风疹病毒E1蛋白克隆表达及应用

目的 构建表达风疹病毒蛋白抗原的重组质粒及工程菌,获得纯化的E1蛋白抗原,用于检测风疹病毒特异性抗体IgM.方法 克隆表达风疹病毒E1重组蛋白,利用产物建立IgM捕获ELISA方法鉴定其抗原性及实用性.结果 表达纯化的E1蛋白经酶标记建立IgM捕获ELISA方法,检测53份抗风疹病毒IgM阳性血清和67份阴性血清,用酶标记E1蛋白建立的捕获ELISA法阳性检出率98.1%,阴性检出率100%,与意大利SORIN公司试剂盒检测结果比较,无统计学意义(P＞0.05);其中1份风疹病毒(IgM)阳性血清1∶16稀释后仍能与抗原反应,初步表明E1蛋白抗原表位有较好的抗原特异性.结论 高效表达纯化的E1蛋白抗原性强,利用其建立的IgM捕获ELISA方法,可用于检测风疹病毒抗体.     

手足口病相关肠道病毒感染血清IgM抗体交叉反应及动态变化

目的分析手足口病相关肠道病毒间IgM抗体交叉反应及动态产生过程,评价抗体捕获法检测肠道病毒71型(EV71)及柯萨奇病毒A组16型(CA16)感染的早期诊断价值。方法收集广州市妇女儿童医疗中心319名手足口病患者及疑似患者咽拭子319份、血标本565份。荧光定量PCR检测咽拭子标本,血清中和试验检测配对血清,结合两法结果为判断标准,将手足口病患者分为EV71、CA16及其他肠道病毒感染组;以捕获ELISA法检测不同发病时间EV71-IgM抗体及CA16-IgM抗体。结果发病第一天均能检测出EV71-IgM抗体及CA16-IgM抗体,阳性率分别为33.0%和25.0%,检出率分别在第5天和第7天达到100%,抗体可持续检出时间达数月。EV71感染血清CA16-IgM捕获ELISA法交叉反应率为25.0%,CA16感染血清EV71-IgM捕获ELISA法交叉反应率为28.0%。EV71-IgM和CA16-IgM抗体存在严重交叉反应,通过两者450 nm处吸光度(A450 nm)比值可以成功诊断97.1%EV71感染和93.0%CA16感染。同一天采集的肛拭子及血清标本检测结果表明,荧光定量PCR与ELISA法诊断EV71及CA16感染的结果差异无统计学意义。结论 EV71及CA16抗体捕获ELISA法是一种简单、有效的诊断方法,联合两种方法检测可以有效提高诊断特异性。     

荧光聚合酶链式反应与酶联免疫吸附法筛查肠道病毒71型病原感染的比较研究

目的比较肠道病毒71型（EV71）核酸与EV71-IgM抗体检测两种方法对临床诊断手足口患儿的意义。方法采用荧光定量聚合酶链式反应法对2011年4月20日-9月10日诊治的1 379例临床诊断为疑似手足口患儿进行肛拭子EV71核酸检测,同时用酶联免疫吸附法对血清标本进EV71-IgM抗体水平检测。结果 1 379例患儿EV71核酸的阳性为79例,阳性率为5.73%,EV71-IgM抗体阳性为82例,阳性率为5.95%,两者均阳性为32例。两检测方法一致率为95.2%,两者之间的阳性检出率差异无统计学意义（χ2=0.093,P=0.761）。结论应用EV71核酸及EV71-IgM抗体检测的两种联合监测,能更有效地提高手足口病患儿感染的诊断水平,对预防及对诊断手足口病有积极意义。     

捕获ELISA法测定抗EV71-IgM抗体用于EV71感染早期诊断

目的探讨捕获ELISA法测定抗肠道病毒71型(EV71)IgM抗体在EV71感染所致手足口病(HFMD)早期诊断中的价值。方法以实时荧光RT-PCR检测89例临床初诊为HFMD患儿的粪便、疱疹液、咽拭子或肛拭子的肠道病毒RNA。用40例排除HFMD的5岁以下儿童血清为抗EV71-IgM抗体阴性对照,以捕获ELISA法检测患儿不同发病期血清中抗EV71-IgM抗体。结果经实时荧光RT-PCR检测,89例HFMD患儿粪便、疱疹液、咽拭子或肛拭子中EV71感染28例,柯萨奇病毒A16(CA16)感染43例,非EV71和CA16的肠道病毒感染14例,非肠道病毒感染4例。EV71感染者发病1～3 d、4～6 d及>6 d的血清抗EV71-IgM抗体阳性率分别为81.3%、100%和100%;CA16感染者分别为10.0%、26.4%和65.7%;非EV71和CA16的肠道病毒感染者及非肠道病毒感染者在发病1～3 d和4～6 d无1例阳性;阴性对照组无1例阳性。抗EV71-IgM抗体在EV71感染的早期(急性期)的诊断敏感性和特异性分别为81.3%和92.9%。结论 EV71感染者与CA16感染者血清抗EV71-IgM抗体在发病4 d后存在较明显的交叉反应。抗EV71-IgM抗体可用作EV71感染早期诊断的血清学标志物。     

