细胞凋亡的原位显示技术及应用

原位末端标记法是利用末端转移酶作为催化酶，在适当条件下将底物接合于ＤＮＡ双链钝端，再用免疫组化放大标记信号，然后ＤＡＢ显色，苏木素衬染，能结构完好地原位显示凋亡细胞     

抗人CD20单克隆抗体诱导Daudi细胞凋亡的功能研究

目的　观察由基因重组抗原制备的抗人CD2 0单克隆抗体 (CD2 0 McAb) 1- 2 8对B淋巴瘤细胞的促凋亡作用 ,并探讨其作用机理。方法　利用流式细胞术测定所获 1- 2 8单抗对标准CD2 0 FITC单抗的竞争抑制作用及对胞内游离钙的影响 ;通过电镜观察其诱导Daudi细胞凋亡后形态上的改变 ,免疫印迹实验显示Daudi细胞凋亡后功能上的变化。结果　 1- 2 8能明显竞争标准CD2 0 FITC单抗与Daudi细胞表面CD2 0分子的结合。电镜结果证实了 1- 2 8能够促进Daudi细胞发生凋亡的结论 ;实验结果显示Daudi细胞与 1- 2 8作用后胞内游离钙浓度明显升高 (P <0 .0 5 ) ,细胞内Bcl 2蛋白和caspase酶原的表达量下降 ,而Bax蛋白和caspase酶原降解的活性产物表达增加。结论　 1- 2 8能竞争结合Daudi细胞表面的CD2 0分子并诱导其发生凋亡     

Anti-IgM诱导人B淋巴瘤Daudi细胞凋亡的信号传导通路

目的 研究B细胞抗原受体（BCR）介导的细胞凋亡,探索其可能的信号传导通路。阐明B细胞凋亡的分子机制。方法 ^3H掺入法检测细胞生长,应用FACS方法分析细胞周期和细胞凋亡,Western blot检测anti-IgM刺激引起Daudi细胞信号分子的变化。结果 anti-IgM可导致人B淋巴瘤Daudi细胞发生凋亡。细胞凋亡的数量与anti-IgM浓度呈正相关,Western blot结果显示,anti-IgM刺激引起Daudi细胞内氨酸蛋白分子磷酸化水平的变化速度与浓度相关;但随时间的延长,变化状况趋于稳定;在48-72h,许多被激活的,呈现磷酸化的栈氨酸蛋白分子又回复到低磷酸化或去磷酸化的静止状态,另外,虽然JNK1和ERK2蛋白水平未发生明显改变,但JNK/SAPK的重要下游分子之一,c-Jun的蛋白表达水平及其63和73位点的丝氨酸磷酸化水平立即长高并维持在高水平状态。结论 anti-IgM刺激激活JNK/SAPK,JNK/SAPK通路可能参与了anti-IgM引起的Daudi细胞的凋亡过程。     

TUNEL法检测体外培养细胞凋亡的体会

ＴＵＮＥＬ(ＴｄＴ ｍｅｄｉａｔｅｄｄＵＴＰｎｉｃｋｅｎｄｌａｂｅｌｉｎｇ ,ＴｄＴ介导的脱氧尿嘧啶缺口末端标记 )是用于原位检测细胞凋亡情况的一种基本方法。作者在绿茶儿茶素 (ＧＴＣ)诱导ＢＥＬ 740 2人肝癌细胞凋亡的研究中 ,对培养于盖玻片的ＢＥＬ 740 2细胞 (盖片培养细胞 )和ＢＥＬ 740 2细胞涂片 (培养细胞涂片 )进行了ＴＵＮＥＬ染色效果的比较。1　材料和方法1.1　材料　原位细胞死亡检测试剂盒 ,ＰＯＤ为ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ公司产品。ＧＴＣ :日本产品 ,由中国医学科学院肿瘤研究所程书钧院士惠赠 ,实…     

T细胞Trail受体表达及Trail诱导的T细胞凋亡

目的 :观察人T细胞Trail(TNF relatedapoptosis inducingligand)受体表达及Trail诱导T细胞凋亡的作用。方法 :通过荧光双标记 ,使用流式细胞仪检测Trail受体阳性细胞和凋亡细胞。结果 :静息Jurkat细胞表达高水平Trail受体〔(49 19±12 2 5 ) %〕 ,激活Jurkat细胞对Trail受体表达无影响。Trail诱导显著的Jurkat细胞凋亡〔(90 0 1± 2 6 71) %〕。正常人外周血淋巴细胞 (PBL)仅激活后表达Trail受体〔(2 5 2 7± 6 42 ) %〕 ,但无细胞凋亡发生。结论 :人T细胞表达Trail受体 ,Trail受体和Trail的相互作用对细胞凋亡有调控作用。     

