SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法快速检测沙门氏菌

为建立检测沙门氏菌的快速、特异、灵敏的荧光定量PCR方法,以沙门氏菌inv A基因为目的基因设计引物,并进行特异性、灵敏度和重复性实验。结果显示,建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测沙门氏菌的方法具有极强的特异性,其中沙门氏菌检出限为86copies/m L,标准曲线的相关系数为0.999,扩增效率为104%,不同浓度质粒重复性扩增实验Ct值的变异系数均3%,符合WHO对中等实验室提出的标准(CV 3%),显示了良好的重复性。结果表明该方法具有快速、简单、灵敏度高、特异性强等优点,可应用于食品卫生监管、商品检验检疫以及临床诊断等领域。     

葡糖杆菌的SYBR Green Ι荧光定量PCR方法的建立

基于Gen Bank提供的葡糖杆菌的16S r RNA保守序列设计PCR引物,利用SYBR GreenΙ荧光定量PCR技术建立一种快速灵敏检测酸乳制品中葡糖杆菌的方法。用本研究建立的SYBR GreenΙ荧光PCR方法对3株葡糖杆菌以及18株非葡糖杆菌进行特异性检测,并用凝胶电泳验证其可靠性,结果显示,本研究所设计的引物具有良好的特异性。对扩增结束后的PCR产物进行溶解曲线分析,证实此引物的扩增产物存在引物二聚体,但可通过溶解曲线的出峰时间排除非特异性扩增。利用SYBR GreenΙ荧光定量PCR检测葡糖杆菌建立的标准曲线相关性良好,R2=0.9968,对葡糖杆菌进行灵敏度检测,最低检出限可达75 CFU/m L。利用该方法可成功检测出5份人工污染样品中的葡糖杆菌,研究表明,该方法灵敏度高、操作简便快捷,适用于酸乳制品的定量检测。     

SYBR Green实时荧光PCR检测食品中鲨鱼源性成分真实性方法的建立

为确保鲨鱼产品的真实性,作者研究建立了食品中鲨鱼源性成分的SYBR Green实时荧光PCR鉴定方法.运用建立的SYBR Green实时荧光PCR方法对9种鲨鱼及48种常见非鲨鱼类动植物样品进行检测,9种鲨鱼样品均出现扩增曲线,且熔解曲线在(84±1.5)℃内出现峰值;其他非鲨鱼样品中均未出现扩增曲线,熔解曲线在(84±1.5)℃也未出现峰值.该检测方法的检测限为0.0001 ng/μL鲨鱼DNA和质量分数0.01％狗鲨肉粉.运用建立的方法对20种常见的鲨鱼产品进行PCR检测,除仿鱼翅和鲨鱼肝油外所有产品中均能检测出鲨鱼成分.结果表明,该检测方法特异性强,灵敏度高,能够用于食品中鲨鱼源性成分的真实性鉴别.     

SYBR GreenⅠ实时PCR快速检测沙门菌

为应用SYBR GreenⅠ实时PCR技术建立沙门菌的快速检测方法，根据沙门菌invA基因序列的特点设计特异性引物，进行SYBR GreenⅠ实时PCR检测。以沙门菌及非同源性参考菌株做特异性检测；沙门菌不同群菌株做重现性检测；将沙门菌菌株稀释成不同梯度，做灵敏度检测。该方法有较好的特异性、重现性，沙门菌属5个群菌株均为阳性：而其它非同源菌株均为阴性。该方法灵敏度较高，检测低限为19CFU／ml。该方法特异性强，重现性好，敏感性高，可以快速、准确检测食品中沙门菌。应用实时PCR技术，利用SYBR GreenⅠ染料能选择性结合双链DNA的特点，可检测到沙门菌中invA基因特异性靶序列扩增所产生的荧光信号，且通过熔解曲线可知其熔点值约为80，4℃，而对其它非沙门菌则检测不到荧光信号。SYBR GreenⅠ实时PCR能通过熔解曲线有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体，是基因鉴定检测的新方法。     