巨细胞病毒gp27蛋白表达及其ELISA方法的建立

目的构建高表达巨细胞病毒（CMV）gp27蛋白的重组质粒及工程菌,获取纯化的gp27蛋白抗原。方法采用PCR技术,克隆表达CMV gp27重组蛋白,利用产物建立IgM捕获ELISA方法,鉴定其抗原性。结果表达纯化的gp27蛋白纯度〉95%,经酶标记建立IgM捕获ELISA方法,检测50份抗巨细胞病毒IgM阳性血清和30份阴性血清,捕获ELISA法阳性检出率98.0%,阴性检出率100%,与意大利SORIN公司试剂盒检测结果比较,差异无统计学意义（P〉0.05）;其中1份CMV-IgM阳性血清1∶32稀释后仍能与抗原反应,表明gp27蛋白抗原表位有较好的抗原特异性。结论高效表达纯化的gp27蛋白抗原性强,利用其建立的IgM捕获ELISA方法,可用于检测巨细胞病毒抗体。     

不同方法检测肠道病毒71型IgM抗体在手足口病诊断中的意义

目的：研究免疫层析法（ICA）和酶联免疫吸附法（ELISA）检测肠道病毒71型（EV71）IgM 抗体在手足口病诊断中的意义。方法采集135例手足口病确诊患儿和44例排除手足口病诊断的患儿血清标本,采用ICA及ELISA检测EV71 IgM 抗体。结果135例手足口病患儿,ICA、ELISA 检测 EV71 IgM 抗体阳性率分别为21．48％（29/135）和20．74％（27/135）;44例非手足口病患儿,ICA、ELISA检测EV71 IgM抗体阳性率均为0．00％（0/44）。结论ICA或ELISA检测EV71 IgM抗体阳性者均可确诊为手足口病,但检测结果为阴性者,不能排除手足口病的可能性,应结合临床表现进行诊断。     

肠道病毒71型手足口病ELISA诊断试剂盒研制与临床应用

目的 研制早期快速检测抗肠道病毒71型(EV71)抗体的ELISA血清学诊断性试剂盒,评价其临床应用价值.方法 将表达纯化的EV71重组蛋白VP1作为包被抗原,建立EV71型手足口病间接ELISA的血清学检测方法 .通过与逆转录(RT)PCR方法 、EV71病毒分离试验和微量血清中和试验比较,评价抗.EV71 IgM和抗-EV71 IgG血清学诊断方法 在EV71型手足口病的诊断价值.结果 与RT-PCR比较,抗-EV71 IgM敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为83%、85%、81%和87%;抗.EV71 IgG敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为72%、74%、68%和77%.与EV71病毒分离方法 比较,抗-EV71 IgM敏感度、特异度分别为85%和97%;抗-EV71 IgG敏感度、特异度分别为75%和77%.通过直线相关分析发现,抗-EV71 IgG抗体滴度和中和抗体滴度呈显著正相关(r=0.72,P＜0.05).EV71型手足口病患儿恢复期血清抗IgG滴度较急性期升高(P＜0.01),但抗IgM滴度差异无统计学意义(P＞0.05).结论 利用VP1重组蛋白作为包被抗原,成功开发ELISA检测人血清抗-EV71 IgM和抗-EV71 IgG抗体的诊断试剂盒.     

酶联免疫反应加速仪在麻疹病毒IgM抗体检测中的应用

目的探讨酶联免疫反应加速仪在麻疹病毒IgM抗体检测中的应用价值。方法选取2013年6~12月哈尔滨医科大学附属第一医院儿科疑似麻疹病例血清238份,麻疹病毒IgM抗体阳性血清1份,在酶联免疫吸附试验中分别采用常规温育法(常规法)和酶联免疫反应加速仪法(加速法)进行麻疹病毒IgM抗体的检测,比较两种方法在检测麻疹病毒IgM抗体的重复性、灵敏度及特异性。结果加速法的变异系数(CV)为2.86%~9.52%,灵敏度为97.40%,特异度为100.00%,均符合试剂盒标准;且加速法和常规法对麻疹病毒IgM的定量检测结果呈正相关(P0.05)。结论酶联免疫反应加速仪在麻疹病毒IgM抗体检测中,各项指标均符合试剂盒要求,可应用于临床检测。     

人细小病毒B19主要抗原片段的表达及临床初步应用

我国临床人细小病毒B19(B19)感染的诊断和流行病学调查以及献血员筛查等方面的工作尚未广泛开展,原因之一是受诊断试剂和方法的局限.目前国际上商业B19抗体诊断试剂盒均以重组抗原为基础.本研究获取能表达B19结构蛋白VP1独特区和VP1/VP2共同区主要抗原片段,建立改良酶联免疫吸附法(ELISA),检测发病期患者和献血员血清中抗B19-IgM,并与德国IBL试剂盒平行比较.     

