脂肪组织工程的新视角——脂肪间充质干细胞

文章对脂肪组织的来源，细胞的分离、纯化、培养及分子调控，细胞外基质的作用，细胞外微环境的影响进行综述。种子细胞的最佳来源是胚胎干细胞。研究表明过氧化物酶增殖体复合物在成脂分化中起主要调控作用，CCAT增强结合蛋白与ADD-1可启动和维持向脂肪方向分化作用，PPAR与配体结合激活脂肪发育过程中关键基因的转录，而AhR基因起负向调节作用。体外微环境培养中，起作用的是氧分压、pH值和黏附因子。     

小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养及肠道归巢

背景：脂肪来源间充质干细胞因其取材安全、创伤小、易纯化、增殖快等优点而备受关注。 目的：建立一种有效、快速分离培养较高纯度小鼠脂肪间充质干细胞的方法,荧光标记后探索其是否可在体内向肠道归巢。 方法：取小鼠腹股沟及附睾脂肪,用0.1%Ⅰ型胶原酶消化得到单细胞,并与剩余未消化脂肪组织块一起接种,贴壁培养获得脂肪间充质干细胞,通过细胞形态、细胞表型、生长动力学、成骨成脂分化潜能4个方面进行鉴定,并将脂肪间充质干细胞用PKH67标记后经尾静脉注射移植到溃疡性结肠炎模型小鼠体内,观察其向肠道的归巢情况。 结果与结论：脂肪间充质干细胞镜下呈梭形,快速增殖呈漩涡状排列,细胞高表达 CD29、CD44、CD90,不表达CD45。成骨诱导碱性磷酸酶染色显示有黑色颗粒生成,茜素红S染色呈红色结节,成脂诱导油红O染色显示有大量脂滴。细胞生长曲线显示第3-5天为对数增长期,细胞生长活力良好。结肠冰冻切片在荧光显微镜下可见绿色荧光光点,并随时间推移有增加趋势。以上结果表明采用胶原酶消化加组织块贴壁法体外分离培养的脂肪间充质干细胞增殖快、纯度高,可向成骨成脂细胞分化,在体内可向结肠归巢并增殖。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

猪的脂肪和骨髓来源间充质干细胞培养特性比较

目的明确小型猪的脂肪来源间充质干细胞（A_r_MSCs）和猪的骨髓来源间充质干细胞（BM—MSCsl体外培养特性的异同。方法广西巴马小型猪,雌雄不限,猪龄4～6个月,体质量20～30kg。AT-MSCs来源于小型猪腹股沟皮下组织．BM—MSCs来源于小型猪的骨髓组织。培养AT-MSCs和BM—MSCs并观察它们的细胞形态。流式细胞仪检测Arr_MSCs和BM—MSCs的表面标志物（CD29、CD34、CD45、CD90）。分别观察Arr-MSCs和BM—MSCs的细胞生长分化能力;实时聚合酶链反应（PCR）检测基因表达。结果流式细胞仪检测结果表明,A．r_MSCs和BM—MSCs均表达CD29[分别为（99．06±0．30）％、（99．94±0．05）％]、CD90[分别为（97．404-0．40）％、（97．43±1J29）％1阳性,CD34、CD45阴性。AT-MSCs传代需培养5～7d,而BM—MSCs需培养7～10d。与BM—MSCs比较,AT—MSCs具有更强的生长分化能力。实时PCR检测基因表达结果显示．AT—MSCs和BM—MSCs均能分化心肌特异标志物a—skeletalactin和Troponin—I．二者差异无统计学意义．表明AT—MSCs和BM—MSCs均具备多项分化潜能．结论AT—MSCs是小型猪干细胞移植治疗的理想选择．     

成人骨髓间充质干细胞对造血干细胞体外增殖的影响

目的研究骨髓间充质干细胞（MSC）对脐带血（CB）CD34^＋细胞体外增殖和造血重建能力的影响。方法取人骨髓单个核细胞贴壁培养．梭形细胞完全融合后传代，用流式细胞仪检测免疫表型；将CBCD34^＋细胞接种到MSC或其他培养液中．比较不同培养条件对造血干细胞扩增能力、集落形成能力及黏附分子表达的影响。结果在加入IL-3的培养体系中．在MSC和细胞因子作用下，CD34^＋细胞扩增7d和14d后，有核细胞（NC）、CD34^＋细胞和CDl33^＋细胞数，实验组均显著多于对照组。CD34＋细胞在未加入IL-3的培养体系中培养8d后，实验组NC、CD34^＋细胞、CD34^＋CD38-细胞和造血祖细胞集落扩增倍数均显著高于对照组。扩增后CD34^＋细胞的ALCAM、VLA-α4、VLA-α5、VLA-β1、HCAM、PECAM和LFA-1表达较扩增前无显著变化。结论MSC可为造血干细胞（HSC）体外扩增提供适宜的微环境，有助于CD34^＋细胞体外增殖并抑制HSC分化，保持其造血重建潜能和归巢能力。     

