绿色荧光蛋白结合蛋白的表达纯化与鉴定

绿色荧光蛋白(GFP)及其衍生物已经被广泛应用于生物化学和分子生物学研究,其纳米抗体(GBP)也已在近期被鉴定,但GBP大规模表达及纯化流程优化尚未见报道,并且GBP与不同荧光蛋白之间的亲和力尚未被测定.我们首先构建了GBP基因(GBP1)的原核表达系统,然后通过Ni-NTA亲和层析和Mono Q阴离子交换层析纯化,每升菌液能够得到超过43mg、纯度超过95%的重组GBP1蛋白.我们通过MALDI-TOF/TOF质谱法测定纯化的GBP1的精确分子量,通过微量热泳动(MST)和等温滴定量热(ITC)实验检测GBP1与7种不同来源荧光蛋白的亲和力.结果显示GBP1特异性地与源自Aequorea victoria的荧光蛋白及其衍生荧光蛋白相互作用,与RFP和Zoanthus GFP等无相互作用.GBP1与EGFP和sfGFP的亲和力最高,与YPet和T-Sapphire的亲和力稍弱,与CyPet的亲和力最低.     

重组人干扰素α2b和胸腺肽αl融合蛋白的分离纯化

考察了大肠杆菌E.coli表达的重组人干扰素α2b和胸腺肽αl融合蛋白包涵体的变性、复性及融合蛋白的分离纯化过程。实验结果表明：包涵体经7mol/L盐酸胍,10mmol/L DTT变性;1mol/L尿素,2mmol/L还原型谷胱甘肽,0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽脉冲加样稀释复性;金属螯合层析收集0.3mol/L咪唑洗脱峰,冷干后经重组肠激酶30℃酶切24h、Sephadex G50 柱纯化,可得到纯度达90%的重组人干扰素α2b和胸腺肽αl融合蛋白,且最终目的融合蛋白产量达68mg/g干菌体。     

绿色荧光蛋白标记的NTE活性域表达载体的构建及表达

利用含有特定限制性内切酶识别位点的引物,通过聚合酶链式反应扩增出人神经病靶标酯酶活性域的编码序列,经T载体克隆测序正确后,双酶切回收特异片段定向插入到增强型绿色荧光表达载体pEGFP-N3中,通过酶切反应鉴定,构建了绿色荧光蛋白标记的神经病靶标酯酶活性域的融合表达载体pNEST-EGFP.采用脂质体转染的方法将其转染到人神经瘤母瘤细胞SH-SY5Y中,用荧光显微镜观察发现神经病靶标酯酶活性域分布于细胞质中,而且没有导致内质网膜的聚集,表明表达载体成功构建和表达.     

大鼠谷氨酰胺转运蛋白EGFP-SNAT3融合蛋白的表达与鉴定

SLC38基因家族编码的Na+偶联的中性氨基酸转运蛋白3(SNAT3)是System N中的一员.它在大脑谷氨酸-谷氨酰胺循环以及肝细胞质膜的谷氨酰胺转运等生理过程中发挥着重要作用.为了方便检测SNAT3在细胞膜上的表达与定位,本研究采用PCR扩增和酶切连接技术将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与SNAT3的N末端连接,通过菌液PCR、酶切和DNA测序验证得到pBK-CMV(Δ[1098-1300])-EGFP-SNAT3重组真核表达质粒.用脂质体转染法将构建好的质粒瞬时转染进入人体胚肾细胞(HEK293T cells),利用激光扫描共聚焦显微镜和Western blot技术检测EGFP-SNAT3融合蛋白的表达和亚细胞定位.结果表明,EGFPSNAT3重组质粒在细胞中正确表达并定位于细胞膜上.EGFP-SNAT3重组质粒的成功构建将有助于日后进一步研究SNAT3的结构和功能.     