丙型肝炎抗原检测

目的探讨在HCV感染早期,HCV Ab为阴性时用酶联免疫法检测HCV核心抗原的试验方法的可行性。方法用重组HCV核心抗原,免疫小鼠制备单克隆抗体,对HCV核心抗原进行酶联免疫法检测。结果HCV核心抗原检测灵敏度高可达5ng/ml,用酶联法对11份HCV Ab阴性,HCV RNA阳性标本检测9份阳性。结论酶联免疫法检测HCV核心抗原可作为HCV感染早期的抗原检测方法,较HCV RNA检测法简便、快速,可以作为核酸检测法的一种简易替代方法。     

肠道病毒71型 VP1基因的扩增、克隆、表达及蛋白分析

目的：对肠道病毒71型 VP1基因片段进行扩增、克隆、生物信息学分析、原核表达、纯化,初步证实重组表达产物的生物学活性。方法根据 GenBank 中 EV71序列设计一对特异性引物,以 EV71患者咽拭子标本中提取病毒核糖核酸为模板, RT-PCR 扩增 EV71 VP1基因,酶切后插入表达载体 pET28a。构建 pET28a-EV71 VP1原核表达载体。转化 E．coli DH5α,IPTG诱导表达,使用 SDS-PAGE 及 Western blot 分析表达结果,利用软件对测序结果进行生物信息学分析。纯化蛋白并包被反应板,用 ELISA 分别检测 EV71阳性与 COX A16阳性患者 VP-1 IgG 抗体,进行统计学分析。结果目的基因经 BLAST 比对,同源性与 GenBank 登录号为 JQ766207．1 EV71 VP1一致性达99％。EV71 VP1蛋白相对分子质量约为32×10^3,主要以包涵体形式存在。生物信息学分析得出,EV71 VP1蛋白为亲水性蛋白,无跨膜区,不具有 N-端信号肽序列,存在三级结构。ELISA 结果显示EV71阳性患者 OD 值为（2．425±0．521）,COX A16阳性患者 OD 值为（1．205±0．314）,健康对照组 OD 值为（0．353±0．128）。EV71 VP1蛋白检测敏感性和特异性分别为84％和88％。结论成功构建了 pET28a-EV71 VP1表达载体;通过对手足口患者血清进行 ELISA 初步分析,得出目的蛋白有较高的敏感性和特异性,初步证实具有生物学活性,可进一步用于 EV71诊断及疫苗的相关研究。     

肠道病毒71型VP1蛋白原核表达及初步鉴定

目的采用分子克隆技术,构建肠道病毒71型(EV71)VP1全长基因大肠杆菌原核系统表达载体,诱导重组VP1融合蛋白表达。方法自EV71感染患者血清中提取病毒总RNA,进行一步法RT-PCR,扩增编码VP1蛋白的全长基因片段(891 bp),以pET32(a)为表达载体,构建重组表达质粒pET32(a)-VP1,转化E.coli.Rosseta感受态细胞,获得重组工程菌株。经诱导培养,SDS-PAGE电泳,免疫印迹鉴定表达产物。结果获得了含重组表达质粒pET32(a)-VP1的正相阳性工程菌株,经IPTG诱导能高效表达VP1融合蛋白。结论重组工程菌可表达VP1融合蛋白,对研究EV71发病机制及疫苗研制具有重要意义。     

两种不同方法检测肠道71型病毒的比较

目的研究不同方法检测肠道71型病毒的灵敏度和特异性。方法采集135例临床确诊为手足口病患儿和44例临床确诊为非手足口病患儿血清,分别用免疫层析法（ICA）和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗肠道71型病毒IgM抗体。结果ICA法检出阳性病例29例,ELISA法检出阳性病例27例;ICA法和ELISA法的灵敏度分别为21．48％和20．0％,特异性为100％。结论ICA法和ELISA法均具有较高特异性,但其灵敏度较低。     

Update on the development of enterovirus 71 vaccines

Introduction: Enterovirus 71 (EV71) is an etiological agent that causes severe neurological complications in children. EV71 outbreaks have occurred throughout the Asia-Pacific region, posing a severe global public health threat; however, no specific therapeutic strategy exists for treating EV71-infected children.

