乳酸克鲁维酵母乳糖酶性质的研究

采用单因素试验方法研究了乳酸克鲁维酵母乳糖酶的性质,该酶在pH值为6.0～8.4范围内比较稳定,酶作用最适pH值在6.4～6.6;最适反应温度为45℃,并具有良好的热稳定性;Mn2＋,Mg2＋,Na＋等对酶有明显的激活作用,而重金属离子如Zn2＋和Cu2＋等对酶活有抑制作用。实验测定得该酶以ONPG为底物的米氏常数为3.348mmol/L。     

米曲霉乳糖酶基因在乳酸克鲁维酵母中的表达

为获得高活性的乳糖酶制剂,根据米曲霉乳糖酶基因序列以及宿主细胞乳酸克鲁维酵母GG799密码子的偏爱性,对米曲霉乳糖酶基因进行优化。将已优化的米曲霉乳糖酶lacA基因片段插入到乳酸克鲁维酵母GG799表达载体pKLAC1中,构建重组载体p KLAC1-lacA,用电脉冲法将SacⅡ酶线性化的重组质粒转入乳酸克鲁维酵母GG799中。经过5 mmol/L酵母碳基础培养基(yeast carbon base,YCB)活性筛选,全细胞聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)鉴定,最后获得了一株多拷贝整合的基因工程菌株lacA-1。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)和薄层层析分析(thin-layer chromatography,TLC),该重组菌株可胞外分泌乳糖酶,并具有生物活性。摇瓶发酵培养120 h,酶活力最高达到120.65 U/mL。本研究成功地将米曲霉乳糖酶基因在乳酸克鲁维酵母GG799中表达,获得的重组菌株lacA-1可胞外分泌的乳糖酶并有较高的乳糖酶活性,试验结果为利用乳酸克鲁维酵母GG799表达系统规模化生产乳糖酶奠定基础。     

固定化乳糖酶水解乳清粉合成低聚半乳糖的研究

以脱盐乳清粉为原料,研究了用固定化乳糖酶水解乳清粉合成GOS的工艺条件。试验结果表明,反应时间、乳清粉浓度、温度、加酶量及pH对GOS的合成均能产生不同程度的影响,其中乳清粉浓度和反应时间影响较大,pH影响较小。通过正交试验优化出的乳糖酶水解乳清粉催化合成GOS的最佳工艺条件为:反应体系的pH5.0、乳清粉浓度50%、乳糖酶用量40U/g、温度55℃、反应时间为36h。在此条件下GOS的合成率为29.78%。     

耐热β-半乳糖酶在乳酸克鲁维酵母及毕赤酵母中的表达研究

将嗜热脂肪芽孢杆菌来源的耐热β-半乳糖酶基因bgaB分别插入穿梭质粒pKLAC1、pPIC9k的α-因子信号肽下游,构建bgaB基因的乳酸克鲁维酵母真核表达载体pKLAC1-bgaB及毕赤酵母真核表达载体pPIC9k-bgaB。载体经酶切线性化后采用电击方法分别转化到乳酸克鲁维酵母K.lactis GG799及毕赤酵母GS115中,并通过同源区各自整合到宿主基因组中。重组酶进行镍柱纯化、Western Blot杂交鉴定及酶学性质分析。结果表明,耐热β-半乳糖苷酶在酵母表达系统中可以实现外源表达且热稳定性保持良好,但不能被酵母系统有效分泌。     

耐热β-半乳糖酶在乳酸克鲁维酵母及毕赤酵母中的表达研究

将嗜热脂肪芽孢杆菌来源的耐热β-半乳糖酶基因bgaB分别插入穿梭质粒pKLAC1、pPIC9k的α-因子信号肽下游,构建bgaB基因的乳酸克鲁维酵母真核表达载体pKLAC1-bgaB及毕赤酵母真核表达载体pPIC9k-bgaB。载体经酶切线性化后采用电击方法分别转化到乳酸克鲁维酵母K.lactis GG799及毕赤酵母GS115中,并通过同源区各自整合到宿主基因组中。重组酶进行镍柱纯化、Western Blot杂交鉴定及酶学性质分析。结果表明,耐热β-半乳糖苷酶在酵母表达系统中可以实现外源表达且热稳定性保持良好,但不能被酵母系统有效分泌。      