SYBR Green实时荧光定量PCR检测大豆转基因成分

采用SYBR Green实时荧光定量PCR技术,建立了食品中大豆转基因成分的定量检测方法。通过设计特异引物,扩增内源参照基因lectin和转基因靶基因CP4EPSPS,建立两种基因的拷贝数-CT标准曲线,根据标准曲线方程计算样品中的转基因含量,并且通过熔解曲线分析扩增反应特异性。结果表明,lectin和CP4EPSPS基因标准曲线线性关系好,R2值分别为0.9984和0.9953,方法的回收率为95%～110%,检测限为0.01%。本检测方法具有快速、灵敏、准确、特异、高通量等优点,可以作为食品中大豆转基因成分的定量检测方法。     

菲律宾蛤仔及其制品的Taqman荧光PCR鉴定方法

目的建立菲律宾蛤仔成分Taqman荧光PCR定性检测方法。方法根据菲律宾蛤仔线粒体细胞色素氧化酶CoxⅠ基因中的保守基因序列设计一对菲律宾蛤仔特异性引物,通过Taqman荧光PCR法进行PCR扩增反应,对菲律宾蛤仔成分进行特异性检测。结果该方法的引物对于菲律宾蛤仔成分的特异性良好;菲律宾蛤仔DNA检出限为0.04 ng/μL,可达菲律宾蛤仔肉粉质量分数的0.001%。通过对市售菲律宾蛤仔制品的检测,该方法可检测出制品中的菲律宾蛤仔成分。结论该检测方法特异性强,灵敏度高,能够用于食品中菲律宾蛤仔成分的真实性鉴别。     

副溶血弧菌的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测方法建立

基于副溶血弧菌gyrB基因保守序列设计1对特异性引物,建立SYBR GreenⅠ实时定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测副溶血弧菌的方法。SYBR GreenⅠ实时定量PCR的Tm为90℃,扩增产物的熔解曲线只出现1个单特异峰,无引物二聚体,表明该引物具有较好的特异性;所制作的实时定量PCR扩增标准曲线在2.06×108～2.06×103拷贝数之间有较好的线性关系,相关系数为0.992,能对副溶血弧进行准确的定量分析。该方法检测时间从核酸抽提到结果分析仅需4～5h,且较传统方法敏感、操作简单,可用于针对副溶血弧菌的进出口检验检疫、食品安全检测及该菌引起的水产动物疾病的诊断与分子流行病学调查。     

水产品及其制品中大西洋鲑鱼实时荧光PCR检测方法建立

目的:三文鱼营养丰富,含有ω-3不饱和脂肪酸,深受大众喜爱,但存在产品标签标示错误、掺伪掺假、以次充好的现象.目前采用检测标准SN/T 3589.7-2013《出口食品中常见鱼类及其制品的鉴伪方法第七部》对鲑鱼成分检测,无法区分大西洋鲑鱼和其他种类的三文鱼.因此有必要建立一种用于区分上述几种三文鱼的快速检测方法.方法:...     

沙门氏菌血清型快速PCR鉴定方法的建立

通过传统玻片凝集试验对78株沙门氏菌进行血清型检测,结果将这些沙门氏菌分成以鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌为主的21种血清型,其中沙门氏菌SJTUF10023证实为自凝菌,无法鉴定血清型。利用MLST可以较精确地预测、区分不同血清型菌株,聚类的各个分支与血清型基本呈对应关系(96.2%,75/78),其中有3株沙门氏菌(1株阿贡纳、1株阿伯丁和1株斯坦利)聚类结果与血清型不一致。根据O抗原(rfb基因簇)、H1抗原(fli C基因)和H_2抗原(flj B基因)分别设计引物进行PCR反应,并与测序相结合,对78株沙门氏菌进行血清型测定,结果仅1株伤寒沙门氏菌的H_2抗原出现假阳性结果,准确度达98.7%(77/78),且编号为SJTUF10023的自凝菌被鉴定为鼠伤寒沙门氏菌,说明该方法能够准确、快速检测沙门氏菌血清型,有望在沙门氏菌血清型鉴定中成为替代传统血清分型的方法。     

鸭绒及鹅绒制品实时荧光PCR鉴定方法研究

本研究使用SDS-异硫氢酸胍-β-巯基乙醇DNA提取法提取鸭绒及鹅绒制品DNA,并建立鸭绒及鹅绒荧光PCR鉴定方法,通过对方法的特异性、检出限分析,表明方法检出限为10ng DNA（含鲑精DNA）,且特异性好.通过样品检测试验表明方法稳定,所建立的方法可作为羽绒制品传统鉴定方法（显微镜法）的有力辅助.     