Areas covered: Five manufacturers have produced inactivated EV71 whole virus vaccines in mainland China, Taiwan, and Singapore, which have completed Phase III (mainland China) and Phase I (Taiwan and Singapore) clinical trials. Various EV71 vaccine candidates are being researched in animal models, including live-attenuated virus vaccine, recombinant VP1 vaccine, VP1-based DNA vaccine, synthetic peptide vaccine and virus-like particle vaccine. In this review, the present situation is summarized, and feasible improvements to the EV71 vaccine are explored.

Expert opinion: Although inactivated EV71 vaccines are safe, efficient and elicit strong immune responses to protect adults, children and infants against infection, the quality control of production is critical.     

2011-2012年杭州市手足口病的病原构成及肠道病毒71型的分子流行病学特征

目的 探讨杭州市手足口病病原谱构成及其肠道病毒71型(human enterovirus 71,EV71)的分子特征。 方法 采集210例疑似手足口病感染者的粪便标本及其相关临床资料,采用实时荧光定量反转录聚合酶链反应(real time RT-PCR)方法进行初步检测,利用RT-PCR扩增部分EV71和柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16, Cox A16)阳性样本VP1基因区并测序分析。 结果 荧光定量RT-PCR检测表明,210例疑似感染者的粪便中, EV71、Cox A16 和其他肠道病毒的阳性率分别为60.95%(128/210)、21.43%(45/210)和9.05%(19/210)。10株EV71病毒VP1区核酸序列与JX509922、JX509924、JX509926、JX509927、 JX509928和 JX509929的同源性最高为95.7%~98.0%,且均属于EV71中 C4a亚型。 结论 EV71和Cox A16是杭州市儿童手足口病的主要病原体。因此加强EV71和Cox A16的监测特别是EV71的检测,有助于更好地预防和控制手足口病。     

HBOV病毒VP1蛋白的重组表达及在感染检测中的应用

[目的]建立检测HBOV感染的免疫学检测方法和进行儿童人群中感染调查。[方法]采用PCR扩增克隆HBOV病毒VP1核衣壳蛋白部分基因，将其基因克隆至PET32a，构建原核表达重组质粒，在大肠杆菌中以包涵体形式获得表达。诱导表达后采用凝胶电泳切胶纯化目的蛋白。用重组蛋白作包被抗原建立了间接酶联免疫检测方法。[结果]病人血清及献血员血清均以1：50稀释。经检测北京和深圳的85份标本，阳性6人，阳性率7．06％，而正常献血员150人均为阴性，人群中感染率较低。[结论]成功重组表达了VP1蛋白，建立了检测抗体的ELISA方法。国内存在该病毒感染，被调查的人群中HBOV感染率较低。     

肠道病毒71型2A蛋白酶通过切割宿主蛋白泛素特异性蛋白酶4促进病毒的复制

目的探讨肠道病毒71型(EV71)2A蛋白酶与宿主蛋白泛素特异性蛋白酶4(USP4)在EV71感染中的作用。方法实时荧光定量PCR检测EV71感染人横纹肌肉瘤细胞(RD)后USP4 mRNA表达水平,western blot检测VP1及USP4蛋白;通过敲减宿主细胞USP4,观察VP1 mRNA的表达和病毒滴度水平;通过过表达2A蛋白酶,研究宿主细胞USP4蛋白的切割原因。结果荧光定量PCR结果表明,EV71感染8 h时USP4 mRNA的表达水平开始降低(0 h、8 h分别为1.03±0.04和0.83±0.02,t=4.50,P<0.05);western blot结果表明,EV71感染8 h时USP4的蛋白质表达水平降低(0 h、8 h分别为1.25±0.01和0.51±0.02,t=57.32,P<0.05)并出现切割条带;敲除宿主细胞USP48 h后,与对照组(1.48±0.08)相比,实验组VP1 mRNA表达水平(3.66±0.08)明显升高(t=17.51,P<0.05);病毒滴度检测结果发现,与对照组病毒滴度[(8.20±0.17)×105 PFU/mL]比较,siRNA1敲除组病毒滴度[(10.55±0.29)×105 PFU/mL]升高,差异有统计学意义(t=6.98,P<0.05)。过表达2A蛋白酶,宿主蛋白USP4出现切割条带。结论USP4参与抗病毒免疫反应,可能正向调节抗病毒信号通路;EV71可通过2A蛋白酶切割宿主细胞蛋白USP4从而逃逸免疫应答,促进病毒的复制。