脏蛋白双向电泳优化条件为裂解液中添加三丁基膦,采用17 cm的固相p H值（p H 4～7）梯度干胶条,上样量为120μg ,等电聚焦时间为65000 V／h。蛋白图谱分析结果显示,得到的700多个蛋白点中差异蛋白点11个,其中8个差异蛋白点丰度显著上调（P ＜0．05）,3个差异蛋白点丰度显著下调（P ＜0．05）。研究表明,在拥挤应激条件下中国明对虾肝胰脏蛋白表达发生显著变化。     

中国明对虾FBA基因克隆及其在白斑综合征病毒感染中的表达及功能分析

醛缩酶(FBA)是糖酵解和糖异生中的关键酶,参与多种生物过程。本研究采用RACE技术,克隆获得中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)FBA基因(Fc FBA)的全长c DNA序列,并对其进行生物信息学分析。结果显示,中国明对虾Fc FBA基因的c DNA全长为2496 bp,其中,ORF长1098 bp,5~′UTR长79 bp,3~′UTR长1319 bp。完整的阅读框编码365个氨基酸,分子量为39.8 k Da,预测的理论等电点为6.6。同源性及系统进化分析表明,Fc FBA与节肢动物的FBA聚为一类,与卤虫(Artemia franciscana)、家蚕(Bombyx mori)、沙漠蝗(Schistocerca gregaria)的相似度分别是86%、79%和78%。荧光定量PCR结果显示,Fc FBA在肌肉中的相对表达量最高,肝胰腺中最低。WSSV感染后,该基因在鳃、肝胰腺和肌肉中呈现出不同的时空表达特点。ds RNA干扰24 h以后,抑制效率达到最大。与PBS对照组相比,Fc FBA干扰组(ds RNA组)加快了对虾染病后的死亡速度。本研究表明,Fc FBA基因可能参与了中国明对虾生物胁迫的应答反应。     

中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis) coat-ε基因全长cDNA克隆及组织分布

coat-ε基因表达的蛋白是组成 COPⅠ的 coatomer 复合体的一个亚基,为获得中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis) coat-ε基因全长序列,采用cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA end, RACE)技术,扩增出coat-ε基因的3￠端和5￠端,测序结果经DNAMAN比对拼接得出coat-ε基因全长,基因全长1402 bp,5￠非编码区(UTR)84 bp,3￠非编码区(UTR)310 bp,开放阅读框1008 bp,预测编码335个氨基酸,其中,第230–300的氨基酸属于TPR超家族,SignalP 3.0 Server预测氨基酸序列没有信号肽,TMHMM Server v.2.0分析此氨基酸不存在跨膜结构,PSORTⅡ Prediction预测该蛋白位于线粒体、细胞质、内质网中,属胞内蛋白。系统进化树显示,中国明对虾的coat-ε基因与节肢动物门的动物亲缘关系相近。采用实时荧光定量方法分析该基因在鳃、上皮、胃、肌肉、肝胰腺等不同组织中的相对表达,结果显示,coat-ε在肌肉中的相对转录表达量最高,在鳃和附肢的表达次之。本研究获得的中国明对虾coat-ε全长序列,可为该基因功能研究提供基础。     

氨氮胁迫下中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)谷氨酸脱氢酶基因的表达分析

采用 RACE 技术克隆获得中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)谷氨酸脱氢酶 GDH 基因(FcGDH)。FcGDH 基因全长1779 bp,包括1个1659 bp 的开放阅读框(ORF),编码552个氨基酸,预测分子量大小为61.3 kDa,理论等电点为6.54。同源性分析显示,FcGDH 氨基酸序列与其他动物高度保守,其中,与凡纳滨对虾最为相似,高达98%,其次为中华绒螯蟹,为89%。系统进化树分析显示,FcGDH 氨基酸序列与凡纳滨对虾 GDH 聚为一支,之后依次为：中华绒螯蟹、黑腹果蝇、埃及按蚊。组织表达分析发现,FcGDH 基因在肌肉、鳃、肝胰腺、胃、肠、淋巴和血淋巴中均有表达,其中,肌肉中表达量最高。氨氮胁迫后,FcGDH 基因在肌肉和肝胰腺组织中变化显著,在胁迫后期,FcGDH 基因表达量均上调,且与对照组相比差异显著(P<0.05),说明 FcGDH 基因在氨氮解毒代谢过程中发挥了重要作用。     

中国对虾甘氨酸脱羧酶的基因克隆、表达及其与抗WSSV的关联分析

本研究采用RACE技术克隆获得中国对虾(Fenneropenaeuschinensis)甘氨酸脱羧酶基因(Fc GLDC)的全长cDNA及DNA序列,并对其进行生物信息学分析。结果显示,FcGLDC基因的cDNA全长为3481 bp,其中,ORF为2829 bp,5￠UTR长17 bp,3￠UTR长86 bp。完整的阅读框编码942个氨基酸,分子量为104.66 kDa,预测的理论等电点为6.51。FcGLDC基因DNA序列全长共4964bp,包含12个外显子和11个内含子。同源性及系统进化分析显示,FcGLDC基因与节肢动物的GLDC基因聚为一类;氨基酸序列比对发现,Fc GLDC基因的蛋白序列与节肢动物的相似度最高,与内华达白蚁(Zootermopsis nevadensis)、体虱(Pediculus humanus corporis)和白纹伊蚊(Aedes albopictus)的相似度分别为71%、68%和68%。在鳃、肝胰腺和肌肉中的荧光定量PCR结果显示,FcGLDC在肌肉中的相对表达量最高,鳃中最低。WSSV感染后,该基因在鳃、肝胰腺和肌肉中呈现出了不同的时空表达特点。使用直接测序法结合质谱法,在该基因内部发现4个SNP位点,但是各位点与抗WSSV性状均不相关(P0.05)。本研究表明,FcGLDC基因在对虾感染WSSV后的应答反应中或起一定作用。