四氯化碳诱导大鼠肾细胞凋亡的研究

目的观察四氯化碳（CCl4）诱导大鼠肾形态结构和肾细胞凋亡的变化。方法将健康雄性Wistar大鼠随机分为对照组、2周CCl4组和6周CCl4组,每组5只。对照组背部皮下注射橄榄油（0．12ml／100g鼠重）,CCl4组以0．3ml／100g鼠重背部皮下注射60％CCl4橄榄油。2周CCl4组和6周CCl4组大鼠分别于实验的第3周和7周的第1d处死。肾石蜡切片苏木精．伊红染色,光镜观察肾组织形态学,免疫组织化学显示Caspase-3、Bax、TUNEL观察肾细胞凋亡。结果对照组肾小球和肾小管结构均正常。2周和6周CCl4组的肾小球结构正常,2周CCl4组病变较轻、6周CCl4组肾皮质近端小管管腔狭小,上皮细胞浊肿,空泡变性,微绒毛脱失。对照组和2周CCl4组Caspase-3、Bax免疫组织化学显色未见阳性细胞表达;而6周CCl4组则在近髓质处的皮质内,近端小管上皮细胞的胞质呈现棕黄色阳性反应。TUNEL显色2周CCl4组可见肾皮质内近端小管上皮细胞核和少量的肾小球细胞核呈阳性表达,而6周CCl4组在大量的远曲小管及少量近端小管的上皮细胞核呈阳性表达。结论CCl4诱导性肾损伤大鼠,2周时肾组织的近端小管上皮及少量肾小球毛细血管内皮细胞发生凋亡,而损伤6周时,肾皮质近端小管受损,上皮细胞变性;远曲小管上皮细胞发生凋亡。     

肿瘤特异性凋亡基因诱导人淋巴瘤细胞凋亡的机制

目的:研究肿瘤特异性凋亡基因(apoptingene)在诱导人淋巴瘤细胞U937凋亡时,cJun氨基末端激酶(JNK)信号通路的作用。方法:用含有apoptin基因的真核表达载体,瞬时转染体外培养的人淋巴瘤细胞U937。采用流式细胞仪、Westernblot、台盼蓝染色及RTPCR等研究其在不同时间条件下诱导U937细胞凋亡的作用。结果:Apopin基因瞬时转染U937细胞48h,可出现明显的凋亡;而且凋亡细胞的数量与apoptin基因的转染时间有关。诱导后24h,U937细胞中出现磷酸化的JNK蛋白的表达,诱导后48h达高峰;而非磷酸化的JNK蛋白表达无明显变化。结论:Apoptin基因具有诱导U937细胞凋亡的作用。JNK信号通路的激活,可能在apoptin基因诱导肿瘤细胞凋亡过程中发挥着重要作用。     

交联抗DR5单抗YM366EC诱导的Jurkat细胞凋亡机制探讨

为探讨抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)的死亡受体5(DR5)单抗-YM366EC引起Jurkat细胞凋亡信号转导通路,阐明抗DR5抗体的抗肿瘤效应机制。观察了交联366EC对Jurkat细胞的形态变化,细胞增殖和细胞凋亡率影响。进一步用Western blot法检测YM366EC作用于Jurkat细胞不同时间Bcl-2、Cyt-C、Bax、Caspase 3、Caspase 9的表达变化。结果发现DR5抗体YM366EC单独应用无凋亡作用,但抗小鼠IgG交联366EC后可致Jurkat细胞染色质边集、断裂,细胞出芽,形成凋亡小体,并可直接诱导TRAIL敏感的Jurkat细胞凋亡。Western blot检测到随着抗体诱导时间的延长Jurkat细胞Bel-2蛋白表达减少;Cyt-C、Bax、有活性的Caspase 3和Caspase 9蛋白的表达增加。结果表明交联抗DR5抗体YM366EC对Jurkat细胞增殖有明显的抑制作用,诱导的Jurkat细胞凋亡的分子机制涉及到Cyt-C、Bax、Caspase 3、Caspase 9。     

