枸杞果糖激酶基因LbFRK7的克隆及表达分析

该研究以‘宁杞1号’枸杞果实为材料,基于转录组测序TR28373|c0_g1序列,利用RT-PCR技术,克隆出枸杞果糖激酶基因LbFRK7的全长序列为1 060bp,其中,ORF开放阅读框为1 044bp,编码有348个氨基酸,蛋白质分子量为37.44kD,理论等电点5.05;LbFRK7编码的氨基酸序列包含有pfkB碳水化合物激酶家族高度保守的3个特异性区域,2个底物识别位点,4个ATP结合位点;LbFRK7与烟草和辣椒的FRP7基因序列相似性较高,达到90%;利用实时荧光定量技术分析发现,不同组织中LbFRK7基因均有表达,且果实中的表达量最高,根中最低;随着果实的发育,果实中LbFRK7基因的表达量呈先升后降的变化趋势,并于开花后15d达到最高。在果实发育前期,LbFRK7基因的表达量与果糖含量的变化趋势相同,但在果实发育中期和后期,LbFRK7基因的表达量与果糖含量的变化趋势相反。相关分析结果显示,LbFRK7表达量与果糖和蔗糖含量的相关系数分别为-0.326和-0.339,但均未达到显著水平。研究表明,LbFRK7基因在枸杞果实发育过程中对果糖转化起到一定作用,特别是在果实成熟过程中对果糖含量的升高具有重要的作用。该研究结果为进一步探讨枸杞LbFRK7的功能及果糖代谢奠定了基础。     

柑橘果糖激酶基因的克隆及表达

植物果糖激酶(FRK)在果糖磷酸化中起重要作用。通过PCR技术从温州蜜柑(Citrus　unshiu　Marc.)基因组中扩增得到编码果糖激酶基因的2个基因组DNA片段,分别命名为Cufrk1、Cufrk2,利用RT-PCR从果实中分离到了与Cufrk1外显子序列一致的cDNA序列,并通过RACE技术分离到这个基因的全长cDNA序列,命名为CuFRK1(GenBank号:　AY561840)。Cufrk1与Cufrk2编码氨基酸序列相似性为68%。CuFRK1　cDNA全长为1　459　bp,5'端和3'端的非翻译区分别为167　bp和239　bp,该序列含有一个完整的开放读码框,编码350个氨基酸,蛋白质分子量约为37.5　kD,等电点为5.03,含有2个果糖激酶糖特异结合域及3个ATP结合域,其氨基酸序列与其他植物中已分离的果糖激酶基因相似性在62%￣78%。Northern分析显示,CuFRK1(Cufrk1)与Cufrk2在柑橘幼叶、发育初期果实中表达量较高,在果皮和茎中不表达,在花瓣及成熟果实中表达模式有一定差异。酶活性分析表明,果实中的果糖激酶活性随果实的发育而降低,同时,果实中的果糖不断积累,在果实整个发育过程中果糖含量与果糖激酶活性呈极显著负相关。     

柑橘果糖激酶基因的克隆及表达

植物果糖激酶(FRK)在果糖磷酸化中起重要作用.通过PCR技术从温州蜜柑(Citrus unshiu Marc.)基因组中扩增得到编码果糖激酶基因的2个基因组DNA片段,分别命名为Cufrk1、Cufrk2,利用RT-PCR从果实中分离到了与Cufrk1外显子序列一致的cDNA序列,并通过RACE技术分离到这个基因的全长cDNA序列,命名为CuFRK1(GenBank号:AY561840).Cufrk1与Cufrk2编码氨基酸序列相似性为68%.CuFRK1 cDNA全长为1 459 bp,5'端和3'端的非翻译区分别为167 bp和239 bp,该序列含有一个完整的开放读码框,编码350个氨基酸,蛋白质分子量约为37.5 kD,等电点为5.03,含有2个果糖激酶糖特异结合域及3个ATP结合域,其氨基酸序列与其他植物中已分离的果糖激酶基因相似性在62%～78%.Northern分析显示,CuFRK1(Cufrk1)与Cufrk2在柑橘幼叶、发育初期果实中表达量较高,在果皮和茎中不表达,在花瓣及成熟果实中表达模式有一定差异.酶活性分析表明,果实中的果糖激酶活性随果实的发育而降低,同时,果实中的果糖不断积累,在果实整个发育过程中果糖含量与果糖激酶活性呈极显著负相关.     