血小板衍生内皮细胞生长因子转染脂肪间充质干细胞促进移植脂肪血管化

背景：血小板衍生内皮细胞生长因子在脂肪移植中可促进血运重建。 目的：探索血小板衍生内皮细胞生长因子和脂肪间充质干细胞的双重促进脂肪移植成活率的作用。 方法：①从新西兰大白兔腹股沟皮下脂肪中获取脂肪间充质干细胞,将第3代脂肪间充质干细胞分为实验组、对照组和空白组。实验组以Lenti-PD-ECGF-EGFP转染脂肪间充质干细胞,对照组以Lenti-EGFP转染脂肪间充质干细胞,空白组脂肪间充质干细胞未转染任何病毒。②取已被Lenti-PD-ECGF转染的脂肪间充质干细胞与DMEM完全培养基混合,然后与脂肪组织混合,作为A组;同样的方法用未转染任何病毒液的脂肪间充质干细胞制备B组,单独应用DMEM完全培养基而没有任何细胞成分的为C组。3组移植物注射于大白兔背部左上(A组)、左下(B组)、右上(C组)部皮下组织中。 结果与结论：①实验组脂肪间充质干细胞中血小板衍生内皮细胞生长因子mRNA与蛋白的表达水平高于对照组和空白组,且细胞增殖速度也比对照组和空白组快。②A组移植物质量及毛细血管数量大于B组和C组。提示血小板衍生内皮细胞生长因子基因转染脂肪间充质干细胞后不仅可以持续的表达该蛋白,同时也能促进脂肪间充质干细胞的增殖。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

差速贴壁法分离培养脂肪源间充质干细胞

目的:探讨差速贴壁法从大鼠腹股沟脂肪垫分离纯化脂肪源间充质干细胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,ADMSCs)的可行性。方法:采用差速贴壁培养法分离ADMSCs,并与普通培养法得到的ADMSCs进行表面分子CD44阳性率对比。在第2代ADMSCs中加入条件培养基进行诱导,根据条件培养基的不同分成3组:①成骨诱导组:加入成骨培养基;②成脂诱导组:加入成脂培养基;③对照组:仅加入基础培养基。成骨诱导组和对照组进行碱性磷酸酶(ALP)检测,成脂诱导组和对照组进行油红O染色检测。结果:差速贴壁培养法获得CD44阳性率更高的ADMSCs。成骨诱导组的ALP大大高于对照组,成脂诱导组油红O染色阳性,对照组油红O染色均为阴性。结论:差速贴壁培养法从大鼠腹股沟脂肪垫中分离得到高纯度ADMSCs。     

人骨髓间充质干细胞在体内外分化为心血管组织

目的验证人骨髓间充质干细胞(MSC)分化为心血管组织的潜能。方法用5-氮胞杂苷诱导MSC向心肌细胞分化,用VEGF-B诱导向血管内皮细胞分化。异丙肾上腺素法制成NOD/SCID小鼠心肌损伤模型,经尾静脉注入标记的MSC。免疫荧光法检测MSC的体内、外分化。结果在体外,经诱导的MSC表达肌凝蛋白重链和肌钙蛋白I,表达Ⅷ因子相关抗原和CD31。在体内,标记的MSC表达阳性的肌凝蛋白重链和Ⅷ因子相关抗原。结论MSC可分化为心肌和血管内皮细胞,是再生医学的理想种子细胞。     