交联抗DR5单抗YM366EO诱导的Jurkat细胞凋亡机制探讨

为探讨抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)的死亡受体5(DR5)单抗-YM366EC引起Jurkat细胞凋亡信号转导通路,阐明抗DR5抗体的抗肿瘤效应机制.观察了交联366EC对Jurkat细胞的形态变化,细胞增殖和细胞凋亡率影响.进一步用Western blot法检测YM366EC作用于Jurkat细胞不同时间Bcl-2、Cyt-C、Bax、Caspase 3、Caspase 9的表达变化.结果发现DR5抗体YM366EC单独应用无凋亡作用,但抗小鼠IgG交联366EC后可致Jurkat细胞染色质边集、断裂,细胞出芽,形成凋亡小体,并可直接诱导TRAIL敏感的Jurkat细胞凋亡.Western blot检测到随着抗体诱导时间的延长Jurkat细胞Bcl-2蛋白表达减少;Cyt-C、Bax、有活性的Caspase 3和Caspase 9蛋白的表达增加.结果表明交联抗DR5抗体YM366EC对Jurkat细胞增殖有明显的抑制作用,诱导的Jurkat细胞凋亡的分子机制涉及到Cyt-C、Bax、Caspase 3、Caspase 9.     

交联抗人DR5单抗-YM366EC诱导Jurkat细胞凋亡机制研究

目的：探讨抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）的死亡受体5（DR5）单抗-YM366EC引起Jurkat细胞凋亡信号传导通路,阐明抗DR5抗体的抗肿瘤效应机制,为相关肿瘤治疗提供依据。方法：光镜下观察交联366EC作用下Jurkat细胞形态变化,并利用MTT法检测Jurkat细胞的增殖,利用FITC-AnnexinV及PI标记流式细胞仪检测交联YM366EC对Jurkat细胞凋亡率影响。进一步用Western blot法检测交联YM366EC作用于Jurkat细胞2、4、6、8、10、12小时时Bcl-2、Cyt-C、Bax、caspase3、caspase9的表达变化。结果：DR5抗体YM366EC单独应用无凋亡作用,但应用抗小鼠IgG交联366EC后可致Jurkat细胞染色质边集、断裂,细胞出芽,凋亡小体形成,并可直接诱导TRAIL敏感的Jurkat细胞凋亡改变。Western blot检测到随着抗体诱导时间的延长Jurkat细胞Bcl-2蛋白表达减少;Cyt-C、Bax、有活性的caspase3和caspase9蛋白的表达增加。结论：交联抗DR5抗体YM366EC对Jurkat细胞增殖有明显的抑制作用,诱导的Jurkat细胞凋亡的分子机制涉及到Cyt-C、Bax、caspase3、caspase9。     

X射线诱导Raji细胞凋亡的实验研究

目的探讨X射线对人Burkkit淋巴瘤细胞株Raji细胞增殖及凋亡的影响。方法用不同剂量X射线照射细胞,并在不同时间段用倒置显微镜观察照射后细胞的形态变化及生长抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡率、细胞周期,并观察X射线对克隆形成的影响。结果 16Gy照射后48h对Raji细胞的抑制率（92.67±1.20）%最显著;8Gy照射后48h早期凋亡率（42.04±3.62）%最高;8Gy照射后24h细胞周期G2/M期细胞（57.86±3.31）%,明显大于正常对照组（14.54±2.32）%;8Gy照射后第7天无克隆形成,第14天克隆数为（5.33±2.40）,明显小于正常对照组第7天（116.67±20.28）和第14天（263.33±20.27）。结论 X射线可抑制细胞增殖,并诱导细胞凋亡,照射后细胞周期阻滞在G2/M期,X射线8Gy照射后不能完全抑制Raji细胞的增殖。     

干扰素-α联合高三尖杉酯碱下调K562细胞端粒酶逆转录酶及端粒酶活性诱导细胞凋亡

目的：研究干扰素-α(IFN-α)联合高三尖杉酯碱(HHT)对K562细胞端粒酶逆转录酶及端粒酶的作用，并探讨其与细胞凋亡的关系。方法:IFN-α、HHT以及两药联合作用K562细胞后用MTT法检测细胞增殖，吉姆萨-瑞氏染色观察细胞形态，PI-Annexin VFITC双染色、流式细胞仪检测细胞凋亡,Krupp改良的荧光素标记的端粒重复扩增方法(TRAP)检测K562细胞端粒酶活性，RT-PCR方法检测hTERT mRNA表达变化。结果:5×106U·L-1 IFN-α分别联合5-40 μg·L-1 HHT诱导K562细胞凋亡从而抑制其生长，单用HHT时IC50为27.35 μg·L-1，联用5×106 U·L-1 IFN-α后IC50降为18.72 μg·L-1；IFN-α与HHT联用明显下调hTERT mRNA表达并抑制K562细胞的端粒酶活性。结论：IFN-α联合HHT可以诱导细胞凋亡，这可能与下调细胞hTERT mRNA的表达水平，抑制端粒酶活性有关。两药联合作用强于单独用药，提示临床IFN-α联合HHT治疗慢性髓细胞白血病（CML）可能比单用HHT效果更好。     