磷酸果糖激酶-1与磷酸果糖激酶-2不是同工酶

磷酸果糖激酶-1与磷酸果糖激酶-2催化的反应性质、底物都相同,但是它们的产物是不同的。因此．严格的说它们不是同工酶。     

温州蜜柑果实发育期间果糖激酶与糖积累的关系

研究了温州蜜柑果实发育进程中糖含量变化与果糖激酶活性变化的关系及增施氮肥对果实果糖激酶活性和基因表达的影响.结果表明,随着果实的发育,可食组织果糖激酶活性逐渐降低,糖含量不断增加,果皮中蔗糖和葡萄糖含量在成熟期略有下降,果糖激酶活性略有升高.果实膨大期后增施氮肥的果实在成熟期可食组织及果皮中蔗糖和果糖所占比例均有所下降,葡萄糖比例升高,以单位蛋白质表示的果糖激酶活性也明显高于对照果实.Northern分析表明,增施氮肥能促进发育后期果实可食组织中Cufrkl基因的表达,但对Cufrk2的表达无明显作用.     

纳豆激酶酶原基因和纳豆激酶基因的克隆及在大肠杆菌中表达

目的：构建可高效生产有活性的纳豆激酶的大肠杆菌工程菌。方法：将纳豆激酶酶原（pro-nattokinase,pro-NK)基因和纳豆激酶（natokinase,NK)基因,并分别克隆到表达融合蛋白的高效表达载体pJN上,构建出表达质粒pJNK1和pJNK2,并转化大肠杆菌BL21（DE3）。结果：IPTG诱导下,两个融合蛋白的表达量均达到30%,活性检测显示表达纳豆激酶酶原融合蛋白的菌株pJNK-1(BL)诱导后菌体破碎上清的溶栓活性比表达纳豆激酶融合蛋白的菌株pJNK-2(BL)高2-3倍,结论：纳豆激酶酶原融合蛋白部分自减切产生纳豆激酶成熟肽。     

纳豆激酶基因的克隆及其在枯草杆菌中的表达

为研究纳豆激酶（nattokinase,NK)的生物化学性质,以纳豆芽胞杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增包含启动子及3‘端非翻译区的纳豆激酶全长基因序列。经鉴定后构建大肠杆菌－枯草杆菌穿梭表达质粒pBLNK,转化蛋白缺陷型枯草杆菌,筛选表达菌株。表达株培养15h后收集培养上清液,SDS－PAGE分析证实表达产物后,用超滤浓缩、分子筛、离子交换等步骤分离纯化重组NK,每升发酵液得纯度达95％的重组NK约100mg,比活性达12000u/mg。     

菠萝叶片依赖焦磷酸的磷酸果糖激酶的纯化及其特性

经硫酸铵分部,DEAE—纤维素、羟基磷灰石、Sephadex G—200及磷酸纤维素柱层析,从菠萝叶片分离得到电泳均一的依赖焦磷酸的磷酸果糖激酶(PFP)。SDS电泳图谱表明有一条分子量为62kD的主带和一条57 kD的弱带。Fru—2,6—P_2对酶的正反应活性有促进作用。动力学研究表明,Fru—2,6—P_2增加V_(max)及酶对底物Fru—6—P和Mg~(2+)的亲和性。     

大肠杆菌磷酸果糖激酶基因在极端嗜酸性氧化硫硫杆菌中的表达

构建了含大肠杆菌磷酸果糖激酶(EC 2.7.1.11)基因pfkA的重组质粒pSDK1,利用大肠杆菌pfk缺陷株筛选含目的基因的重组质粒,通过接合转移的方式将其导入氧化硫硫杆菌TtZ2中,接合转移频率达2.6×10-6。重组质粒在TtZ2中有较好的稳定性,在无选择压力条件下传代50次基本保持稳定(重组质粒保留68%以上)。酶活性测定、SDSPAGE及RTPCR结果表明,pfkA基因在氧化硫硫杆菌中得到表达,但其表达水平低于大肠杆菌。葡萄糖可促进含pSDK1的氧化硫硫杆菌TtZ2的生长,而对照菌株的生长则未受明显影响,说明重组菌可部分利用葡萄糖作为碳源生长。     

纳豆激酶基因在大肠杆菌中活性表达的比较研究

实现纳豆激酶基因 (nattokinasegene)在大肠杆菌中高活性表达 ,并说明前肽 ( pro序列 )对纳豆激酶的活性表达必不可少。以纳豆芽孢杆菌基因组DNA为模板 ,采用PCR方法分别扩增编码信号肽、前肽及成熟肽的序列 ( pre pro NK)和编码前肽、成熟肽的序列 (pro NK) ,构建了大肠杆菌表达质粒 pTYB1 0 1 ,pTYB1 0 2 ,转化大肠杆菌ER2 5 66。在IPTG诱导下 ,分别在 1 5℃ ( 1 4h) ,3 0℃ ( 3h)和 3 7℃ ( 2h)培养。结果可见 ,pTYB1 0 2能表达有活性的纳豆激酶。SDS PAGE表明 ,1 5℃表达杂蛋白更少。薄层扫描显示表达的纳豆激酶占菌体总蛋白的 3 0 %以上。成功制备了表达纳豆激酶的工程菌。     