成人脂肪间充质干细胞的定向成骨诱导

背景：脂肪分离可获得大量的间充质干细胞并成功向骨、软骨、脂肪、心肌等多个方向诱导分化。 目的：建立成人脂肪间充质干细胞体外分离培养、成骨分化方法,并探讨脂肪间充质干细胞作为骨组织工程的种子细胞的前景。 方法：通过胶原酶消化法从成人脂肪中分离间充质干细胞,进行体外培养,流式细胞仪检测细胞表面标记物,CCK8检测细胞活性,成骨诱导液诱导干细胞向骨细胞分化,BCIP/NBT比色法染色检测碱性磷酸酶,茜素红染色检测钙结节形成,RT-PCR检测碱性磷酸酶,骨桥蛋白表达变化。 结果与结论：利用脂肪抽吸液成功培养出脂肪间充质干细胞,且能稳定传代,增殖能力旺盛;流式细胞仪检测证实有特定的间充质干细胞表面标记物表达;成骨诱导脂肪间充质干细胞后呈典型的成骨细胞形态;碱性磷酸酶染色阳性,茜素红染色后可见钙结节形成,成骨诱导培养0,3,7,14,21,28 d,RT-PCR定量检测结果证实碱性磷酸酶、骨桥蛋白阳性表达。说明用酶消化法可以从人脂肪中分离得到脂肪间充质干细胞;脂肪间充质干细胞可向骨细胞诱导分化,阳性表达骨桥蛋白,碱性磷酸酶,是一种优良的骨组织工程的种子细胞。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

小鼠骨髓间充质干细胞在体内向肝细胞的转化

为探讨小鼠骨髓间充质干细胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)在体内向肝细胞转化的可能性,将来源于6-8周龄雄性BALB/c小鼠的BMSCs,通过尾静脉注射或经皮肝穿刺直接注入肝脏组织的途径移植入同源正常雌鼠体内。分别于移植术后1、2、4周处死受体雌鼠,取其肝组织,通过荧光原位杂交法(FISH)和免疫组化法同时检测Y染色体的存在和白蛋白的表达,以观察确定所注入的BMSCs在受鼠体内向肝细胞转化的情况。采取经皮直接肝穿刺注射途径移植BMSCs的两个实验组,无论移植细胞是新鲜分离的、还是P3代BMSCs,均可于移植后1周,在受鼠肝脏内检出Y染色体阳性细胞的存在,此类阳性细胞并可同时表达白蛋白。另一方面,经尾静脉注射法进行移植的实验组,于移植后2周,也可在其肝组织内检测到同时表达Y染色体和白蛋白的细胞。本研究证明了骨髓间充质干细胞在体内向肝细胞转化的可能性。     

兔骨髓间充质干细胞体外诱导血管内皮细胞

目的:探讨兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外诱导为血管内皮细胞(VECs)的方法,为心血管疾病的血管重建提供治疗策略。方法:抽取兔骨髓,采用全骨髓贴壁法加内皮细胞培养液诱导培养细胞,记录并观察诱导后细胞的形态及生长过程,并进行荧光标记;采用免疫细胞化学显色法鉴定诱导后细胞表面标志物CD31、CD34,利用支架材料Matrigel基质胶观察VECs三维血管化形态。结果:兔BMSCs经诱导后48 h,呈小圆形,可见贴壁生长;3～4d可见少量细胞贴壁,多为短梭形;6～8d完全贴壁,多为长梭形、锥形、不规则形;10～12d后细胞呈集落样生长;第15天成片生长的细胞集落相互连接,呈现典型的"鹅卵石样"或"铺路石样"外观;CM-DiI细胞荧光标记显示VECs的胞质、胞膜呈现红色荧光,DAPI细胞荧光标记显示VECs胞核呈蓝色荧光,细胞形态为长梭形,且细胞生长状况良好;免疫细胞化学显色显示CD31、CD34均呈阳性;在Matrigel基质胶上VECs呈现典型的环状或管状。结论:以全骨髓贴壁法和经内皮细胞培养液诱导法可获得VECs。     

Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering

Repair of soft tissue defects resulting from lumpectomy or mastectomy has become an important rehabilitation process for breast cancer patients. This study aimed to provide an adipose tissue engineering platform for soft tissue defect repair by combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix (hDAM) and human adipose-derived stem cells (hASCs). To derive hDAM incised human adipose tissues underwent a decellularization process. Effective cell removal and lipid removal were proved by immunohistochemical analysis and DNA quantification. Scanning electron microscopic examination showed a three-dimensional nanofibrous architecture in hDAM. The hDAM included collagen, sulfated glycosaminoglycan, and vascular endothelial growth factor, but lacked major histocompatibility complex antigen I. hASC viability and proliferation on hDAM were proven in vitro. hDAM implanted subcutaneously in Fischer rats did not cause an immunogenic response, and it underwent remodeling, as indicated by host cell infiltration, neovascularization, and adipose tissue formation. Fresh fat grafts (Coleman technique) and engineered fat grafts (hDAM combined with hASCs) were implanted subcutaneously in nude rats. The implanted engineered fat grafts maintained their volume for 8 weeks, and the hASCs contributed to adipose tissue formation. In summary, the combination of hDAM and hASCs provides not only a clinically translatable platform for adipose tissue engineering, but also a vehicle for elucidating fat grafting mechanisms.     