SEA诱导人膀胱癌BIU-87细胞凋亡机制的研究

目的：为了观察葡萄球菌肠毒素A(SEA)对人膀胱癌BIU-87细胞株诱导凋亡机制。方法：应用MTT比色法和流式细胞术检测SEA对BIU-87细胞增殖抑制率和对细胞周期的影响。结果：SEA对BIU-87细胞株有明显的抑制作用，且呈剂量依赖性。流式细胞术分析，SEA能阻止G1期细胞向S期的进程，G1期细胞堆积。结论：SEA能诱导BIU-87细胞凋亡，具有细胞毒性效应，可用于膀胱内灌注，从而抑制膀胱癌的浸润转移。     

干扰素α通过P204和P21诱导大鼠原代血管平滑肌细胞凋亡

目的 探讨干扰素-α(IFN-α)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)凋亡的影响.方法 应用转染IFI204 siRNA和/或IFN-α瞬时干预体外培养的大鼠VSMCs,以非特异性siRNA转染组为对照组,RT-PCR法检测P204及P21mRNA表达,Western blot检测P204及P21蛋白表达,流式细胞仪Annexin-V FITC/PI法检测细胞凋亡.结果 与对照组比较,IFN-α组P204 mRNA和蛋白表达上调(P＜0.01),细胞凋亡增多(P＜0.01),伴P21 mRNA和蛋白表达增多(P＜0.01);IFI204 siRNA转染组P204 mRNA和蛋白表达下调(P＜0.01),细胞凋亡减少(P＜0.01),P21mRNA和蛋白表达减少(P＜0.01);转染IFI204 siRNA后再加IFN-α干预,P204 mRNA及蛋白表达下调(P＜0.01),但P21 mRNA及蛋白表达增多(P＜0.01),促进细胞凋亡(P＜0.01).结论 P204及P21参与IFN-α诱导大鼠VSMCs凋亡过程的调控.     

流式细胞术检测肉桂酸锗诱导小鼠U14瘤细胞凋亡的研究

目的 :从分子水平探讨肉桂酸锗对小鼠U14瘤细胞的抑制效应及其作用机制。方法 :荷瘤U14 小鼠模型共分 4组 :生理盐水组、肉桂酸组、肉桂酸锗组和环磷酰胺组 ,灌胃给药 10d ,通过检测瘤重、抑瘤率 ;应用流式细胞仪检测瘤细胞凋亡率 ,细胞周期变化 ;显微镜观察各组瘤细胞形态变化等 ,以探讨肉桂酸锗对U14 瘤的抑瘤机制。结果 :肉桂酸、肉桂酸锗及环磷酰胺各组瘤重减轻 ,各组抑瘤率分别为 4 0 83%、4 6 6 7%、5 8 33%。流式细胞仪检测肉桂酸、肉桂酸锗、环磷酰胺诱导U14 瘤细胞凋亡率分别为 17 98%、2 2 0 9%、2 0 6 1%。肉桂酸锗对瘤细…     

白藜芦醇诱导鼻咽癌细胞CNE-2Z凋亡过程中caspase-6的活化

目的:探讨白藜芦醇(Res)诱导鼻咽癌细胞CNE-2Z凋亡过程中是否有caspase-6的活化。方法:用Western-blot分析caspase-6酶原的裂解,半定量RT-PCR检测caspase-6mRNA表达的改变,比色法测定caspase-6活性的变化。结果:用Res 0(对照)、25、50、100、200μmol/L处理细胞24小时,caspase-6酶原的表达随药物浓度的增加而减少,100 μmol/L时开始出现活性裂解片段P20(20 kD),200μmol/L时P20增加;caspase-6 mRNA的表达呈浓度依赖性的增加(P<0.01);caspase-6活性呈浓度和时间依赖性的升高(P<0.01)。结论:Res诱导CNE-2Z细胞凋亡过程中有caspase-6的活化。     

