通过基因突变提高噬菌体蛋白Ⅷ介导的抗体Fab段的展示

目的　构建基因Ⅷ变种文库 ,筛选表面展示效率高的突变体 ,改进抗体分子在噬菌体表面的呈现效果。方法　通过重叠PCR ,在基因Ⅷ引入随机突变 ,克隆到抗乙肝表面抗原 (HBsAg)的噬菌体抗体表达载体中 ,使抗HBsAg的Fab段通过蛋白Ⅷ展示于噬菌体表面 ,构建蛋白变种Ⅷ文库 ,筛选能使HBsAg表面呈现效果得到提高的蛋白Ⅷ突变体。结果　构建了一个库容为 6× 10 8的基因Ⅷ变种文库 ,使用游离抗原竞争、硫氰酸盐洗涤等方法进行淘筛 ,获得多个展示活性高于野生型蛋白Ⅷ的突变体 ,其中 2个最好的变种可使表面呈现效果提高 5 0～ 70倍。结论　通过对基因Ⅷ的改造可提高其对抗体Fab段的展示性能 ,获得 2株可使展示活性提高 5 0～ 70倍的基因Ⅷ突变体     

用蛋白Ⅷ在噬菌体表面展示抗体分子效果的观察

目的 观察抗体分子通过丝状噬菌体主要外壳蛋白Ⅷ（cpⅧ）和次要外壳蛋白Ⅲ（cpⅢ)在噬菌体表面呈现效果的差异。方法 分别构建通过cpⅢ或cpⅧ展示抗乙肝表面抗原（HBs)Fab,ScFv和抗角蛋白（Ker)Fab的表达载体，制备噬菌体抗体，比较其抗原结合活性和Fab呈现水平。用多种方法尝试提高cpⅧ介导的噬菌体展示效果。结果 cpⅧ对不同特异性抗体Fab段和不同形式的小分子抗体（Fab和ScFv)的展示效果均低于cpⅢ的展示，增加cpⅧ－Fab对野生型cpⅧ的表达比例，试用不同菌株，在Fab和cpⅧ之间插入间隔序列及换用控制更为严密的启动子等,匀未能改善cpⅧ介导的噬菌体展示。结论 以前所报道的通过cpⅧ多价展示Fab段不是普遍存在的现象，对有些抗体基因不能达到多价展示。     

抗人红细胞抗体和HIV抗原融合蛋白的构建及活性鉴定

目的构建及表达抗红细胞(RBC)单链抗体(ScFv)和HIV抗原的融合蛋白,并做活性测试。方法将鼠抗人红细胞单链抗体可变区重链、轻链基因与HIV抗原基因相连,重组于高效表达载体中,并在大肠埃希菌中表达。结果经ELISA检测和红细胞凝集检测,证明表达的融合蛋白具有HIV抗原和抗人红细胞的双重活性,可使含有HIV抗体的红细胞悬液凝集。结论融合蛋白构建成功,可用于HIV的快速检测。     

抗HBsAg和抗RBC双特异minibody载体的构建及表达

目的：用抗HBsAg和抗RBC单链抗体构建双特异minibody抗体模型。方法：将人IgG1 CH3经点突变方式,在CH3界面由大分子氨基酸代替小分子氨基酸形成“knob”（T366W）（杵状结构）,另一个CH3分子由3个小分子氨基酸代替3个大分子氨基酸形成“hole”（T366S：L368A：Y407V）（臼状结构）,并在此基础上在适当位置上引入半胱氨酸残基形成二硫键（S354C：T366W／Y349C：T366S：L368A：Y407V）。 然后将“knob”和“hole”分别接连于抗HBsAg和抗RBC单链抗体基因3’端,并将两基因组装于同一表达载体中,在大肠杆菌中分泌表达。结果：依CH3界面不同共构建3种不同的表达载体,分别带有①野生型CH3;②杵臼结构（T366W／T366S：L368A：Y407V）突变型CH3,③杵臼结构加二硫键（S354C：T366W／Y349C：T366S：L368A：Y407V）突变型CH3。大肠杆菌分泌表达后,ELISA法检测抗HBsAg和抗RBC活性,3种表达上清均有相同的抗HBsAg和抗RBC活性;两种带有突变型CHE的minibody用血球凝集法可检测到抗HBsAg和抗RBC双特异活性。结论：CH3界面经适当改造可促进异源二聚体形成,并在大肠杆菌获得功能性表达,得到双特异minibody。     