SYBR(R) GreenⅠ实时PCR快速检测沙门菌

为应用SYBR(R) Green Ⅰ实时PCR技术建立沙门菌的快速检测方法,根据沙门菌invA基因序列的特点设计特异性引物,进行SYB(R) Green Ⅰ实时PCR检测.以沙门菌及非同源性参考菌株做特异性检测;沙门菌不同群菌株做重现性检测;将沙门菌菌株稀释成不同梯度,做灵敏度检测.该方法有较好的特异性、重现性,沙门菌属5个群菌株均为阳性,而其它非同源菌株均为阴性.该方法灵敏度较高,检测低限为19 CFU/ml.该方法特异性强,重现性好,敏感性高,可以快速、准确检测食品中沙门菌.应用实时PCR技术,利用SYBR(R) Green Ⅰ染料能选择性结合双链DNA的特点,可检测到沙门菌中inv A基因特异性靶序列扩增所产生的荧光信号,且通过熔解曲线可知其熔点值约为80.4℃,而对其它非沙门菌则检测不到荧光信号.SYBR(R) Green Ⅰ实时PCR能通过熔解曲线有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体,是基因鉴定检测的新方法.     

食品沙门氏菌实时荧光PCR快速检测方法建立

根据Genbank提供的沙门氏菌ttrBCA基因序列设计引物和探针,建立了食品沙门氏菌实时荧光PCR快速检测方法。结果显示,该方法只对沙门氏菌基因呈阳性反应,而对其它常见非阳性菌株(志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、绿脓杆菌、单增李斯特氏菌、阴沟肠杆菌、副溶血性弧菌)基因组DNA均呈阴性反应,对模拟添加沙门氏菌样品检测,检测低限为240cfu/mL沙门氏菌的DNA,检测食品样品增菌液,仅需约3h,结果表明,该方法适用于食品样品的快速检测。     

银白色葡萄球菌实时荧光PCR快速检测方法的建立

本文旨在建立一种银白色葡萄球菌实时荧光PCR检测方法。根据对NCBI数据库中银白色葡萄球菌非核糖体多肽合成酶(NRPS)基因序列的比对分析,设计引物及探针,并基于所设计的引物及探针建立Taq-man 实时荧光PCR的检测方法。结果表明,本实验所建立的方法特异性较强,只能扩增出银白色葡萄球菌,而其他常见菌株的检测结果呈阴性;该方法的灵敏度为 10 pg/uL;在对实验室通过传统方法分离的金黄色葡萄球菌的检测中,发现有两个分离菌株呈阳性,其结果与普通PCR方法完全一致。     

金黄色葡萄球菌实时荧光PCR快速检测方法的建立

为建立检测金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)的快速检测方法,以SA Sa442基因为靶基因设计合成引物及Taq Man探针,建立了实时荧光PCR快速检测SA的方法。结果显示,对16株试验菌株进行荧光PCR检测,只有SA检测为阳性,表明该检测方法特异性强;该方法的灵敏度为7.5 CFU/m L,利用该检测方法对采集的175份样品进行检测,共计检出5份SA阳性样品,与国标法(GB 4789.10—2010)检测结果一致,显示了良好的实用性。该检测方法灵敏度高、特异性强,具有良好的实用性。     