乳酸克鲁维酵母超量表达葡萄糖氧化酶的研究

本研究应用具有超量分泌表达能力的乳酸克鲁维酵母(Kl SEL1基因突变型)、游离型载体p KDU7以及整合型表达载体p KLAC1,对具有5个氨基酸点突变的葡萄糖氧化酶(该突变酶的比活是野生型葡萄糖氧化酶的3.24倍)进行分泌表达。最终获得了一株可以超量分泌表达葡萄糖氧化酶的菌株,其最大产量为70±7 k U/L。这是现今已报道的分泌表达葡萄糖氧化酶能力最高的乳酸克鲁维重组菌株,为食品安全级的葡萄糖氧化酶的生产和应用提供了新途径。      

乳酸克鲁维酵母超量表达葡萄糖氧化酶的研究

本研究应用具有超量分泌表达能力的乳酸克鲁维酵母(Kl SEL1基因突变型)、游离型载体p KDU7以及整合型表达载体p KLAC1,对具有5个氨基酸点突变的葡萄糖氧化酶(该突变酶的比活是野生型葡萄糖氧化酶的3.24倍)进行分泌表达。最终获得了一株可以超量分泌表达葡萄糖氧化酶的菌株,其最大产量为70±7 k U/L。这是现今已报道的分泌表达葡萄糖氧化酶能力最高的乳酸克鲁维重组菌株,为食品安全级的葡萄糖氧化酶的生产和应用提供了新途径。     

马克斯克鲁维酵母乳糖酶水解和转移性质比较

主要对马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)产β-D-半乳糖苷酶的水解性质和转移酶学性质进行了比较。对比发现温度、pH、金属离子以及葡萄糖和半乳糖浓度对该酶的两种性质有不同影响,同时还研究了酶的动力学特性,以ONPG为底物,测得马克斯克鲁维酵母β-D-半乳糖苷酶的Km为0.51mmol/L,Vmax为0.532μmol/(mg protein·min)。以乳糖为底物,Km为0.56mmol/L,Vmax为0.31μmol/(mg protein·min)。这对研究生产低聚半乳糖有重要作用。     

脆壁克鲁维酵母乳糖酶的提取与发酵优化

通过试验研究了一株脆壁克鲁维酵母胞内乳糖酶的破壁提取及其发酵培养基成分与培养条件优化,确定了该株酵母合适的破壁方法及最佳发酵培养条件。结果表明,采用球磨机对该酵母进行处理可以较好地释放胞内乳糖酶。其发酵生产乳糖酶的最佳培养基成分为：乳糖4%,酵母粉3%,MnCl21mol/L;最佳培养条件：接种量10%,温度28℃,初始pH7～7.5,摇床转数180r/min,培养时间36h。在此条件下培养,乳糖酶活力达1100U/mL,4140U/g干菌体。     

渗透乳酸克鲁维酵母细胞方法与工艺的研究

研究了渗透乳酸克鲁维酵母细胞生产透性化细胞乳糖酶的方法,并确定了得到最大酶活的工艺条件。     

人溶菌酶基因在乳酸克鲁维酵母中的表达

人溶菌酶是一种天然广谱抑菌物质,在食品和医药工业有潜在应用前景。为获得高活性的人溶菌酶制剂,采用乳酸克鲁维酵母表达系统,对经密码子优化的人溶菌酶基因(h LYZ)进行分泌表达。将人工合成h LYZ插入到乳酸克鲁维酵母表达载体p KLAC1,构建重组载体p KLAC1-h LYZ,并用电脉冲法将SacⅡ线性化的重组质粒转化到乳酸克鲁维酵母GG799中。通过全细胞PCR鉴定,最后获得了一株多拷贝整合的基因工程菌h LYZ1。工程菌可以分泌表达分子量约14 ku的目的蛋白质,与预期大小相符。摇瓶发酵培养128 h,酶活最高达到1430 U/mL。抗菌活性检测结果显示,重组人溶菌酶对溶壁微球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌有较好的溶菌活性。本研究成功地在乳酸克鲁维酵母中表达了重组人溶菌酶,表达的蛋白具有较高的酶活性,试验结果为利用乳酸克鲁维酵母表达系统规模化生产重组人溶菌酶奠了基础。     

