羊水来源干细胞的研究进展

羊水中含有来自胎儿的细胞。从20世纪70年代开始,从孕中期羊水中分离培养胎儿细胞进行染色体核型分析成为最常用的产前诊断技术。近年,有关羊水中干细胞的研究逐渐引起关注。由于羊水取材方便,对母婴创伤小,没有伦理学方面的限制,使羊水干细胞有希望成为理想的种子细胞来源之一。有关羊水干细胞的研究尚处于起步阶段,现对羊水干细胞的来源、培养方法、生物特性及应用前景作一综述。     

荧光原位杂交技术在未培养羊水细胞产前诊断中的应用研究

目的:探讨运用荧光原位杂交(FISH)技术对未培养羊水细胞的染色体非整倍体进行快速诊断的临床应用价值.方法:对符合产前诊断要求的孕妇于孕18～24周抽取羊水,用13、21、18及X、Y号染色体探针对其未培养羊水细胞进行诊断,并与核型分析结果比较.结果:125例标本的核型分析中,成功培养123例,其中117例为正常核型,6例为异常核型,异常核型为21-三体2例,9号染色体臂间倒位3例,6号和7号染色体平衡易位1例;与核型分析相比,FISH只检测出2例非整倍体核型,其余染色体结构异常未能检出,FISH检测时间为24～48小时,较传统核型分析时间2～3周大大缩短,且同核型结果一致,特异性100%.结论:荧光原位杂交技术具有简便、准确等优点,可快速地辅助核型分析,缓解患者及家属情绪,有临床推广价值.     

FISH技术在未培养羊水间期细胞产前诊断1例先天愚型的研究

目的 本文报告1例曾生育1胎同源罗式易位先天愚型儿的中孕妇女。用双色荧光原位杂交(FISH)检测未培养羊水细胞，产前诊断先天愚型的研究。方法 (1)选择LSI21(红色标记)及CEP18(绿色标记)DNA探针，对未培养羊水行双色FISH，同时作常规细胞培养。(2)对引产胎儿实体组织直接制备间期细胞，行21号染色体单色FISH分析。结果 (1)96％羊水细胞显示3红、2绿荧光信号。(2)羊水培养胎儿核型为46，xx，-21，t(21；21)，与第一胎基本类同。(3)引产物90％以上细胞有3个红色荧光信号。以上三项检测结果一致。结论 FISH是一种新型产前诊断失天愚型的有效方法。直接制备胎儿实体组织间期细胞行FISH分析，验证产前诊断准确性方法快速、简便。本例二次生育同源罗式易位先天愚型，病例实属罕见。     

原代卵巢上皮性癌干细胞样细胞的分离、培养及鉴定

目的 研究无血清培养基悬浮培养原代卵巢上皮件癌(卵巢痛)细胞,筛选并鉴定卵巢癌千细胞样细胞.方法 卵巢癌组织取自1例卵巢浆液性囊腺痛Ⅲ期、细胞分化2级的患者,分离的原代细胞培养于无血清培养液[添加表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白血病抑制因子(LIF)和胰岛素等细胞因子]得到球样细胞团细胞,并采用常规含血清的培养液进行培养得到贴壁细胞.应用定量PCR技术检测球样细胞团细胞表达干细胞标志基因的情况,应用四甲基偶氮唑蓝比色法、Hoechst 33342染色的流式细胞仪检测球样细胞团细胞的耐药性,并榆测球样细胞团细胞的裸鼠体内致瘤性.结果 在无血清添加细胞因子的培养条件下,原代卵巢癌细胞形成球样细胞团,这些细胞能够存活、增殖、具有自我更新的功能.球样细胞团细胞Nanog、Oct-4、Sox-2、nestin、CD_(133)、CD_(117)及ABCG2等干细胞标志基因的mRNA表达量为分化贴壁细胞的14～400倍.球样细胞团细胞还具有对顺铂和紫杉醇更强的耐药性,将顺铂与紫杉醇同时作用于贴壁细胞及球样细胞团细胞48及72 h后,球样细胞团细胞抑制率为31%、29%,显著低于分化细胞(抑制率为61%、73%),分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05).球样细胞团细胞中Hoechst 33342染色阳性的细胞比例为21.83%,而贴壁细胞为83.04%,两者比较,差异有统计学意义(P<0.01).500个球样细胞闭细胞可在裸鼠体内成瘤,肿瘤组织的病理特征与原发肿瘤相似,且高表达上皮性肿瘤标志物CA_(125)和细胞角蛋白7.结论 采用无血清悬浮培养法从原代卵巢癌组织中获取的球样细胞团细胞,可能含有比例较高的具有增殖和分化能力的卵巢癌干细胞样细胞,并具有干细胞的功能.     

