CXCL1基因重组慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的：采用第2代慢病毒表达载体系统,构建CXCL1基因的慢病毒表达载体,摸索出较传统转染方法更为高效、可靠的转基因方法,为今后进一步的基因靶向治疗研究打下良好的基础。方法：首先扩增CXCL1全长序列,将其与慢病毒载体pWPI连接后测序,通过BLAST检索,鉴定慢病毒表达载体构建成功。将重组慢病毒质粒转染293T细胞,48h后荧光显微镜鉴定,慢病毒转染并包装成功。结果：重组慢病毒质粒CXCL1-pWPI测序结果经BLAST对比分析,与CXCL1基因的同源性达100％。结论：成功的构建了CXCLl基因的重组慢病毒表达系统。     

SUMF2基因过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建硫酸酯酶修饰因子2(SUMF2)基因过表达慢病毒载体,以便进一步研究SUMF2功能。方法 针对人SUMF2 DNA序列设计带酶切位点的引物,PCR法获得目的基因片段;用AgeⅠ和NheⅠ酶双酶切SUMF2基因片段及PLJM1-EGFP载体。用T4连接酶对两种酶切产物进行连接、PCR鉴定、测序。将阳性克隆质粒与包装质粒及包膜蛋白质粒共转染293T细胞,并荧光显微镜观察EGFP的表达。结果 PCR和测序证实成功构建了SUMF2的慢病毒表达载体,病毒效价为1×10⁸ TU/ml。结论 成功构建SUMF2-PLJM1-EGFP慢病毒载体,并在293T细胞中得到表达。     

人胆固醇酯水解酶基因慢病毒载体构建及鉴定

目的构建含有人胆固醇酯水解酶（hCEH）基因的慢病毒表达载体pLenti6．3-hCEH-IRES-EGFP,为hCEH基因治疗缺血性脑卒奠定基础。方法应用聚合酶链反应方法扩增目的片段,在目的基因进行上、下游分别加上PacI和AscI两个酶切位点,经双酶切后,转化入感受态DH5d细胞中,通过筛选获得重组质粒。将目的基因片段和pLenti6.3-IRES-EGFP载体连接,获得慢病毒表达载体pLenti6．3-hCEH—IRES-EGFP,并进行测序。抽提慢病毒载体,转染293T细胞,包装病毒,测定病毒滴度。结果目的基因与慢病毒表达载体pLenti6．3-IRES-EGFP连接,慢病毒表达载体pLenti6．3-hCEH—IRES-EGFP构建与预期相匹配,包装细胞293T呈绿色荧光。结论成功构建了携带hCEH基因的慢病毒载体。     

TAP1基因慢病毒载体的构建

目的:构建TAP1基因慢病毒过表达载体及检测其过表达效率,为制备前列腺癌的免疫细胞疫苗提供基础。方法:将pDONR223-TAP1质粒和pLenti6.3-IRES-EGFP构建形成pLenti6.3-TAP1-IRES-EGFP表达质粒,采用慢病毒包装试剂盒包装产生慢病毒;感染293T细胞后RT-PCR检测目的基因TAP1的表达;采用荧光FACS计算病毒活性滴度。RT-PCR检测转染PC-3细胞后TAP1表达。结果:PCR和测序证实pLenti6.3-TAP1-IRES-EGFP慢病毒质粒构建成功;包装纯化后收集的病毒液滴度经流式细胞仪检测滴度为2.87×107 TU/ml;转染后的PC-3后,TAP1转染组TAP1的表达量显著高于对照组。结论:成功构建人TAP1基因慢病毒过表达载体,可以上调PC-3细胞TAP1的表达。     

小鼠microRNA-150慢病毒过表达载体及抑制载体的构建及鉴定

目的 构建microRNA-150慢病毒过表达载体及抑制载体.方法 设计针对microRNA-150前体的过表达基因片段及针对microRNA-150成熟体的反义片段,应用基因重组技术将目的 基因片段克隆到pWPI慢病毒载体中,并进行DNA测序鉴定重组克隆.结果 菌落PCR筛选鉴定出构建正确的慢病毒载体,DNA测序证实插入的基因序列正确.结论 成功构建microRNA-150慢病毒过表达载体及抑制载体,为研究microRNA-150在肝再生中的作用及其机制提供了稳定的细胞转染载体.     