乳酸克鲁维酵母作为微生物细胞工厂的应用研究进展

乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）是一种典型的非常规酵母,在微生物基础研究和应用研究方面都有着非常重要的用途。该酵母具有食品安全级别高、蛋白分泌能力强、整合表达能力高效及大规模发酵能力优异等特点,因此,工业应用前景较为广阔。目前,乳酸克鲁维酵母作为蛋白表达系统已在食品和医药等行业中得到了广泛应用。近年来,国内外生物技术领域的科研人员以乳酸克鲁维酵母作为底盘细胞,利用合成生物学技术已经成功构建出了能够生产各种生化产品的微生物细胞工厂,该技术展示出了极大的发展潜力。本文主要对乳酸克鲁维酵母的菌种特点、合成生物学元件、遗传操作工具、基因编辑策略进行介绍,并综述乳酸克鲁维酵母作为细胞工厂的应用研究进展,可以为今后利用合成生物学方法在乳酸克鲁维酵母底盘中构建生产各种高附加值产品的高效微生物细胞工厂提供理论指导。     

一株乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)发酵条件的优化及其胞内乳糖酶性质的研究

作为益生元的低聚半乳糖(Galacto-oligosaccharide,简称GOS)可促进肠道内乳酸菌和双歧杆菌的增殖,有利于人体健康。GOS是利用乳糖酶转移半乳糖苷的作用生成的。本实验通过正交试验研究了产乳糖酶乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis 2.1494)的培养条件及其乳糖酶的性质。结果表明,该株乳酸克鲁维酵母的最佳培养条件为:温度28℃,自然pH,接种量3%,乳糖添加量2%,装液量40mL,摇床转速80 r/m in,培养时间22h。在此条件下培养,乳糖酶比活力最高可达24.54U/mg。此酶最适温度为50℃,最适pH为6.6,最适底物浓度为0.6mol/L,在40℃以下,pH6.2~7.0具有较高的稳定性,Mn2+、Mg2+和Zn2+对该酶有一定的激活作用,而重金属Cu2+对该酶有强烈抑制作用。     

低聚半乳糖酶法合成条件的研究

研究了低聚半乳糖(galactooligosaccharides,GOS)的酶法合成条件,利用高效液相色谱方法进行检测,以GOS产率为指标,考察了缓冲溶液类型及浓度、起始乳糖浓度、反应温度、加酶量、pH、反应时间等因素对GOS产率的影响。结果表明,酶法合成GOS的最佳条件为:缓冲溶液选取0.1 mol/L、pH 7.0的Na2HPO4/NaH2PO4,起始乳糖浓度为45%(W/V),反应温度为55℃,加酶量为20 U/g乳糖。在此条件下反应12 h,GOS产率可达44.5%。     

固定化半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的研究

随着社会对功能性食品、保健食品要求的不断提高,低聚半乳糖的重要性也逐渐得到更多人的重视。研究了以壳聚糖吸附与戊二醛交联固定化的半乳糖苷酶为催化剂合成低聚半乳糖的过程,并对反应条件进行了单因素优化。试验结果表明,最佳反应条件为:质量浓度50%的乳糖为底物,溶液p H值6.5,反应温度40℃,体系中加入2 mmol/L的Mg~(2+),640 g/L的酶用量,反应4 h后,低聚半乳糖的产率为71.5%。在重复使用7次后,催化得到的GOS产率仍为64.9%,展现了良好的稳定性。     

马克斯克鲁维酵母的中试发酵研究

对马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）的细胞积累展开中试发酵,并且在其培养过程中研究菌体的生长情况以及呼吸参数和代谢产物的变化规律。结果表明,通过摇瓶和3 L发酵罐的分批培养,从6株马克斯克鲁维酵母中确定了马克斯克鲁维酵母菌株F#在生长方面更具优势。利用带有尾气分析仪的50 L发酵罐对菌株F#进行分批培养和流加培养,确定了菌株F#存在Crabtree效应。并且通过线上监测呼吸商（RQ）、发酵液pH和溶氧的变化情况,以合适的补料工艺减弱了菌株F#的Crabtree效应,培养12 h后细胞干质量达（54.37±3.3）g/L,实现了细胞的大量积累,对马克斯克鲁维酵母的工业生产具有一定指导意义。     