Adipose tissue-derived stem cells for cell therapy of airway allergic diseases in mouse

The purpose of this study was to compare murine mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from bone marrow (BM) and adipose tissue (AT) for the selection of suitable MSCs in cell therapy of an airway allergic animal model. We compared MSCs of BALB/c mice derived from BM and AT with respect to proliferation potential, immunophenotype, and multilineage differentiation capacity. In proliferation potential, MSCs from AT (ASCs) showed higher fibroblastoid colony-forming units frequencies and colony-forming efficiency than MSCs from BM (BMSCs). The flow cytometry analysis showed that both ASCs and BMSCs expressed MSCs-related antigens (CD90 and CD105), whereas they did not express hematopoiesis-related antigens (CD45 and CD11b). There was no significant difference in adipogenic, osteogenic, and chondrogenic differentiation between the murine ASCs and BMSCs. In conclusion, the present study has shown that ASCs had higher CFU-F frequencies and colony-forming efficiency than BMSCs. ASCs and BMSCs presented a similar surface immunophenotype and multilineage differentiation capacity. Therefore, ASCs in BALB/c mice might be a more useful material for cell therapy of the airway allergic experiment due to the abundance, relatively easy harvesting and high proliferation potential.     

脂肪组织来源的干细胞的研究进展

来自中胚层的脂肪组织与骨髓组织一样含有大量能自我更新和多向系分化潜能的细胞群称为脂肪干细胞。其取材方便，来源丰富，可在体外稳定增殖传代。并与骨髓间充质干细胞有相似的多向分化表面标志CD105、STRO-1以及CD166受体。研究发现它具有多向系分化潜能，除可以分化为问充质来源的脂肪、骨，软骨、脂肪以及骨骼肌、心肌等细胞，也可诱导分化为来源于外胚层的神经细胞以及具有功能性的血管内皮细胞，用以修复骨、软骨、心肌、骨骼肌、血管以及神经等组织。其具有造血支持作用以及可被逆转录病毒、腺病毒以及慢病毒较高的转染效率等优点，可以作为基因转移良好的靶细胞。因而，脂肪来源的干细胞其有望成为组织工程、细胞治疗以及基因转染良好的种子细胞。     

同种异体脂肪干细胞门脉移植对大鼠纤维化肝脏的影响

目的: 研究同种异体脂肪干细胞肝内移植对大鼠纤维化肝脏的影响。方法: 从SD大鼠腹膜脂肪组织提取脂肪干细胞,纯化、培养并稳定传代。雄性SD大鼠48只,成功建立大鼠肝纤维化模型。实验分为对照组(n=14)、门静脉组(n=11)和尾静脉组(n=14)。后两组分别经门静脉、尾静脉注射同种异体移植脂肪干细胞,观察移植前后大鼠肝血流动力学变化,并比较门静脉组和尾静脉组的疗效差异。结果: 成功提取脂肪干细胞,纯化、培养并稳定传代。输注脂肪干细胞前后各组肝脏计算机断层扫描灌注指数显示,门静脉组肝脏血流灌注有明显改善,且以门静脉灌注量为主(P<0.05),尾静脉组仅有轻微改善。组织学肝硬化评分显示,门静脉组见肝纤维化、肝细胞脂肪变性、肝细胞变性坏死均明显改善(P<0.05);尾静脉组仅肝细胞脂肪变性有改善。免疫组化示门静脉组肝脏微血管密度较其它组明显减少(P<0.05)。结论: 同种异体脂肪干细胞移植能改善肝纤维化SD大鼠的肝脏血流灌注及病理学改变;门静脉移植途径较尾静脉途径疗效更显著。     