人源抗癌胚抗原单克隆抗体的获得与鉴定

目的：获得抗癌胚抗原（CEA）的单克隆抗体（mAb）。方法：采用特殊的5轮筛选法（逐轮降低抗原包被量，严格洗脱条件），以固相化的人源CEA抗原淘筛本室构建的人源特异性噬菌体抗体库。获得有特异结合活性的CEA噬菌体抗体，酶切鉴定插入的抗体基因。切去噬菌粒上衣壳蛋白gⅢ基因，构建表达载体，在大肠杆菌中可溶性表达抗CEA抗体Fab段，ELISA、Western blot检测抗体免疫学活性，测序分析抗体基因。结果：筛选出4株与CEA抗原特异结合而与BSA、HBsAg无交叉结合反应的噬菌体抗体。切去gⅢ基因，在大肠杆菌中表达可溶性抗体Fab段，表达量在细菌培养液上清和细菌裂解液中无统计学意义。可溶性抗体与人CEA抗原有特异结合活性，与BSA、HBsAg无交叉结合反应。Western blot显示在略大于相对分子质量（Mr）45000处有一明显条带，与Mr48000的Fab大小一致。DNA测序分析表明Fab段VH属于IgGVH3基因家族，VL属于VK1基因家族。结论：抗CEA噬菌体抗体库的构建和人源抗CEAmAb的制备，为CEA阳性表达肿瘤的靶向治疗奠定基础。     

用噬菌体蛋白Ⅸ展示抗HBsAg分子Fab段

目的　用丝状噬菌体外壳蛋白Ⅸ (pⅨ )展示抗体Fab段 ,并与外壳蛋白Ⅲ (pⅢ )展示效果进行比较。方法　采用PCR方法钓取噬菌体蛋白Ⅸ基因 ,构建pⅨ展示抗乙肝表面抗原Fab的表达载体 ,制备噬菌体抗体 ,鉴定其抗原结合活性和Fab呈现水平 ,观察了噬菌体洗脱回收效率 ,并与pⅢ展示进行比较。结果　噬菌体pⅨ可以展示有功能活性的抗体Fab段 ,但对Fab的展示率低于pⅢ ,展示率的高低可能与pⅨ展示的外源蛋白分子量大小有关。“结合 洗脱 回收”实验显示 ,酸洗脱法回收的Fab pⅢ噬菌体的感染活性大为下降 ,而对Fab pⅨ噬菌体无影响。结论　pⅨ成功展示Fab段 ,讨论了pⅨ展示体系可能具有的优越性     

人源抗戊型肝炎病毒单克隆抗体的获得与鉴定

目的　获得人源中和性抗戊型肝炎病毒 (HEV)单克隆基因工程抗体。方法　采用五轮筛选法 (逐轮降低抗原包被量 ,严格洗脱条件 ) ,以固相化的 4种含中和抗原表位的HEV代表株ORF2重组混合抗原淘筛本室构建的HEV患者外周血源的噬菌体抗体库。获得有特异结合活性的噬菌体抗体 ,酶切鉴定抗体基因插入。切去噬菌粒上衣壳蛋白gⅢ基因构建表达载体 ,在大肠杆菌中可溶性表达抗HEV抗体Fab段 ,ELISA、Westernblot检测抗体免疫学活性 ;测序分析抗体基因。结果　筛选出 4株与含中和抗原表位的HEV代表株ORF2重组混合抗原特异结合而与BSA、HBsAg无交叉结合反应的噬菌体抗体 ,可能为中和抗体。切去gⅢ基因 ,在大肠杆菌中表达可溶性抗体Fab段 ,表达量在细菌培养液上清和细菌裂解液中差异无显著性。可溶性抗体与含中和抗原表位的HEVORF2重组混合抗原有特异结合活性 ,与BSA、HBsAg无交叉结合反应。Westernblot显示在相对分子质量 (Mr)略大于 4 5× 10 3 处有一明显条带 ,与Mr4 8× 10 3 的Fab大小一致。DNA测序分析表明 ,Fab段VH 属于IgGVH3基因家族 ,VL 属于Vκ1基因家族。结论　利用噬菌体抗体库技术成功获得抗HEV的人源单克隆抗体。     