髓系触发受体-1基因RNAi 慢病毒载体的构建及功能初步检测

目的:构建髓系触发受体-1(TREM-1)基因RNAi慢病毒载体,探讨TREM-1在脆弱类杆菌所致炎症反?khgr;械淖饔谩７椒?根据小鼠TREM-1 mRNA序列选择4个靶序列并设计合成4对双链DNA oligo, 其两端含酶切位点黏端,同时合成1对阴性对照双链DNA oligo;将以上5对双链DNA oligo退火后连入pGCSIL-GFP载体,经PCR及测序鉴定后,将以上质粒分别与包装质粒混合物共转染293T细胞,包装产生病毒颗粒。各组病毒载体转染Raw264.7细胞后,运用real-time PCR和ELISA检测TREM-1 mRNA和蛋白表达水平。实时定量PCR和ELISA观察干扰TREM-1后脆弱杆菌内毒素引发的Raw264.7细胞内毒素血症模型中TREM-1的表达变化。结果:PCR和测序证实目的双链DNA oligo片段已被准确克隆到pGCSIL-GFP载体;各质粒与包装质粒共转染293T细胞后产生了高滴度的慢病毒颗粒;各组慢病毒感染Raw264.7细胞后均可以显著抑制TREM-1的表达,以pGCSIL-GFP/Lenti-1组效果最明显。在脆弱杆菌内毒素引发的体外细胞内毒素血症模型中TREM-1表达明显增高,实时定量PCR表明慢病毒干扰载体能显著抑制模型中TREM-1的表达。 结论:成功构建了小鼠TREM-1基因RNAi慢病毒载体,所构建的慢病毒载体能够抑制脆弱类杆菌内毒素所诱导的TREM-1的表达。     

大鼠Tmub1基因过表达慢病毒载体的构建

目的 构建Tmub1基因的过表达慢病毒载体(LV-Tmub1),为研究Tmub1蛋白在肝细胞增殖过程中的作用提供实验材料.方法 化学合成Tmub1基因序列,用BamHI/AgeI酶切化学合成含有目的基因的质粒及GV287载体,PCR产物连接入线性化表达的载体.PCR鉴定引物,再对PCR鉴定阳性的克隆进行DNA测序和比对分析.使用构建的LV-Tmnb1,转染293T细胞,荧光法检测构建的慢病毒滴度.结果 成功构建了LV-Tmub1,并获得相应的病毒,病毒滴度为2×108 TU/mL.结论 LV-Tmub1为进一步研究Tmub1蛋白在肝细胞增殖中的作用提供了实验基础.     

BLU基因慢病毒表达载体的构建

目的:构建BLU基因慢病毒表达载体。方法:采用PCR技术从人脐带来源的间充质干细胞中扩增出BLU基因,将其接入慢病毒载体(pSL6-IRES-EGFP)中,经菌落PCR、酶切和测序鉴定,然后转染293T细胞观察表达情况。结果:PCR、酶切和测序鉴定克隆了重组子(pSL6-BLU-IRES-EGFP),并在293T细胞中成功表达BLU基因。结论:成功地克隆了含有BLU基因的慢病毒表达载体。     

hTERT基因启动子驱动eGFP的慢病毒载体构建及表达的初步研究

目的 构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因启动子驱动eGFP报告基因的慢病毒载体,观察eGFP在肿瘤细胞中的表达情况.方法 用hTERT基因启动子取代慢病毒载体eGFP上游的CMV启动子;将重组慢病毒载体pLenti-phTERT-eGFP用脂质体介导法转入端粒酶阳性的293FT、HepGⅡ、SGC7901细胞及端粒酶阴性的U2OS细胞中进行功能鉴定,以慢病毒载体pLenti-pCMV-eGFP作为对照,倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况.结果 在端粒酶阳性的3株细胞中均可以观测到绿色荧光蛋白表达;在端粒酶阴性的U2OS细胞中无绿色荧光蛋白表达.结论 hTERT基因启动子在端粒酶表达阳性的细胞中具有较强转录活性;所构建的慢病毒载体为进一步研究、利用hTERT基因启动子提供了较好的实验工具.     