脂肪干细胞在软骨组织工程中的应用

软骨是最早应用组织工程技术成功构建的组织之一,但由于缺乏合适的软骨构建种子细胞,因此其发展相对落后。随着干细胞研究的兴起,脂肪干细胞（ASC）因其具有分布广泛、可利用细胞量大、取材容易等优点,为ASC作为种子细胞应用于组织工程研究提供了可能;但是ASC构建软骨组织的效果却不如骨髓间充质干细胞（BMSC）理想。因此ASC在软骨组织工程中的应用仍面临着诸多问题与挑战,其中最核心的问题是如何提高ASC成软骨的效率。为此从如何纯化脂肪来源细胞、尽可能保持其中干细胞的生物学特性并优化软骨诱导方案3个方面予以综述,为提高ASC成软骨的效率提供参考。     

人骨髓间质干细胞向造血细胞分化潜能的实验研究

目的:在体研究人骨髓间质干细胞(hBMMSCs)向造血细胞分化的潜能。方法:将hBMMSCs经尾静脉注射给环磷酰胺处理的严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠,利用流式激活细胞分析系统(FACS)检测hBMMSCs输注后存活35d的SCID小鼠外周血、骨髓和脾脏中人源性造血细胞的表型和水平。结果:hBMMSCs输注组外周血(PB)、骨髓(BM)和脾脏(spleen)中可检测到人CD45⁺/H-2D^d-、CD34⁺/H-2D^d-细胞,而对照组PB、BM和脾脏均未检测到上述表型的人造血细胞。结论:hBMMSCs具有向造血细胞分化的潜能。     

同种异体脂肪组织源性间质干细胞移植治疗大鼠急性心肌梗死

目的：建立体外分离扩增脂肪组织源性间质干细胞方法，并探讨同种异体脂肪干细胞移植治疗大鼠心肌梗死的效果及可行性。方法: 18只雄性SD大鼠随机分为假手术组、急性心肌梗死对照组（AMI组）及AMI+细胞移植组。分离大鼠腹部脂肪组织干细胞，体外扩增，BrdU标记后于结扎左冠状动脉前降支后1h移植入梗死心肌，移植后4周进行血流动力学检测心功能并取出心脏进行病理切片观察和免疫组织化学染色检测移植细胞在梗死心脏中的定居、存活情况。结果: 大鼠腹部脂肪组织可分离培养出大量间质干细胞。细胞移植治疗组左心室收缩压高于AMI对照组（P＜0.01），舒张末压显著降低（P＜0.01），左心室内压最大上升、下降速率明显加快（P＜0.05）；病理组织切片显示梗死边缘区心肌面毛细血管计数明显增加，梗死区心肌组织内及毛细血管壁中均可见移植标记细胞。结论: 脂肪组织可作为干细胞又一新的来源，同种异体脂肪干细胞移植治疗AMI有效、可行。     

Hepatocyte growth factor-modified adipose tissue-derived stem cells improve erectile function in streptozotocin-induced diabetic rats

Abstract

TGFβ1-Smad signaling pathway is closely related to various tissues fibrosis. Hepatocyte growth factor (HGF) has been shown to antagonize TGFβ1-Smad signaling and may improve kidney tissue fibrosis in diabetic models. Penile fibrosis is a pathological condition which occurs during diabetic erectile dysfunction (ED). The aim of this study was to examine the effect of the treatment of ED in diabetic rats with a combination of HGF and adipose tissue-derived stem cells (ADSC). In this diabetes model, rats were injected intraperitoneally with 60?mg streptozotocin (STZ) to induce diabetes. Three months later, the diabetic rats were divided into a negative control(NC) group, an ADSC-treated group and an ADSC?+?HGF-treated group while normal rats were assigned into a sham group. Rats in the sham and NC groups were injected in the corpus cavernosum with phosphate-buffered saline, while rats in the other groups were injected with either ADSC or ADSC?+?HGF. One month later, erectile function was examined in each group and penile tissues were collected for experiments. The expression of smooth muscle actin (SMA) and platelet-endothelial cell adhesion molecule-1 (PECAM-1) was analyzed by Western blotting. The smooth muscle and collagen deposition in corpus cavernosum was evaluated by Masson staining, while endothelial changes were assessed immunohistochemically. Cell apoptosis was detected by the TdT-mediated dUTP nick-end labeling (TUNEL) assay. The results revealed that ADSC alone can significantly improve erectile function in diabetic rats, but in combination with HGF the improvement was more prominent, showing higher content of smooth muscle and endothelial cells and lower cell apoptotic index in corpus cavernosum. Treatment with HGF can significantly enhance the beneficial effect of ADSC on erectile function in diabetic rats, and this effect might be closely related to the down-regulation of TGFβ1-Smad signaling.