miR-155特异性siRNA增强阿糖胞苷诱导的Burkitt淋巴瘤Raji细胞凋亡

 目的：研究miR-155特异性siRNA增强阿糖胞苷（Ara-C）诱导的Burkitt淋巴瘤Raji细胞凋亡及其机制。方法：Ara-C与miR-155 siRNA单独或者联合干预Raji细胞增殖。qRT- PCR检测脂质体转染siRNA后miR-155的表达;CCK-8法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blotting法检测caspase-3的表达。结果：qRT-PCR显示,转染miR-155 siRNA后,Raji细胞的miR-155表达明显下降（P<0.05）,Ara-C或miR-155 siRNA单独处理细胞后均显示出增殖抑制作用,而两者联合使用的增殖抑制作用更显著（P<0.05）。各组细胞进行药物干预48 h后行流式细胞术,结果显示Ara-C或miR-155 siRNA单独处理细胞凋亡率分别为（16.5±0.3）%和（14.6±0.3）%,与对照组［（3.6±0.4）%］比较差别有统计学意义（P＜0.05),Ara-C+miR-155 siRNA组的凋亡率［（38.4±1.4）%］分别与Ara-C和miR-155 siRNA单独处理组比较,差别有统计学意义（P＜0.05）。Ara-C+miR-155 siRNA组与Ara-C组及miR-155 siRNA组相比,caspase-3的水平明显增高。结论：miR-155特异性siRNA具有增强阿糖胞苷对Raji细胞增殖抑制及诱导Raji细胞凋亡的作用,其机制与caspase-3凋亡途径有关。     

三七皂甙R1诱导HL-60细胞凋亡的初步研究

目的：观察三七皂甙R1是否能诱导人白血病细胞株HL-60细胞凋亡及相关基因的变化。方法：300～1200μg／ml^-1三七皂甙R1处理HL-60细胞，光镜下观察细胞形态；MTT法测细胞生长抑制率；流式细胞仪检测凋忘峰。结果：300～1200μg／ml^-1三七皂甙R1可抑制HL-60细胞生长，抑制率有剂量依赖性。流式细胞仪检测凋亡峰随药物浓度增大而增加。结论：三七皂甙R1可抑制HL-60细胞生长，诱导其凋亡。     

蟾蜍灵诱导人胃癌细胞凋亡的实验研究

用ＭＴＴ法、形态学观察法、ＤＮＡ电泳和流式细胞仪观察蟾蜍灵（Ｂｕｆａｌｉｎ）诱导的胃癌细胞凋亡。结果表明,０．０１ｕｍｏｌ／Ｌ蟾蜍灵作用ＭＧｃ－８０３细胞４８ｈ,即可显著抑制细胞生长,ＩＣ５０值约为０．１ｕｍｏｌ／Ｌ。琼脂糖凝胶电泳获得梯形图谱,汉式细胞仪ＤＮＡ直方图上出现典型的亚二倍体峰,凋亡主要发生在Ｇ１／Ｇ０期,细胞凋亡率随药物浓度和作用时间的增加而增高,以上结果提示,ｂｕｆａｌｉｎ对胃癌细     

N-硝基-L-精氨酸甲酯对大鼠实验性隐睾生精细胞凋亡及Bax表达的影响

目的研究N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)对大鼠实验性隐睾生精细胞凋亡及凋亡相关基因Bax表达的影响。方法手术建立大鼠单侧隐睾模型,实验分为隐睾组、隐睾 L-NAME组[术后腹腔注射溶于生理盐水的L-NAME 50 mg/(kg.d)]、隐睾 生理盐水组、假手术组,7 d后采用化学比色法检测睾丸组织NOS活性,流式细胞术(FCM)和原位缺口末端标记法(TUNEL)检测生精细胞凋亡,RT-PCR和免疫组织化学法检测Bax基因表达变化。结果隐睾组和隐睾 生理盐水组之间检测指标无明显差异;隐睾 L-NAME组隐睾凋亡细胞百分比和生精细胞凋亡指数均低于隐睾组及隐睾 生理盐水组,高于假手术组(P<0.05);Bax mRNA和蛋白表达水平隐睾组及隐睾 生理盐水组最高,假手术组次之,隐睾 L-NAME组最低。结论隐睾生精细胞Bax表达增加,L-NAME可通过下调Bax的表达抑制隐睾生精细胞凋亡。