小鼠BTLA基因重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的 :构建小鼠B、T淋巴细胞衰减子(BTLA)基因重组慢病毒载体,探讨BTLA基因过表达对小鼠脾T淋巴细胞增殖及活化的影响。方法:以小鼠脾脏组织总RNA为模板,逆转录为c DNA,通过PCR技术扩增BTLA基因,构建p WPTS-m BTLA慢病毒载体,磷酸钙法感染人胚肾上皮细胞株293T细胞。RT-PCR及Western blot法检测BTLA m RNA和BTLA蛋白表达,50%组织培养感梁剂量(TCID50)法检测重组慢病毒滴度。通过感染p WPTS-m BTLA及p WPTS-GFP慢病毒载体的293T细胞与小鼠脾脏T淋巴细胞混合培养,初步研究BTLA基因过表达对小鼠脾T淋巴细胞活化与增殖的影响。结果:成功构建小鼠p WPTS-m BTLA慢病毒载体,并制备高滴度病毒颗粒(1.3×108pfu/ml)。通过对比实验组与对照组小鼠脾T淋巴细胞的增殖结果 ,发现4 d及8 d T细胞的增殖效应均明显受抑制,差异具有统计学意义(P<0.05),且这种抑制作用在0~8 d内具有时间依赖性。结论:过表达BTLA基因的293T细胞与小鼠脾T淋巴细胞混合培养后对其增殖及活化有抑制作用,提示成功构建具有生物学效应的小鼠BTLA基因重组慢病毒载体。     

大鼠PEDF44mer慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建大鼠色素上皮衍生因子（PEDF）44mer基因的慢病毒表达载体并检测其表达.方法 化学合成PEDF 44mer-6his,亚克隆入GV206载体,测序鉴定.挑取阳性克隆转染293T细胞,实时荧光定量PCR法测定病毒滴度.将已构建的病毒转染293T细胞,RT-PCR和Western blot法检测44mer-6his表达.结果 阳性克隆测序与设计的44mer基因序列完全一致,44mer慢病毒构建成功.实时荧光定量 PCR法检测病毒滴度为2.00E＋9 TU/ml.44mer慢病毒转染293T细胞后,RT-PCR检测到44mer表达.Western blot显示44mer-6his融合蛋白表达阳性.结论 成功设计构建了PEDF 44mer慢病毒,为进一步研究44mer在缺血性心肌病中的作用和机制奠定基础.     

小鼠骨桥蛋白(OPN)基因RNA干扰慢病毒载体的构建及体内抑制效果鉴定

 目的 构建骨桥蛋白(osteopontin,OPN)基因RNA干扰慢病毒载体并在小鼠体内鉴定其抑制效果。方法 参照OPN GenBank上的序列,对OPN基因沉默位点进行分析,设计针对OPN信使RNA的小发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)OPN shRNA及阴性对照(negative control shRNA,NC shRNA)序列,合成pSicoR GFP shRNA重组体。经鉴定序列无误后,与pCMV VSV G 和pCMV dR8.91辅助质粒包装并转染293FT细胞,得到有效滴度为5×109 TU/mL的病毒原液。经尾静脉将构建的慢病毒载体注射入小鼠体内,qRT PCR及Western blot检测小鼠肝脏OPN mRNA及蛋白的抑制效果。结果 成功构建针对OPN的shRNA慢病毒载体,经纯化、浓缩得到滴度为5×109TU/mL病毒原液。与正常对照组、阴性对照组相比,实验组OPN mRNA及蛋白表达水平明显下降;正常对照组、实验组OPN mRNA及蛋白表达水平无明显差别。结论 利用RNA干扰技术,借助慢病毒载体,成功构建小鼠肝脏OPN基因低表达模型。为进一步研究OPN在胆石症等疾病中的作用提供了有力工具。     