CD28噬菌体展示及其生物活性检测

目的 以噬菌体展示具有天然结构的人CD28分子胞外区同二聚体，检测其抗原性和生物活性，为CD28拮抗性类肽的筛选奠定基础。方法 RT-PCR从Jurkat细胞扩增CD28胞外区，将其克隆入噬菌粒载体pComb3HSS，构建的重组载体电转入受体菌XL1-blue，并加辅助噬菌体VCSM13，使CD28胞外区展示在噬菌体表面。以ELISA、流式细胞仪检测噬菌体展示CD28的抗原性和与B7-1的结合力。MTT法检测噬菌体展示CD28的生物活性。结果 成功构建表达人CD28分子胞外区同二聚体的重组噬菌粒载体pComb3H-CD28，并以噬菌体展示系统展示CD28分子。ELISA和FCM结果显示，噬菌体展示CD28可与抗CD28抗体特异性结合，也可与Jurkat细胞表面CD28竞争结合抗CD28抗体，具有CD28抗原性。噬菌体展示CD28可与B7-1特异性结合，也可与Raji细胞表面CDS0结合，具有与配体结合能力。体外生物活性实验显示，噬菌体展示CD28可抑制抗CD28抗体刺激的人外周血淋巴细胞增殖反应。结论 利用噬菌体展示系统成功展示CD28同源二聚体，噬菌体展示CD28具有抗原性及生物活性，为以CD28为靶点体外筛选CD28拮抗性类肽，从而防治移植排斥反应和自身免疫病奠定了基础。     

从噬菌体抗体库筛选人源性抗白细胞介素8抗体

目的: 从噬菌体抗体库中筛选人源性抗IL- 8单链抗体(scFV)。方法: 采用原核表达载体pRSET- IL- 8在大肠杆菌BL21(DE3)中表达IL- 8 His融合蛋白, 并通过亲和层析纯化。以该融合蛋白为固相抗原, 对噬菌体抗体库进行 3轮淘筛, 并对所获阳性克隆进行抗原结合活性测定和DNA序列测定。结果: 获得 2株特异性抗IL- 8噬菌体抗体。对其DNA序列测定结果表明, 其VH基因均属于人IgGVH3亚群, Vλ基因分别属于人VλDPL5和VλDPL2亚群。结论: 利用噬菌体抗体库技术可不经免疫制备人源性抗IL- 8抗体, 为银屑病及相关疾病的临床应用提供了条件。     

人CD137胞外区噬菌体展示系统的构建及鉴定

目的：以噬菌体展示具有天然结构的人CD137分子胞外区，检测其抗原性和生物活性，为以CD137为靶点体外筛选CD137拮抗性类肽药物奠定基础。方法：PCR方法从CIS质粒扩增人CD137胞外区，将其克隆人噬菌粒载体pComb3HSS，构建的重组载体电转入受体菌XLl-Blue，并加辅助噬菌体VCSM13共感染，使CD137胞外区展示在噬菌体表面。采用ELISA法检测噬菌体展示CD137的抗原性，MTT法检测CD137噬菌体对抗CD137抗体刺激的人外周血淋巴细胞增殖作用的影响检测其生物活性。结果：成功构建表达人CD137分子胞外区的重组噬菌粒载体pComb3H-CD137，并以噬菌体展示系统展示CD137分子胞外区。ELISA结果显示噬菌体展示CD137可与抗人CD137抗体特异性结合，证实CD137分子成功展示于噬菌体表面，且具有抗原性。体外生物活性实验显示，展示在噬菌体表面的CD137可抑制抗CD137抗体刺激的人外周血淋巴细胞增殖反应，证实噬菌体展示的CD137有与其配体结合的生物活性结构域。结论：利用噬菌体展示系统成功展示CD137胞外区，噬菌体展示CD137具有抗原性及生物活性。     