人羊水来源干细胞治疗大鼠卵巢早衰的初步研究

目的:尾静脉注射移植人羊水干细胞(AFS),评价其治疗大鼠卵巢早衰(POF)的效果。方法:采用SD大鼠,按体重随机分为四组:A组正常组、B组模型组、C组一次移植组和D组两次移植组,除A组灌胃生理盐水外,其余各组均连续14天灌胃雷公藤多苷片;C组在第14天灌胃后移植一次AFS,D组在第1天与第7天灌胃后移植两次AFS;观察大鼠阴道涂片、血清性激素水平、大鼠卵巢及子宫组织形态学变化。结果:(1)B组动情周期较A组显著延长,C组与D组均有不同程度恢复,D组恢复状况优于C组;(2)HE染色结果显示,D组大鼠卵巢均有新生卵泡;(3)性激素检测结果显示,各组之间E2值差异均有统计学意义(P均<0.01)。结论:AFS对POF有修复作用,可能通过促进卵泡生成,调节雌激素分泌,从而改善了卵巢功能。     

孕中期羊水细胞染色体核型分析及其异常核型发生率的比较

目的：分析孕中期羊水细胞染色体核型及比较不同异常核型的发生率,并对各种异常核型的临床意义进行探讨。方法1998年9月至2010年11月在复旦大学附属妇产科医院集爱遗传与不育诊疗中心行羊水细胞染色体检查的孕妇共13 648例,抽取并培养成功的羊水标本共计13 795份,即13 795个胎儿获得核型诊断,对上述胎儿根据其母亲（孕妇）不同检查指征进行分组：当孕妇年龄≥35岁时为高龄孕妇组（4065个）;血清学筛查提示高危时为血清筛查高危组（6462个）;超声筛查出现异常征象时为超声异常征象组（1539个）;已知夫妇中有一方为染色体异常时为夫妇染色体异常组（108个）;除此之外,其他胎儿列为其他因素组（1621个）。采用羊水细胞培养法对各组胎儿进行染色体核型分析,并用荧光原位杂交技术对78个≥26孕周的胎儿行常见非整倍体快速诊断,对153个核型异常胎儿的父母进行淋巴细胞核型分析。结果 (1)各组异常核型分类及其构成：13 795个胎儿中共发现异常核型388个,异常核型发生率为2.813％(388/13 795)。388个异常胎儿中,非整倍体最多,为59.8％ (232/388);常染色体结构异常为24.7％( 96/388);嵌合体为12.4％( 48/388);其他较少见的异常核型包括标记染色体为1.3％ (5/388),性染色体结构异常为1.0％(4/388),三倍体为0.8％(3/388)。除了夫妇染色体异常组,其他各组均以非整倍体占绝大多数,有4例罕见的非整倍体,分别出现在高龄孕妇组、超声异常征象组及血清筛查高危组。超声异常征象组异常核型种类最多,而夫妇染色体异常组其胎儿染色体异常种类最集中（常染色体结构异常）。嵌合体主要分布在血清筛查高危组,占该组异常核型的20.0％ (29/145)。(2)异常核型种类及发生率：异常核型种类中以21三体最为常见,占全部异常核型的35.6％( 138/388),其次为常染色体平衡性结构重排为20.6％ (80/388)、嵌合体为12.4％ (48/388)、18三体为11.3％ (44/388),其他较常见的异常核型包括常染色体非平衡性结构重排和45,X0,各为4.1％(16/388),47,XXY为3.9％(15/388)。(3)父母淋巴细胞核型分析：153个胎儿进行了其父母淋巴细胞的核型分析,并最终确定了胎儿异常核型来源：家族性异常58个,新发生的异常95个。78个胎儿的荧光原位杂交技术诊断结果与G显带核型全部一致,其中2个为21三体。结论不同检查指征孕妇的胎儿异常核型的构成不同;孕中期胎儿异常核型种类繁多,致畸风险与异常核型种类有关。     