海滨木巴戟的生理生态特征研究

为了解海滨木巴戟(Morinda citrifolia)生长的抗逆性,对西沙群岛东岛的海滨木巴戟的生物学和生理生态特征进行了研究。结果表明,海滨木巴戟属于阳生性植物,具有较强的光资源竞争能力;其叶片氮、磷含量、叶绿素b含量较高,是其长期适应热带海岛生境的重要原因。海滨木巴戟叶片的海绵组织及气孔密度大,导管直径小,丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性和过氧化氢酶活性高,脯氨酸含量低,均表明其具有较强的抗旱性。且生长环境中土壤的氮含量低,盐分含量高。因此,海滨木巴戟可作为热带海滨植被恢复中的优良适生物种。     

基于ISSR技术研究诺丽种质资源的亲缘关系

为探讨我国诺丽(Morinda citrifolia)种质资源的亲缘关系,采用ISSR技术对诺丽种质资源的遗传关系进行分析。结果表明,10条ISSR引物对13份诺丽种质资源共扩增出183条带,其中多态性条带有159条,占86.9%。13份诺丽种质的遗传相似系数为0.464~0.784。聚类分析将13份诺丽种质资源聚为两类,其中诺丽小黑种单独聚为一类,与其他12份诺丽种质资源的亲缘关系较远。虽然按照外部形态特征不能将所有诺丽种质完全区分,但具有相同特征的多数种质还是聚在同一类或亚类中。     

热带植物海巴戟抗寒株系选育

为了选育海巴戟（Morinda citrifolia）抗寒株系,拓宽种植范围,在云南元江选择8株海巴戟,采用石蜡切片法观察叶片解剖结构,并测量叶片的过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、超氧化歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量,对抗寒株系的甘油-3-磷酸酰基转移酶（GPAT）活性和GPAT表达进行定量分析。结果表明,叶片解剖结构表明有4株海巴戟叶片的栅海比较高,细胞结构紧密,确定为抗寒性优良的候选株系（5、6、8和12号）。5号植株叶片经低温处理后的CAT、POD、SOD活性较高,MDA含量较低,确定为抗寒株系,且低温处理后5号植株叶片的GPAT活性和GPAT基因表达水平均高于不抗寒材料。因此,海巴戟叶片通过增加栅海比和细胞结构紧密度,同时GPAT基因迅速应答来提高抗寒性。     

种植模式对巴戟天生长的影响

为探讨种植模式对中药材巴戟天(Morinda officinalis)生长的影响,对两种种植模式下巴戟天生长性状进行了研究。结果表明,坡地连片种植基地(PLZ)的土壤有效矿质营养和有机质含量分别低于坡地围林种植基地(PWZ)的24%～28%和38%～43%,差异极显著(P 0.01)。PWZ种植3年的巴戟天茎、叶和肉质根形态指标均显著优于PLZ的(P 0.01);但随着栽培时间的延长,PLZ的巴戟天肉质根性状逐渐优于PWZ的,PLZ的6 a生巴戟天单株产量是PWZ的1.16～1.17倍;肉质根多糖、总黄酮和原花青素含量均显著高于PWZ的(P0.01),且有效成分含量均随种植时间的延长呈上升趋势(P0.01)。可见,巴戟天在PLZ模式下的肉质根质量好,入药更符合国家药典优品性状的要求。同时,建议合理增加肉桂围林种植基地的光照量,抑制藤苗生长,以提高巴戟天肉质根的产量和有效成分积累。     

FaPYL9基因调控草莓果实成熟的分子机理

该研究以草莓品种‘红颜’(Fragaria ananassa‘Benihoppe’)果实为试材,从红颜草莓果实中克隆得到1个ABA受体基因FaPYL9,该基因含有1个555bp核苷酸的开放阅读框,编码184个氨基酸序列,含有1个氨基酸保守区域PYR_PYL_RCAR_like。FaPYL9基因在草莓果实发育7个时期的表达量分析表明,随着草莓果实的成熟,FaPYL9基因的表达量迅速升高,并且在果实全红时表达量达到最高;干扰草莓果实中的FaPYL9基因,会延迟草莓果实成熟期3~5d,同时会降低与草莓果实着色相关的FaCHS和FaUFGT基因的表达量,并且果实中的蔗糖含量以及花青素含量也随之降低,ABA含量和果实硬度增加。研究表明,FaPYL9基因在草莓果实成熟发育过程中起重要作用,能促进草莓果实成熟。     