人源抗乙肝表面抗原基因工程抗体的研究

目的 研制人源抗乙肝表面抗原(HBsAg)基因工程抗体.方法 采集多个HBsAg加强免疫后表面抗体阳性(HBsAb+)志愿者的外周血,分离淋巴细胞,构建人源抗HBsAg Fab噬菌体抗体基因文库.用纯化的HBsAg对抗体库进行富集筛选,经过序列测定确定抗体轻重链型别,分别克隆入真核细胞表达载体pAc-FcR和HL51-14,转染昆虫Sf9细胞和293T细胞,利用杆状病毒/昆虫细胞系统和哺乳动物细胞系统实现全抗体的分泌型表达.结果 成功筛选出20株抗HBsAg的人源Fab抗体并制备出其中6株的IgG全抗体,竞争性ELISA结果显示6株全抗体针对的是HBsAg 3个不同表位.结论 成功筛选并获得了6株针对3个不同表位的抗HBsAg的IgG全抗体,为治疗性抗体和新疫苗的研制奠定了基础.     

Rapid detection of hepatitis B virus surface antigen by an agglutination assay mediated by a bispecific diabody against both human erythrocytes and hepatitis B virus surface antigen

Bispecific antibodies have immense potential for use in clinical applications. In the present study, a bispecific diabody against human red blood cells (RBCs) and hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) was used to detect HBsAg in blood specimens. The bispecific diabody was constructed by crossing over the variable region of the heavy chains and the light chains of anti-RBC and anti-HBsAg antibodies with a short linker, SRGGGS. In enzyme-linked immunosorbent assays, this bispecific diabody showed specific binding to both RBCs and HBsAg. When this bispecific diabody was mixed with human blood specimens in the presence of HBsAg, the dual binding sites of the diabody caused agglutination of human RBCs. This diabody-mediated agglutination assay was then used to test 712 clinical blood specimens and showed 97.7% sensitivity and 100% specificity when the results were compared with those of the conventional immunoassay, which was used as a reference. This autologous RBC agglutination assay provides a simple approach for rapid screening for HBsAg in blood specimens.     

单链抗体（ScFv）表达载体的构建及抗HBs ScFv的表达

通过ＤＮＡ重组技术和ＰＣＲ技术，将Ｆａｂ表达载体改建成了ＳｃＦｖ表达载体。该载体可以表达表达方式产生噬菌体抗体，用于抗体库技术，也可以分泌型表达产生有活性的ＳｃＦｖ。所表达的抗ＨＢｓ ＳｃＦｖ具有与其亲本Ｆａｂ相同的抗体活性。载体上具有聚组氨酸编码序列，使表达的ＳｃＦｖ可经金属螯合层析法进行简便有效的纯化。     

人源性噬菌体抗体库的构建及HBsAg人单抗的筛选

用聚合酶链伸反应从人外周血淋巴细胞克隆出Ｆｄ段和ｋ链基因，重组到表达载体ｐＣＯＭＢ３中，构建了人源性噬菌体抗体，将乙肝病毒表面抗原固相化对噬菌体抗体库进行了三轮“吸附－洗脱－扩增”的筛选，使特异性噬菌体抗体得到了富集，筛选到了抗ＨＢｓＡｇ的人单抗。     

抗人HBsAg单链抗体基因的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的：构建抗人HBsAg单链抗体基因，并分析其在COS—7细胞中的表达。方法：以从噬菌体抗体库中筛选的抗HBsAg的Fab抗体基因为模板，分别扩增其轻、重链可变区(VL、VH)基因，通过重组PCR方法将轻、重链可变区基因用连接肽(C1y4Ser)3的编码序列连接，并引入前导肽编码序列，构建具有L—VH—Linker—Vl结构的单链抗体基因。将所构建的单链抗体基因克隆入绿色荧光蛋白(GFP)融合表达载体pEGFP—N3，并转染COS—7细胞进行表达。结果：经测序表明，前导肽、连接肽、VL及Vh的序列正确。酶切鉴定证实，成功地构建了GFP基因融合表达载体。瞬时转染COS—7细胞后，通过荧光显微镜观察证实有ScFv融合蛋白的表达。转染细胞的培养上清浓缩后，进行SDS—PAGE及westem blot分析，可检出ScFv融合蛋白的分泌性表达。培养上清的间接ELISA检测证实，所表达的单链抗体具有与HBsAg结合的特异性。结论：成功地构建了抗人HBsAg单链抗体基因，并可在COS—7细胞中分泌性表达。     