大鼠BMP-7基因慢病毒载体构建及其在肝星状细胞中的表达

目的 构建携带大鼠BMP-7基因的慢病毒载体并实现该基因在肝星状细胞株HSC-T6中的稳定高表达,为进一步研究BMP-7的抗肝纤维化功能奠定基础.方法 从大鼠细胞基因中提取并用PCR方法扩增BMP-7目的基因,构建BMP-7重组表达载体Lenti-copGFP/puro-BMP7,脂质体法将重组慢病毒载体和包装质粒混合物共转染293TN工具细胞,包装产生慢病毒颗粒.慢病毒感染H1299细胞,根据细胞绿色荧光蛋白（GFP）的表达水平测定病毒滴度.将HSC-T6细胞分为空白组、空病毒对照组及BMP-7慢病毒感染组,分别用Real-Time PCR和Western blotting方法检测BMP-7 mRNA和蛋白的表达.结果 PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,成功构建大鼠BMP-7基因重组慢病毒载体.倒置荧光显微镜下观察可见,H1299细胞呈绿色荧光,并测得病毒滴度为1×104 ifμ/μL.重组慢病毒感染HSC-T6后,Real-time PCR和Western blotting方法分别检测到BMP-7 mRNA和蛋白均稳定高表达.BMP-7慢病毒感染组与空病毒对照组比较,差异有统计学意义（P〈0.01）;空病毒对照组与空白组比较,差异无统计学意义（P〈0.05）.结论 成功构建了带有大鼠BMP-7基因的慢病毒载体,并实现其在HSC-T6的稳定高表达.     

重组慢病毒载体pLKO-1-EGFP-puro的构建

目的：构建具有绿色荧光蛋白（GFP）标记及嘌呤霉素（puro）抗性的重组慢病毒载体。方法：改建慢病毒载体质粒pLKO-1-puro的多克隆位点（MCS）,以质粒pEGFP-C3为模板扩增出CMV-EGFP并与pLKO-1-puro连接,形成重组的慢病毒载体质粒pLKO-1-EGFP-puro,后者与包装质粒Δ8.2和包膜蛋白质粒VSV-G在293T细胞中进行包装,产生重组慢病毒颗粒,感染非洲绿猴肾细胞Vero细胞,观察GFP的表达。结果：成功改建了慢病毒载体质粒pLKO-1-puro并插入了CMV-EGFP,形成了新型慢病毒载体质粒pLKO-1-EGFP-puro。3质粒共转染293T细胞产生的重组慢病毒颗粒感染Vero细胞后高表达绿色荧光。结论：成功构建了高效的带GFP报告基因及嘌呤霉素抗性的慢病毒载体。     

小鼠内皮抑素基因真核表达载体的构建和表达

目的 构建小鼠内皮抑素（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）ｃＤＮＡ的真核表达载体并将其在体外培养的脑胶质瘤细胞内表达。方法 将带有分泌信号的小鼠ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎｃＤＮＡ克隆入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３,构建ＣＭＶ启动子控制的载体ｐｃＤＮＡ－ｓＥｎｄｏ,并将上述载体转染体外培养的脑胶质瘤细胞（ＳＨＧ４４）,采用ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ鉴定其表达,应艇牛微血管内皮细胞抑制实验检测其活性,结果 成功地构建了真核表达     

pcDNA3-MAGE-1真核表达载体的构建及其在Hepal-6细胞中的稳定表达

目的:构建真核表达载体,并在小鼠肝癌Hepa1-6细胞中稳定表达,观察转染细胞的增殖能力和致瘤能力。方法:用PCR方法扩增SMMC-7721人肝癌细胞株MAGE-1全长序列,连接到真核表达载体pcDNA3中,构建真核表达pcDNA3-MAGE-1,脂质体法转染小鼠Hepa1-6细胞。G418筛选阳性克隆(Hepa1-6- MAGE-1),用RT-PCR和Western blotting检测阳性克隆中mRNA和蛋白质的表达;MTT 法检测Hepa1-6细胞和Hepa1-6- MAGE-1细胞生长和增殖的变化;分别以Hepa1-6细胞和Hepa1-6- MAGE-1细胞接种于C57BL /6j小鼠右侧背部皮下,观察Hepa1-6- MAGE-1细胞的致瘤能力。结果:构建MAGE-1的真核表达载体转染Hepa1-6细胞,PT-PCR与Western boltting检测分别在Hepa1-6- MAGE-1细胞中检测到人MAGE-1基因的mNRA和蛋白质的表达,两组细胞增殖无统计学差异;两组各10只小鼠均皮下成瘤,且肿瘤大小没有明显差异。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3-MAGE-1,获得了稳定表达人MAGE-1基因的小鼠肝癌Hepa1-6细胞株,并具有很好的增殖和致瘤能力。     