支持细胞对体外培养精原干细胞的作用途径研究

目的:探讨支持细胞对体外培养精原干细胞的作用途径。方法:选用7 d龄雄性昆明种小鼠,两步酶消化法获得睾丸组织细胞悬液,差异时间贴壁法分离精原干细胞和支持细胞,免疫荧光法和油红O染色法分别对其进行生物学鉴定,流式细胞仪对精原干细胞进行纯度分析。按培养条件的不同将实验分为3组:精原干细胞与支持细胞共培养组(A组)、条件培养基组(B组)、常规培养基组(C组)。其中条件培养基按单纯支持细胞培养清液∶双倍浓缩的DMEM/F12∶胎牛血清=4.5∶4.5∶1的比列配置;常规培养基即含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12。台盼蓝法测定各组贴壁率,四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定各组精原干细胞的吸光度并绘制增殖曲线。倒置显微镜下观察各组精原干细胞增殖特点及集落形成情况。比较各组精原干细胞24 h贴壁率、增殖曲线及存活时间的不同。结果:A组精原干细胞24 h贴壁率大于B组及C组(P<0.05),而B、C组间无差异(P>0.05);A组精原干细胞接种起即稳定增殖,于7~10 d形成稳定集落并维持约30 d的特性。B组和C组均表现为精原干细胞经短暂的增殖后呈现快速减少的趋势,培养1周后,精原干细胞数目明显减少。结论:支持细胞对体外精原干细胞的作用是依靠两者之间的直接联系和支持细胞的旁分泌2种途径;而仅依靠支持细胞的旁分泌作用不能促进精原干细胞的贴壁和增殖。     

荧光原位杂交在未培养羊水细胞产前诊断中的临床应用研究

目的:建立稳定的荧光原位杂交(FISH)技术,探讨FISH技术在未培养羊水细胞产前诊断的-临床应用价值.方法:应用国产5条染色体探针(13、18、21、X、Y)对411例有产前诊断指征的孕妇进行未培养羊水细胞的FISH检测,同时进行细胞染色体核型分析,对两者检测结果进行比较.结果:411例中,正常核型398例,非整倍体核型5例(均为21-三体),结构异常4例(平衡易位2例、倒位2例),染色体多态4例.其中正常核型及5例非整倍体核型能被FISH检测出,而染色体结构异常和染色体多态未能检测出;FISH检测时间为48～72小时,较传统核型分析时间(14～21天)大大缩短;FISH检测一次成功率97.3%,并且不受孕周的限制;FISH检测与细胞培养核型分析相符;FISH检测没有受到羊水性状的影响;染色体非整倍体的诊断准确率达100%.结论:应用国产探针对未培养羊水细胞进行FISH分析,实验方法简便快速,可用于染色体非整倍体的产前诊断,有较大的临床应用价值.     

新生鼠大脑皮层神经干细胞培养及其在同胞鼠的细胞替代作用

目的从新生鼠大脑皮层分离培养神经干细胞(neuralstemcells,NSC),并将这些NSC植入局灶性缺血损伤鼠的大脑皮层,观察其植入同胞鼠后的细胞替代作用。方法应用含表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF或FGF-2)的无血清DMEM/F12(1∶1)培养液获得新生鼠NSC球,酶免疫技术检测NSC标志nestin和诱导分化实验证明所获得的细胞球是NSC。在细胞球的体外培养中掺入BrdU,标记NSC,用于移植实验。鼠出生后第4天,开颅去脑膜阻断脑皮层血液供应建立新生鼠脑皮层局灶性缺血动物模型,术后第4天(出生后第8天)将标记好的NSC直接注射到缺血损伤灶的边缘区。实验鼠分为损伤移植组、损伤对照组和假手术对照组。于移植后第4、7、14、30天杀鼠取脑,进行BrdU标记的酶免疫组化染色,检查植入细胞的存活和迁移情况。结果新生鼠大脑皮层在体外培养一周,可以获得漂浮生长的、表达nestin的、具有分化为神经元和星形胶质细胞潜能的NSC球。移植实验发现:植入细胞有向大脑皮层缺血损伤灶周边迁移的特点,促进损伤灶组织结构的修复,损伤获得了很好的细胞修复作用。镜下可见灶区有满视野BrdU标记的阳性细胞,颗粒层集聚密度最大,未见有远部位的细胞迁移。假手术对照鼠脑内细胞逐渐减少,至移植后第14天只能检测到零星散在阳性细胞,明显较损伤移植鼠少。结论新生鼠大脑皮层内存在NSC。缺血性损伤可刺激移植的NSC增殖与迁移。移植的NSC对于大脑皮层局灶性缺血损伤灶的完整修复发挥了重要作用。     

15230例孕中期唐氏筛查产前诊断的临床应用

目的:探讨孕中期唐氏筛查对检出胎儿染色体异常的预测价值。方法:2008年1月至2009年10月,采用时间荧光免疫分辨法对我院15230例孕中期(15～20+6周)妇女进行血清标志物甲胎蛋白(AFP)、游离雌三醇(uE3)、绒毛膜促性腺激素(β-HCG)3项指标进行检测,对于筛查结果为高风险的孕妇于孕20～24周行羊膜腔穿刺进行胎儿羊水细胞染色体核型分析,并对唐氏筛查情况进行效果评价。结果:984例孕妇唐氏筛查为高风险,高风险率为6.46%,其中唐氏综合征阳性孕妇736例,18-三体阳性78例,神经管缺陷阳性169例。有773例高风险孕妇接受羊水穿刺,发现胎儿染色体异常29例,异常检出率为3.75%,其中唐氏综合征11例,18-三体1例,69,XXX1例。唐氏筛查的敏感性和特异性分别为92.86%和95.25%。结论:孕中期唐氏筛查是预测异常胎儿和不良妊娠结局的有效手段之一,羊水细胞核型分析在产前诊断中具有重要的实用价值。     

