表达产甲酸草酸杆菌草酸分解基因的人肝细胞系的构建

目的：构建表达产甲酸草酸杆菌（Ox．F）草酸分解基因的人肝细胞系,探索高草酸尿的治疗方法。方法：分离培养人肠道Ox．F并克隆其功能基因OXC和fre,构建同时表达OXC和fre的真核双表达载体质粒pIRES—oxc-frc,将pIRES-oxe—fre转染人正常肝细胞系L—02。用RT—PCR和Western blot技术了解转基因细胞的目的基因表达状况;用离子色谱法测定转基因后细胞培养液中草酸浓度,了解其草酸分解功能。结果：转基因后人肝细胞系L-02在mRNA和蛋白质水平均成功表达OXC和fre基因,其草酸分解功能较转染前明显增强（P〈0．01）。结论：Ox．F分解草酸的两个重要功能基因OXC和frc能在体外转入人正常肝细胞（L-02）中,并使后者草酸分解能力明显增强。转草酸分解基因的人肝细胞系的构建,有望用于高草酸尿,尤其是PH的病因治疗,值得进一步研究．     

人肠道产甲酸草酸杆菌的分离培养

目的探讨产甲酸草酸杆菌分离培养及鉴定方法。方法应用选择性培养基,在37℃厌氧环境下分离培养人肠道产甲酸草酸杆菌。通过观察菌落形态、细菌涂片染色镜检、离子色谱仪及核酸序列分析,对细菌进行鉴定。结果产甲酸草酸杆菌菌落形态为白色点状或梭状,大小约(0.1~0.5)mm×(1.0~3.0)mm;菌落周边出现直径约3.5~4.5 mm的清晰透明圈。该细菌为革兰氏阴性杆菌,大小约(1.0~1.6)μm×(3.0~6.5)μm。液体培养基中草酸浓度随细菌浓度增加而逐渐下降。与文献报道核酸序列比较,该细菌分解草酸的功能基因frc、oxc的核酸同源性分别为95.8%及93.6%。结论产甲酸草酸杆菌可通过选择性培养基、在厌氧环境下从人粪便中分离出来。     

产甲酸草酸杆菌甲酰辅酶A转移酶基因和草酰辅酶A脱羧酶基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的 构建国人肠道来源产甲酸草酸杆菌(OxCF)甲酰辅酶A转移酶(FCoAT)基因(FRC)和草酰辅酶A脱羧酶(OCoAD)基因(OXC)的重组慢病毒pLenti6.3-FRC-IRES-EGFP和pLenti6.3-OXC-IRES-DsRED,为高草酸尿症的基因治疗奠定基础.方法 采用Taq高保真DNA聚合酶从OxCF基因组中扩增FRC基因和OXC基因片段,用DNA凝胶回收试剂盒切胶回收,用DNA连接试剂盒将回收产物分别与pMD18-T Simple载体连接获得FRC和OXC的克隆载体,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆并测序,筛选携带完整目的基因质粒pMD18T simple-FRC和pMD18T simple-OXC,用BamH Ⅰ酶切获得目的基因,连接FRC和携带绿色荧光蛋白的pLenti6.3/v5DEST-IRES-EGFP,连接OXC与表达红色荧光蛋白的pLenti6.3/v5 DEST-IRES-DsRED,转化DH5α后挑取阳性克隆并测序.构建的慢病毒过表达载体pLenti6.3-FRC-IRES-EGFP和pLenti6.3-OXC-IRES-DsRED转染HEK293T细胞,包装并测滴度.结果 聚合酶链反应(PCR)从OxCF基因组中扩增分获得1.3kb和1.7kb的DNA片段,与Genbank中FRC( U82167)间碱基序列匹配率为95.88％,存在53个碱基的变异;与Genbank中OXC( M77128)间碱基序列匹配率为93.61％,存在109个碱基的变异;测序证实pLenti6.3-FRC-IRES-EGFP和pLenti6.3-OXC-IRES-DsRED分别含有大小正确的正向FRC cDNA和OXC cDNA,转染HEK293T细胞实验24h后,在荧光显微镜下相应可见大量绿色荧光和红色荧光,两种慢病毒滴度分别为1.15×108 TU/ml和9.75×107 TU/ml.结论 成功构建表达OxCF中草酸分解关键基因FRC和OXC的重组慢病毒载体,并通过转染293细胞制备了高滴度慢病毒.     