NY-ESO-1抗原T细胞受体基因慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建NY-ESO-1抗原T细胞受体基因（TCellReceptor,TCR）的慢病毒载体并获得重组慢病毒。方法设计特异性NY-ESO-1TCR的引物,用聚合酶链反应（PCR）对我们前期已克隆的NY-ESO-1TCRcDNA进行体外扩增,双酶切后定向插入到pCL20c-MSCV-GFP质粒,构建NY-ESO-1抗原特异性TCR基因的重组慢病毒载体pCL20c-MSCV-ESOTCR,并经酶切、PCR及测序鉴定。用pCL20c-MSCV-ESOTCR﹑pCL20c-HIV-gp、pCAG4-RTR2和CAG-VSV-G共转染T293包装细胞,获得上清,上清浓缩后感染Hela细胞,观察ESOTCR基因及蛋白水平的表达。结果经PCR及测序证实,成功构建重组慢病毒载体pCL20c-MSCV-ESOTCR,包装产毒后感染Hela细胞,RT-PCR法及荧光显微镜均能检测及观察到基因及蛋白水平的表达。结论成功构建了表达NY-ESO-1抗原T细胞受体基因（TCellReceptor,TCR）的重组慢病毒载体。     

LOX-shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的 构建LOX-shRNA的慢病毒表达载体及其病毒包装鉴定。方法 利用Oligo Designer 3.0,根据人LOX基因序列设计shRNA,并合成包含正、反义靶序列的互补DNA链,退火后插入LOX表达载体中,构建shRNA表达质粒,并转化至E.coli TOP10感受态细胞,抽提质粒后进行测序。将重组质粒转染HEK-293T细胞,应用RT-PCR检测各组LOX基因mRNA的表达水平,筛选出最有效的LOX-shRNA后,通过LipofectAMINETM2000介导转染293T细胞,对慢病毒进行包装并测定慢病毒滴度。结果 利用慢病毒介导将重组质粒LOX-shRNA-3024高效转导入HEK-293T细胞并稳定表达。荧光显微镜显示,转染24h后,HEK-293T细胞即开始发出绿色荧光;72h后,有大量荧光表达,而对照组未转染质粒的HEK-293T细胞不表达,可见慢病毒载体被成功转染。LOX-3024重组慢病毒的滴度为2×10¹⁰TU/ml。结论 成功构建LOX-shRNA慢病毒表达载体,并稳定转染HEK-293T细胞,为研究LOX对人阴道壁成纤维细胞生物学行为的影响提供了实验基础。     

大鼠EAAT3真核表达载体的构建及在Hella细胞中的表达

目的:克隆大鼠谷氨酸转运蛋白3(EAAT3)的cDNA,构建其真核表达载体并转染Hella细胞.方法:从大鼠的脑组织中提取RNA,采用RT-PCR技术扩增EAAT3的基因编码区序列,将序列定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1( ). 经酶切及测序鉴定后用阳离子脂质体将其转染到Hella细胞中,通过免疫印迹法鉴定其表达.结果:经双酶切、测序鉴定证实EAAT3基因的真核表达载体构建成功.免疫印迹法证实EAAT3基因的表达.结论:成功克隆了EAAT3编码区序列,并构建了其真核表达载体,为以EAAT3为基础的中枢神经系统疾病的治疗奠定了基础.     

小鼠肝脏特异的微RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的利用分子克隆技术,构建微RNA(microRNA,miRNA)真核细胞载体.方法人工合成小鼠肝脏特异的微RNA(miR-122)前体基因序列,并添加酶切位点及polyT转录终止序列,经退火处理后形成双链结构,插入小干涉RNA(small interfering RNA,siRNA)表达载体pAVU6 27中,经酶切鉴定和测序证实后,构建成为miR-122真核表达载体(pAVU6 27-mir122).结果合成的基因序列完全正确并成功克隆到真核表达载体pAVU6 27上.结论 miR-122真核表达载体的构建,为进行真核细胞转染及miR-122表达的研究奠定了基础.