绿色荧光蛋白标记S2P在集胞藻6803中的表达

为研究集胞藻6803中两个S2P同源蛋白酶Slr0643和Sll0862的功能,分别在两个蛋白酶的羧基端添加增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标签,构建了两株转基因集胞藻psbA2::0643GFP-Cmr/△0643-Kmr和psbA2::0862GFP-Cmr/△0862-Kmr.通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测到egfp基因的转录表达,通过激光共聚焦显微镜检测到转基因集胞藻细胞发出的绿色荧光蛋白荧光,表明带EGFP标签的S2P融合蛋白在psbA2启动子调控下正确表达.     

人RIP2基因启动子绿色荧光蛋白表达载体的构建与鉴定

目的:构建人RIP2基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体。方法:根据特定限制性内切酶位点,以人基因组DNA为模板,PCR扩增含人RIP2基因启动子不同长度2段序列,构建含人RIP2基因启动子驱动的绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2-RIP2(750 bp)wt、pEGFP-C2-RIP2(941 bp)wt,用VspⅠ和NheⅠ双酶切鉴定重组质粒,进行DNA序列分析,重组质粒经阳离子聚合物JetPeiTM介导转染HEK293细胞48 h后观察。结果:酶切鉴定和序列测定证实目的基因已插入重组质粒;细胞转染结果表明,重组质粒转染HEK293细胞均能表达绿色荧光,其中构建的pEGFP-C2-RIP2(750 bp)wt重组质粒绿色荧光表达强于pEGFP-C2-RIP2(941 bp)wt。结论:成功构建2段不同长度的人RIP2基因启动子绿色荧光蛋白表达载体。     

α2b干扰素基因与Ag85B基因在毕赤氏酵母中的融合表达

Ag85是结核分枝杆菌的一种分枝菌酸转移酶复合体,在结核分枝杆菌的细胞壁合成过程中起着重要作用Ag85B是该复合体的一个组分,具有较好的免疫原性通过连接多肽（G4S）4的编码序列,将α2b干扰素基因与Ag85B基因连成融合基因,然后克隆到毕赤氏酵母表达载体pPIC9上,转化Pichia pastoris SMD1168后获得重组酵母工程菌SMD1168／pPIC9-α2bAg85B,经甲醇诱导培养,发酵上清液经抗病毒活性测定,Western blot鉴定以及初步纯化,结果表明,分泌表达的融合蛋白具有一定的抗病毒活性．     

绿色荧光蛋白标记的NTE活性域表达载体的构建及表达 

利用含有特定限制性内切酶识别位点的引物，通过聚合酶链式反应扩增出人神经病靶标酯酶活性域的编码序列，经T载体克隆测序正确后，双酶切回收特异片段定向插入到增强型绿色荧光表达载体pEGFPN3中，通过酶切反应鉴定，构建了绿色荧光蛋白标记的神经病靶标酯酶活性域的融合表达载体pNESTEGFP。采用脂质体转染的方法将其转染到人神经瘤母瘤细胞SHSY5Y中，用荧光显微镜观察发现神经病靶标酯酶活性域分布于细胞质中，而且没有导致内质网膜的聚集，表明表达载体成功构建和表达。     

绿色荧光蛋白基因在裂殖酵母中的表达

将绿色荧光蛋白基因编码区序列克隆到大肠杆菌－裂殖酵母穿梭质粒ｐＲＥＰ３的ＢａｍＨⅠ￣ＳｍａⅠ位点,使之位于一个受硫胺素抑制的启动子和终止子的控制之下,用该质粒转化裂殖酵母,转化菌落于阳光下呈绿色,在３９５ｎｍ紫外光下发出强烈绿色荧光,在荧光显微镜下,用蓝光激发,可见该基因的表达明显受硫胺素的抑制,在没有选择压力的条件下,质粒丢失现象很严重,在完全培养基上,只有２０％的细胞发光,在丰富培养基上,发光     

类弹性蛋白多肽-红色荧光蛋白融合蛋白的表达纯化及细胞相容性

目的 构建携带红色荧光蛋白(mCherry)标签的类弹性蛋白(ELP)原核表达载体,并表达纯化ELP-mCherry融合蛋白,探讨ELP-mCherry融合蛋白与细胞的相容性.方法 对利用限制性内切酶Xba I和Xho I对mCherry质粒和pET28a-ELP载体同时进行双酶切,将酶切产物回收、连接并转化DH5α大...     