啤酒有害菌的PCR检测和SYBR Green实时PCR定量

啤酒有害菌是一些能在啤酒中存活并使啤酒的外观和风味发生改变的细菌,对其进行快速检测和定量是啤酒生产急待解决的问题。我们从华润雪花啤酒（中国）有限公司各工厂提供的样品中分离到28株啤酒有害菌,16S rDNA序列的系统进化分析表明,其中26个菌株属于乳杆菌属（Lactobacillus spp．）、1个菌株为明串珠菌属（Leuconostoc spp．）,1个菌株为片球菌属（Pediococcu sp．）。根据酒花（hop）抗性基因horA、horB和horC的保守序列设计了扩增这3个基因的PCR引物,用这些引物对28株啤酒有害菌进行了常规PCR检测,检出率分别为89％、79％和75％,用hor A—horC双引物进行检测,检出率为100％。用SYBR Green实时定量PCR技术,以horA基因为靶序列,建立了对啤酒有害菌的细胞数进行快速定量的新方法,用该方法测定的污染啤酒样品中有害菌的浓度与平板培养法相近。     

溶藻弧菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

为建立溶藻弧菌（VA）的快速检测方法,本研究以VA Collagenase基因为靶基因设计合成引物及Taq Man探针,建立了实时荧光定量PCR快速检测VA的方法。结果显示,对15株实验菌株进行荧光定量PCR检测,只有VA菌株检测为阳性,表明该检测方法特异性强;该方法的灵敏度为18 cfu/m L;稳定性和重复性实验结果表明,同一样品重复检测4次Ct值的变异系数均小于2%;利用该检测方法对采集的165份样品进行检测,共计检出2份VA阳性样品,与SN/T2564-2010行标法检测结果一致,显示了良好的实用性。该检测方法灵敏度高、特异性强,具有良好的实用性。      

溶藻弧菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

为建立溶藻弧菌(VA)的快速检测方法,本研究以VA Collagenase基因为靶基因设计合成引物及Taq Man探针,建立了实时荧光定量PCR快速检测VA的方法。结果显示,对15株实验菌株进行荧光定量PCR检测,只有VA菌株检测为阳性,表明该检测方法特异性强;该方法的灵敏度为18 cfu/m L;稳定性和重复性实验结果表明,同一样品重复检测4次Ct值的变异系数均小于2%;利用该检测方法对采集的165份样品进行检测,共计检出2份VA阳性样品,与SN/T2564-2010行标法检测结果一致,显示了良好的实用性。该检测方法灵敏度高、特异性强,具有良好的实用性。     

驼乳中布鲁氏菌实时荧光PCR快速检测方法的建立

目的 建立驼乳中布鲁氏菌的实时荧光PCR快速检测方法。方法 根据布鲁氏菌外膜蛋白omp10基因的碱基序列,设计引物其探针,从模拟布鲁氏菌污染的驼乳中提取布鲁氏菌DNA片段进行实时荧光PCR扩增检测。结果 该方法从布鲁氏菌M5株中扩增出了特异性目的片段omp10,而对大肠埃希式杆菌等细菌的扩增结果均为阴性。经过10倍倍比稀释的模板进行检测,该方法的灵敏度为最低可检出2.31×10-4 ng/μL的DNA。标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数为0.9928,扩增效率E=0.97。结论 建立的实时荧光PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高的优点,为驼乳中布鲁氏菌病的早期预防及流行病学监测提供了有效的技术手段。     

SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测乳中携带sea基因金黄色葡萄球菌的研究

金黄色葡萄球菌是引起食物中毒的一种常见的致病菌,而其产生的肠毒素A是乳及乳制品食物中毒事件的主要原因。本研究建立了SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法对乳中携带sea基因的金黄色葡萄球菌进行检测。该方法能快速、稳定地在8h内完成对乳中金黄色葡萄球菌的检测,对人工污染乳中金黄色葡萄球菌检测的最低检出限为83CFU/ml。     

SYBR Green I荧光定量PCR检测乳中携带sea基因金黄色葡萄球菌的研究

金黄色葡萄球菌是引起食物中毒的一种常见的致病菌,而其产生的肠毒素A是乳及乳制品食物中毒事件的主要原因.本研究建立了SYBR Green I荧光定量PCR方法对乳中携带sea基因的金黄色葡萄球菌进行检测.该方法能快速、稳定地在8h内完成对乳中金黄色葡萄球菌的检测,对人工污染乳中金黄色葡萄球菌检测的最低检出限为83CFU/ml.