中国人肠道产甲酸草酸杆菌oxc基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的 观察中国人肠道产甲酸草酸杆菌(Ox.F)草酰辅酶A脱羧酶基因(oxc)的分离、克隆及其在293细胞中的表达.方法 提取中国人肠道Ox.F的基因组DNA,PCR扩增oxc基因片段并克隆入真核表达载体pEGFP-C1,通过限制性内切酶酶切电泳和测序鉴定基因片段.将重组质粒脂质体转染至293细胞,利用RT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测oxc基因在真核细胞中的表达.结果 中国人肠道产甲酸草酸杆菌oxc基因全长1707 bp,与Gene Bank中的序列比较,碱基序列的同源性为93.61%,氨基酸残基序列的同源性为97.18%.重组质粒转染293细胞后24～48 h,可观察到明亮的绿色荧光,从mRNA和蛋白水平上可以检测到oxc基因在真核细胞中的表达.结论 中国人肠道产甲酸草酸杆菌中可以分离出oxc基因;中国人肠道产甲酸草酸杆菌oxc基因存在一定的变异;oxc基因可在真核细胞293细胞中表达.     

中国人肠道产甲酸草酸杆菌frc基因的分离及其在真核细胞中的表达

目的：探讨中国人肠道产甲酸草酸杆菌甲酰辅酶A转移酶基因（frc）的分离、克隆和鉴定。方法：提取中国人肠道产甲酸草酸杆菌的基因组DNA,利用PCR技术扩增frc基因片段并克隆入真核表达载体pEGFP—C1,重组质粒命名为pEGFP—frc,通过限制性内切酶酶切电泳和测序鉴定插入片段。将pEGFP—frc通过脂质体转染293细胞,通过逆转录PCR（RT—PCR）和蛋白印迹（Western blot）分别从mRNA和蛋白水平检测frc基因在真核细胞中的表达。结果：中国人肠道产甲酸草酸杆菌fre基因全长1287bp,存在53个碱基和4个氨基酸残基的变异,与GenBank中的frc基因的碱基序列的同源性为95．88％,氨基酸残基序列的同源性为99．07％。转染293细胞后24-72h,可观察到明亮的绿色荧光,RT—PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白水平上检测到frc基因在真核细胞中的表达。结论：中国人肠道产甲酸草酸杆菌中可以分离出frc基因;中国人肠道产甲酸草酸杆菌frc基因存在一定的变异;frc基因可在真核细胞293细胞中表达。     

耐热果胶裂解酶基因pel9A的克隆和表达

利用PCR技术从耐热梭状芽孢杆菌（Clostridium stercorarium）中扩增得到产耐热果胶裂解酶的结构基因pel9A,并将其克隆于表达载体pET28a中,最后将此重组质粒转化到受体菌E.coli BL-21中进行表达.诱导条件为：37 ℃诱导5 h,IPTG浓度为0.8 mmol/L.重组菌经IPTG诱导和SDS-PAGE分析表达的蛋白质的相对分子质量为130 000,与预期相对分子质量相符.细胞经超声破碎后,测得果胶酶的比酶活为15 U/mg粗蛋白.     

产甲酸草酸杆菌FRC基因慢病毒表达载体构建及鉴定

产甲酸草酸杆菌(Oxalobacter formigenes,Ox.F)是一种寄居于脊椎动物胃肠道、依赖分解肠道草酸生存的革兰阴性菌[12].我们采用基因克隆重组技术从前期分离培养的中国人肠道Ox.F[3]中克隆了草酸分解关键酶--甲酰辅酶A转移酶(FCoAT)基因FRC,并成功构建重组慢病毒表达载体pLenti6.3-FRC-IRES-EGFP,为高草酸尿症基因治疗提供基础.     

肠道菌群和抗生素与肾结石的形成

肾结石是一种常见的泌尿系统疾病,其形成机制较为复杂,目前研究发现肾结石的形成与肠道微生物有关,如产甲酸草酸杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠埃希氏菌等,同时发现抗生素的使用易增加肾结石形成风险,本文就肠道菌群、抗生素与肾结石形成之间的关系作一综述。     

钝齿棒杆菌产精氨酸代谢途径中argB基因的扩增及其序列分析

根据GenBank报道的谷氨酸棒杆菌ATCC13032序列,设计并合成一对引物,获得了全长argB基因片段.将其克隆到pGEM T Easy载体中,经测序鉴定后,以其为DIG标记探针,通过SouthernBlot分析钝齿棒杆菌A.S1.542与谷氨酸棒杆菌ATCC13032,argB基因核苷酸同源性高达99%,氨基酸序列95%相同.     

半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中过量表达及IPTG诱导条件

从嗜热脂肪芽孢杆菌 (IAM 110 0 1)中克隆出编码热稳定的半乳糖苷酶蛋白基因bgaB ,构建具T7强启动子的pET 2 0 (b) bgaB质粒 ,并在大肠杆菌BL2 1(DE3)中进行表达 .经IPTG诱导后 ,重组菌周质中乳糖酶酶活达到 0 .12U /mL ,胞内酶活为 1.35U /mL ,比酶活为 6 .6 6U/mg蛋白 ,比酶源菌产生的酶活提高 5 0倍 .通过对IPTG诱导时机、诱导浓度和诱导时间的优化研究 ,重组菌产生的比酶活进一步提高至酶源菌的 90倍 .     