羊水细胞培养用于染色体病产前诊断64例分析

目的探讨用羊水细胞培养对孕中期孕妇进行产前诊断的可行性及必要性,防止染色体病患儿出生。方法2003年3月至2004年12月北京大学深圳医院采用羊水细胞培养G显带技术,对64例具有产前诊断指征的孕妇进行检查。结果发现1例世界罕见染色体异常核型46,XY,der(11)t(8;11)(q24;q25),58例正常核型,5例核型为多态,诊断结果与随访情况一致。结论羊水细胞培养进行产前诊断是十分安全而可靠的。     

Hormonal oral contraceptive influence on isolation,Characterization and cryopreservation of mesenchymal stem cells from menstrual fluid

The purpose of the study was to evaluate whether the intake of hormonal oral contraceptive influences the viability of mesenchymal stem cell. Sixteen healthy female volunteers with regular menstrual cycles were invited to participate. Menstrual fluid was collected on the day of maximum flux, and collected cells were analyzed by a ‘minimal standard’ for MSC characterization: plastic adherence, trilineage (adipogenic, osteogenic, chondrogenic) in vitro differentiation and a minimalistic panel of markers assessed by flow cytometry (CD731, CD901, CD1051, CD34–, CD45–) using monoclonal antibodies. The participants were divided into two groups: Group 1 – no hormonal contraceptive use; Group 2 – hormonal oral contraceptive use. The median of the menstrual fluid volume was 5.0 and the median number of cells was 5.2?×?10⁶. Median of cell viability was 89.3%. After culture, mesenchymal stem cells increased from 0.031% of the total cells to 96.9%. The cells formed clusters and reached confluence after 15–21?days of culture in the first passage. In the second passage, clusters and the confluence were observed after 3?days of culture. No difference was observed between the groups. Our data suggest that oral hormonal contraceptive intake maintains the viability of mesenchymal stem cells from menstrual fluid.     

改良羊水原位培养法进行产前诊断的研究

目的 :探讨改良羊水原位培养法在产前诊断中的价值。方法 :抽取 138例孕16～ 30周孕妇的羊水 ,用全营养培养基 4ml+羊水细胞混悬液 5ml接种培养 ,适时改良法原位收获制片、分析。结果 :138例羊水培养均获成功 ,成功率 10 0 % ;平均培养时间为 7天 ;平均可分析核型数 38个 ,发现染色体异常 4例。结论 :用此法培养羊水成功率高 ,培养时间短 ,可分析核型多 ,培养适用范围宽 ,可满足临床产前诊断的要求     

Human amniotic fluid stem cells have better potential in early second trimester of pregnancy and can be reprogramed to iPS

Objective

To study the difference of amniotic fluid stem cell potential at different gestational age.

人阴道黏膜干细胞的筛选与培养

目的:探讨人阴道黏膜干细胞(vaginal mucosa stem cells,VMSCs)的分离、筛选与适合的体外培养方法。方法:用胰酶、胶原酶混合消化法获得阴道黏膜细胞。以丝裂酶素C处理的小鼠成纤维细胞作滋养层细胞。将20min内黏附于Ⅳ型胶原的阴道黏膜细胞定为VMSCs。对筛选的VMSCs与原代人阴道黏膜细胞分别用碘化丙啶(PI)一步荧光染色法,用流式细胞仪检测其细胞周期。分为4组体外培养原代VMSCs,第1组用滋养层细胞+上皮细胞完全培养液;第2组滋养层细胞+DMEM/F12(3:1);第3组无滋养层细胞+上皮细胞完全培养液;第4组无滋养层细胞+DMEM/F12(3:1)。培养至12天,比较各组的CK19、CK10阳性细胞的比例、克隆形成率(clony forming efficiency,CFE)与凋亡前传代的次数。结果:筛选的VMSCs与原代人阴道黏膜细胞的G_0/G_1细胞比例、CK19、CK10细胞阳性比例均有统计学差异(P＜0．05)。用滋养层细胞+上皮细胞完全培养液培养VMSCs12天的CFE与CK19阳性细胞比例最高,CK10阳性细胞比例最低,体外培养VMSCs能稳定传代15代以上。结论:Ⅳ型胶原快速黏附法可有效地筛选VMSCs。滋养层细胞+上皮细胞完全培养液为体外培养原代VMSCs的较佳方法。