骆驼凝乳酶原基因在乳酸克鲁维酵母中的重组表达

骆驼凝乳酶具有独特的凝乳特性,在干酪加工制作中具有潜在应用前景。为获得高活性的骆驼凝乳酶制剂,采用乳酸克鲁维酵母GG799为宿主,首次对经密码子优化的骆驼凝乳酶原(c PC)基因进行表达。将人工合成cPC基因插入乳酸克鲁维酵母表达载体pKLAC1,构建重组载体pKLAC1-c PC,并用电脉冲法将SacⅡ线性化的重组质粒转化到乳酸克鲁维酵母GG799中。通过含1%酪蛋白的YEPD平板活性筛选,全细胞PCR鉴定,最后获得一株多拷贝整合的基因工程菌cPC 1。该菌株可分泌表达cPC,经SDS-PAGE分析,重组cPC的分子质量约为41 ku,符合预期;酸化处理后cPC的分子质量约为36 ku,可正确自我剪切。摇瓶发酵培养120h,酶活最高达230 SU/m L。分别以牛乳、骆驼乳和牦牛乳作为底物检测酶活性,结果重组骆驼凝乳酶对3种动物乳均具有凝乳活性。     

重组乳酸克鲁维酵母产磷脂酶A2发酵条件的优化

利用重组乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）GG799表达磷脂酶A2,对其产酶发酵条件进行研究。采用单因素试验和正交试验对培养基及培养条件进行优化,确定了重组菌产酶的最佳发酵条件。结果表明：最优培养基组成为葡萄糖30 g/L、酵母粉20 g/L、蛋白胨30 g/L、KH2PO4 3 g/L;最优培养条件为：发酵温度30 ℃、接种量2%（V/V）、初始pH?7.0、装液量90 mL/250 mL三角瓶、摇床转速220 r/min,在此条件下发酵培养,酶活力由（1.87±0.12）U提高到（5.35±0.27）U。     

固定化渗透乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces Lactis)连续水解乳清的研究

研究了一种利用固定化渗透乳酸克鲁维酵母催化水解乳清中乳糖的技术,分析了制备工艺、水解条件对于固定化细胞活性的影响。结果表明,在细胞添加量为60%、交联剂为1%BaCl2,凝胶颗粒大小为1～1.5mm时,固定化细胞的活性可达到78.819 U/g,固定化细胞最适反应温度为36℃,最适pH值7.0,相对于游离细胞,固定化细胞在对温度及pH的适应性上均有所提高,具有较好的应用前景。此外初步探索了一种复合流速连续水解的工艺,即在水解不同阶段,采用了不同的流速进行水解。结果表明,这种复合流速连续水解工艺可以在一定程度上缩短水解时间,提高水解的效率。     

小牛凝乳酶原基因在乳酸克鲁维酵母中的表达及遗传稳定性研究

目的:构建小牛凝乳酶原乳酸克鲁维酵母分泌型表达载体,表达重组凝乳酶原.方法:通过PCR获得小牛凝乳酶原cDNA片段,将目的基因插入酵母表达载体pKLAC1 α结合因子分泌信号下游,得到重组载体pKLAC1-prochymosin.SacII线性化后氯化锂转化乳酸克鲁维酵母GG799,用含5mmol/L乙酰胺的YCB固体培养基筛选转化酵母菌,PCR鉴定目的基因,利用特异性引物筛选多拷贝转化子.阳性转化子经摇瓶表达,取上清TCA沉淀后做Tricine SDS-PAGE分析并检测凝乳酶的活力,通过检测阳性转化子产凝乳酶的活力考察其遗传稳定性.结果:经测序及PCR证实,凝乳酶原cDNA准确插入酵母表达载体pKLAC1中,转化后重组载体通过同源重组整合进入酵母基因组中.Tricine SDS-PAGE分析证明凝乳酶的分子量约为36kD,酸处理后测得培养基中凝乳酶的酶活为83SU/ml,阳性转化子遗传稳定性好.结论:成功构建出酵母表达载体pKLAC1-prochymosin,在培养基中获得分泌的重组凝乳酶原,经过酸处理后凝乳酶原转化为有活性的凝乳酶.