重组人干扰素α2a和胸腺肽α1融合蛋白的分子设计及其基因表达产物的鉴定

人干扰素α_2a（IFNα_2a）和胸腺肽α₁（THYα₁）联合使用效果远大于各自单独使用的效果，本文通过DNA重组技术将两者构建成一个融合蛋白药物。首先，依据IFNα_2a和THYα₁的分子结构，设计了一个连接肽，将IFNα_2a和THYα₁相连，并分别位于该融合蛋白的N端和C端。在此基础上，构建出表达载体pCJ101质粒，获得的阳性克隆307在2×YT培养基小试中，产物变性复性后经DEAE-Sepharose柱层析纯化后，在SDS-PAGE上得到相对分子质量为23000的谱带。经鉴定，融合蛋白中干扰素α_2a的比酶活性为1.34mol/s·g；检测胸腺肽α₁的活性，显示活性E玫瑰花结形成率达到20%。结果表明，融合蛋白中两种药物蛋白均较好地保持各自的生物功能，为继续研究奠定了良好基础。     

基于GFP-nanobody的纯化酵母表达RIIIJ-GFP蛋白研究

采用大肠杆菌重组表达GFP-nanobody后,将其与琼脂糖凝胶偶联,对酵母菌分泌表达RIIIJ-GFP蛋白纯化. 荧光显微镜下观察到绿色荧光凝胶珠,SDS-PAGE检测GFP-nanotrap纯化的蛋白条带单一,且胶上可直接观察到GFP绿色荧光. 表明大肠杆菌表达的GFP-nanobody具有生物活性,可高效结合RIIIJ-GFP,这为RIIIJ蛋白功能的研究奠定基础.     

pPET-SUMF2各亚型的原核质粒构建及蛋白表达

构建人硫酸酯酶修饰因子2(SUMF2)基因各亚型的融合表达载体并在大肠杆菌中诱导表达pPET-SUMF2各亚型的融合蛋白。用EcoRI和XhoI双酶切人SUMF2各种亚型基因及质粒pPET-30a;将2种酶切产物按常规方法连接、转化至大肠杆菌DH5α。挑取菌落培养,提取质粒进行验证。将构建成功的pPET-SUMF2各亚型重组表达质粒转化至BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳分析以及Western blot检测SUMF2各亚型的融合蛋白表达。成功构建了pPET-SUMF2各亚型的重组表达质粒,并成功诱导SUMF2各亚型融合蛋白的表达,Western blot结果显示在预期位置有特异蛋白条带表达,并在BL21(DE3)内表达了SUMF2各亚型的融合蛋白,为进一步研究SUMF2的功能以及SUMF2与哮喘发病的关系奠定了基础。     

红色荧光蛋白DsRed2基因在大肠杆菌中的表达和观察及其在本科实验教学中的应用

用PcR方法从质粒pDsRed2-1中扩增获得DsRed2,亚克隆到pMD19-T载体上,然后酶切将DsRed2分别插入到原核表达载体pET-Trx和pGEX-4T1上,转入E.coli BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达.在LB平板培养基上或液体培养基中直接观察菌体颜色,最后用SDS-PAGE检测DsRed2蛋白的表达.结果显示构建的重组载体pET-Trx-DsRed2和pGEX-GsT-DsRed2在E.coli中成功表达,且不形成多聚体.LB平板培养基上和IPTG诱导24h后的液体培养基中都能直接观察到红色荧光,说明DsRed2可以作为原核表达系统的报告基因.     