Role of Oxalobacter formigenes in preventing calcium oxalate kidney stones

Objective To screen Oxalobacter formigenes (OxF) from fresh feces of healthy adults, and study its effect on the the prevention of calcium oxalate kidney stones. Methods OxF was screened and cultured from fresh feces of healthy adults. The rat model of calcium oxalate stone was established by esophageal gavage of 0.8% of ethylene glycol. Rats were divided into a control group and four groups of rats with ethylene glycol-induced calcium oxalate kidney stones according to random number table. Three groups were treated with 106 CFU, 107 CFU, 108 CFU viable OxF every day, respectively, for 4 weeks. The blood and 24-hour urine samples were collected to detect the serum creatinine, urea nitrogen, serum and urine calcium, phosphorus, magnesium and urine oxalate every week. At the end of the 4th week, the rats were sacrificed and the kidney tissues were stained with HE and Yasue. The deposition and content of calcium oxalate crystals were observed under a light microscope. Results The bacteria strain isolated from fresh feces of healthy adults was 100% as same as the known ATCC35274 bacteria strain, which means the strain screened is OxF. Among the 5 groups, there were no significant differences in body weight, Scr, BUN, serum calcium, blood magnesium, blood phosphorus, urinary magnesium and urinary phosphorus. The 24-hour urinary calcium excretion in the model group was significantly lower than that of the control group (P＜0.05). After intervention with OxF solution, the 24-hour urinary calcium excretion in the 108 CFU OxF group was significantly higher than that in the model group (P＜0.05), while there was no significant difference between the other intervention groups and the model. The oxalic acid excretion of 106 CFU OxF group and 107 CFU OxF group was lower than that of the model, but the difference did not reach statistical significance (P＞0.05). The 24 h oxalic acid excretion in the 108 CFU OxF group was significantly lower than that of the model at the end of first week (P＜0.05), and continued to decrease for the next 3 weeks. After 4 weeks of intervention, no crystal formation was observed in the control group under the deflection microscope, but a large amount of calcium oxalate crystals were formed in the renal cortex and renal medulla. The crystals were piled up and connected to each other. Yasue staining coincided with the calcium oxalate crystal in the same part of the kidneys. Compared with the model, there was no significant change in the score of calcium oxalate crystal in the kidneys of 106 CFU OxF group and 107 CFU OxF group, while the score of calcium oxalate crystal in the kidneys of 108 CFU OxF group was significantly lower (P＜0.05). Conclusions OxF are successively screened from healthy adults. Daily administration of 108 CFU OxF can safely and effectively reduce the urinary oxalic acid excretion, prevent the formation of calcium oxalate crystals and inhibit the formation of stones in kidneys of rats.     

E-Cadherin基因在乳腺癌中的表达及临床意义

目的：研究E－Cadherin基因在乳腺癌中的表达及临床意义。方法：应用免疫组织化学方法（SABC法），检测92例乳腺癌组织E－Cadherin基因蛋白的表达，同时观察与腋淋巴结和远处转移的关系。结果：乳腺癌E－Cadherin基因表达阳性率为48．9％（45／92）。无淋巴结转移组E－Cadherin阳性率62．2％（28／47），明显高于淋巴结受累组表达阳性率36．2％（17／47）（P＜0．05）。E－Cadherin阳性组远处转移率15．6％（7／45），低于阴性组远处转移率34％（16／47，P＜0．05），E－Cadherin基因表达与疾病缓解期无关。结论：提示E－Cadherin基因在乳腺癌病程中起重要作用，对筛选乳腺癌术后高危转移患者，加强随访诊治有一定参考意义。E－Cadherin低表达可能提示病人预后不良。     

人生长激素基因的克隆、高效表达及纯化

目的 研究人生长激素(hGH)基因在原核中的高效表达、纯化及鉴定。方法 设计带双酶切位点引物,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法获得hGH cDNA片段,并亚克隆入pUC19质粒中进行 DNA序列测定。将 hGH cDNA片段克隆入原核表达载体 pBV220中进行表达。表达产物经 7mol/L 盐酸胍裂解变性、复性、层析等一系列纯化研究,纯化产物经SDS-PAGE电泳,高压液相色谱法(HPLC)纯度分析及活性测定,并通过N末端氨基酸序列测定鉴定表达产物。结果 RT-PCR扩增所得片段大小与预期值一致。pBV220-hGH表达产物经SDS-PAGE电泳显示,分子量为 22×10~3与预计结果相符。rhGH表达量占菌体总蛋白量的 40％。表达产物纯化后,纯度达 97％以上,比活性大于 3.0 IU/mg。纯化产物经 N末端 15个氨基酸测定验证,为重组人生长激素。结论 成功构建了 pBV220-hGH原核表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达,表达产物经纯化得到纯度≥97％的 rhGH,比活性大于 3.0 IU/mg。该研究为 rhGH的中试生产奠定了基础。