池蝶蚌和三角帆蚌谷胱甘肽S转移酶基因表达特征

采用RT-PCR方法克隆获得池蝶蚌(Hyriopsis schlegerlii)和三角帆蚌(H.cumingii)GST片段,两种蚌的GST核苷酸序列相同,推导其编码92个氨基酸;经与不同物种进行氨基酸序列比对,显示其与软体动物、两栖动物和高等哺乳动物的GST具有高度同源性。RT-PCR半定量分析表明,GST在两种蚌的肝、闭壳肌等11种组织中除肠以外均有表达,肝中表达量较大;注射嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)后,三角帆蚌血细胞中GST表达量先降低后升高,而池蝶蚌血细胞中GST表达量先升高后降低,且在感染3h、6h、9h和24h时表达量约为三角帆蚌的2倍。     

巴西橡胶树HbWRKY1基因的克隆及转化烟草的初步研究

利用RACE结合RT-PCR技术,从巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)总RNA中扩增得到长度为1234 bp的WRKY基因cDNA全长编码序列。通过氨基酸同源性比对,该序列推导的氨基酸序列与蓖麻、白杨的WRKY同源性分别为79%和73%,表明分离的cDNA序列为橡胶树WRKY基因,命名为HbWRKY1。通过构建pCAMBIA1304-HbWRKY1植物表达载体,经农杆菌GV3101介导,将HbWRKY1基因导入烟草(Nicotiana tabacum)中,对所获得的潮霉素抗性烟草株系进行PCR鉴定。结果表明,HbWRKY1基因已整合到65株转基因植株中。干旱胁迫试验表明,HbWRKY1的过量表达可以明显提高转基因烟草对干旱胁迫的耐受能力。这说明WRKY基因与橡胶树抗旱能力之间存在一定的关系。     

皱皮木瓜果实发育后期品质变化及其成熟阶段的划分初探

以湖北长阳产皱皮木瓜为材料,测定果实发育后期果实鲜质量、果长、果径、果色、果实硬度以及果肉干物质量、可溶性糖含量、总酸含量和总黄酮含量等品质指标的动态变化,划分不同成熟阶段,为判断果实适宜采收期、实现优质生产提供理论参考。结果表明:(1)皱皮木瓜果实发育后期果实鲜质量、果长、果径、果肉干物质量和可溶性糖含量均呈现上升趋势;果色由绿色、黄绿色渐变为淡黄色到黄色;果实硬度、果肉总酸和总黄酮含量呈先上升后下降趋势。(2)各品质指标快速变化的时间区域存在差异,果实鲜质量在花后105~150d增加较快,果色在150d后逐渐变黄,果实硬度在花后135~165d快速下降,果肉总酸、总黄酮含量则在花后105~120d快速增加至峰值。(3)根据主成分分析结果和各品质指标的变化特点,可初步将皱皮木瓜果实发育后期划分为未成熟(花后105d之前)、早期成熟(花后120~150d)和成熟(花后165~180d)3个阶段。研究表明,随着果实成熟度的提高,皱皮木瓜果实鲜质量、果色、果肉干物质量、可溶性糖含量等指标不断升高,果实硬度逐渐下降,其食用加工品质不断提升,而在早期成熟阶段(花后120~150d)果实的药用品质则相对较高。     

橄榄果实发育过程中细胞壁物质和相关酶活性变化

为了解橄榄(Canarium album)果实质地差异形成的原因,以鲜食型橄榄‘清榄1号’和加工型橄榄‘长营’为材料,对果实发育过程中细胞壁物质含量和相关酶活性进行了测定。结果表明,随着橄榄果实的成熟,‘清榄1号’较‘长营’维持较高的果胶甲酯酶(PME)活性,促进了果胶的水解,离子型果胶(ISP)含量较高而共价型果胶(CSP)含量较低。2个橄榄品种纤维素含量均较高,‘清榄1号’果实的半纤维素含量低于‘长营’。‘清榄1号’木质素含量低于‘长营’,较高的苯丙氨酸解氨酶(PAL)和过氧化物酶(POD)活性促进了木质素含量的增加。因此,ISP、CSP、半纤维素和木质素含量的不同可能是2个橄榄品种果实质地差异形成的原因。     

毛尖紫萼藓抗旱相关基因Gp-LEA的克隆与表达分析

以毛尖紫萼藓干旱cDNA文库中获得的一段与LEA基因同源性较高的EST序列为基础,采用RACE技术分离该基因cDNA全长序列,命名为Gp-LEA。Gp-LEA基因的cDNA全长814bp,开放阅读框456bp,编码含151个氨基酸蛋白质。生物信息学分析结果显示,Gp-LEA蛋白为稳定蛋白,分子质量为16.612kD,理论等电点（pI）为5.06,含有LEA₂功能结构域,不属于跨膜蛋白且不存在信号肽。系统发生分析表明,Gp-LEA基因编码蛋白与花旗松LEA蛋白亲缘关系最近。荧光定量PCR分析显示,Gp-LEA基因在复水和快速干旱模式下均能表达。推测Gp-LEA基因在毛尖紫萼藓的复水和干旱过程中起着重要作用。