荧光定量检测细胞绿色荧光蛋白技术的建立与应用

绿色荧光蛋白是在生化与分子生物学研究领域中普遍使用的一种基因表达报告系统显色物.对于细胞内绿色荧光蛋白表达水平的定量检测,目前尚缺乏一套准确﹑简便﹑易行的技术.本文以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,用分子量为25 ku的线性聚乙烯亚胺介导进入HeLa细胞并表达.利用多功能酶标仪测定细胞裂解液的荧光强度,结果显示:这种新方法测定的荧光强度能很好反映细胞中EGFP的蛋白表达水平,并在短时间内完成对EGFP表达水平的定量检测.该方法简单有效,且不依赖于大型仪器设备,具有较高的准确性与灵敏度,在实际应用中简便可靠,具有推广应用的意义.     

带有绿色荧光蛋白基因（gfp）的植物重组表达质料 …

利用ＤＮＡ重组技术,将经定点突变改造的绿色荧光蛋白基因（ｇｆｐ）克隆到植物表达载体ｐＢＩ－１２１中,成功地构建了植物重组表达质粒ｐＢＩ－ＧＦＰ。     

利用加强型绿色荧光蛋白标记黄色单胞菌的研究

通过连接T载体与来自质粒pSEBG上的egfp基因而构建成质粒pZTE,并将质粒pZTE的egfp基因插入到自杀质粒pTnMod-OGm转座子上的多克隆位点Kpn I和Sal I中构建成质粒pTE-OGm,最后pTE-OGm的egfp基因转座子元件通过转座作用插入到受体菌黄色单胞菌L1的染色体中,从而使黄色单胞菌L1获得较稳定的绿色荧光标记,为进一步在MBR反应器中更好地示踪黄色单胞菌L1的生长和迁移情况奠定了基础。     

绿色荧光蛋白基因在烟草植株中的表达

用冻融法将含有绿色荧光蛋白基因的质粒ｐＧＬ２－ＧＳ导入农杆菌菌株ＬＢＡ４４０４（ｐＴＯＫ２３３），两个质粒发生同源重组，形成一个元载体ｐＴＯＫ２３３－ＧＳ，农杆菌菌株ＬＢＡ４４０２４（ｐＴＯＫ２３３－ＧＳ）经叶盘法转化烟草，筛选具有卡霉素抗性的愈伤组织，诱导成苗、ＰＣＲ扩增发现，绿色荧光蛋白基因在９０％的再生存在，在荧光显微镜下，使用蓝色激发光观察再生植株的徒手切片和压片发现，８０％以上的再生植株     

RNA干扰技术抑制SGIV ICP18绿色荧光融合蛋白表达的研究

 将含有新加坡石斑鱼虹彩病毒（Singapore grouper iridovirus,SGIV）ICP18基因的真核表达载体pEGFP-ICP18转染到胖头鲤细胞（Fathead minnow cells,FHM）中进行融合表达,用荧光显微镜观察到ICP18 GFP融合蛋白呈点状分布于FHM细胞的细胞质中。根据SGIV ICP18的序列,设计并体外化学合成了特异性干扰SGIV ICP18的siRNA（siRNA ICP18）,与pEGFP ICP18共转染到FHM细胞中,通过荧光显微镜观察不同时间点的荧光强度变化。与序列非特异性siRNA（siRNA negative）阴性对照相比,转染后24~48 h,共转染siRNA ICP18和pEGFP ICP18的实验细胞中发荧光的细胞数量较阴性对照少60%~80%左右,说明体外化学合成的siRNA-ICP18可有效抑制FHM细胞中外源导入SGIV ICP18基因的表达。     

TD1修饰绿色荧光蛋白透皮功能的研究

TD1作为一种含有11个氨基酸的短肽,具有良好的促进蛋白类大分子透皮的功能.过去的研究显示TD1可以有效协助胰岛素通过皮肤进入循环并最终降低血糖.在本研究中我们构建了一种TD1 N端修饰的GFP融合蛋白(TGFP). 我们的实验表明, 与TD1与GFP蛋白的混合物相比, TGFP具有更加良好的透皮功能.这一发现为透皮给药研究提供了一条新的途径,并对解释TD1透皮功能具有指导意义.