人源性抗HBsAg抗体Fab段噬菌体呈现文库的构建、筛选及阳性克隆核苷酸序列测定

目的:构建一个经HBsAg主动免疫的人lgG1抗体噬菌体展示文库,通过特异的淘筛(panning)获得与HBsAg有较高亲和力的Fab抗体,并测定其编码序列。方法:从一经乙肝疫苗免疫的自愿者的外周血分离淋巴细胞提取RNA,逆转录合成cDNA。PCR扩增重链Fd和κ轻链cDNA。依次将PCR产物克隆进载体pComb3H相应的位点,构建成噬菌体呈现库,并以HBsAg包被的96孔板对抗体库进行3轮淘筛,将所获克隆分别与HBsAg进行ELISA反应,挑取显色大于对照20倍以上的阳性克隆进行DNA测序。结果:lgG1的Fd段和κ轻链cDNA得到扩增,构建了一实际库容量为1.8×10⁵的噬菌体呈现文库。通过特异性淘筛,获得与HBsAg有较高新合力的3株Fab抗体并测定其编码序列。DNA序列测定结果表明,3株抗体中两株的Fd段完全一样,且3株的轻链完全一样。结论:成功构建了一个经HBsAg抗原免疫的人源抗体Fab段噬菌体抗体库,筛选得到了3株特异性抗体的Fab片段。     

重组抗HBx单链噬菌体的表达

目的：进一步探索重组基因工程抗体在原核系统中有效的活性表达途径。方法：在已构建的抗ＨＢｘ单链抗体（ＳｃＦｖ）的基础上,利用粘粒载体构建了抗ＨＢｘ单链噬菌体抗体（ｐｈａｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）,并转化大肠杆菌。结果：该噬菌体抗体经辅助噬菌体Ｍ３Ｋ０７诱导和噬菌体次要衣壳蛋白（ＰⅢ）融合表达,并组装成噬菌体衣壳蛋白可溶性表达于培养液上清,经ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔａｒｎ－ｂｌｏｔ的结果证实可溶性表达产物具     

The expression and characterization of a bifunctional protein in E. coli for autologous erythrocyte agglutination test

H antigen, the precursor of A and B antigens, belongs to Hh blood system in which it is the only antigen. H antigen distributes on all the human RBC surface except for Bombay phenotype and the copy number of H antigen on the surface of an adult RBC is approximately 1.7 × 10^6. These characteristics made H antigen the potential target molecule for the immunoassay and immunotherapy. A monoclonal antibody 2E8 against H antigen on the surface of erythrocyte had been prepared in previous work. Based on this antibody, the variable region genes of heavy and light chains （Vu and VL） from 2E8 had been cloned by 5＇ RACE. The two variable region genes were spliced by overlap extension and assembled ScFv （Vu-linker-VL） gene encoding the anti-H antigen named ScFv2Es. According to the prediction of the three-dimension structure of ScFv2Es and Cul fragment from 2E8 and HIV-1 gp41 antigen peptide, we further constructed the ScFv2Es-Cul-gp41 fusion molecule. The recombinant ScFv2Es-Cul-gp41 gene was cloned into pET-his vector and expressed in BL21（DE3）plysS cells. The fusion protein was purified from the inclusion bodies. In a series of subsequent analyses, this fusion protein showed identical antigen binding site and activity with the parent antibody. Meanwhile, in mimic test, as the main ingredient of reagent for autologous erythrocyte agglutination test, the bifunctional protein could agglutinate the RBCs in the presence of HIV-1 gp41 antibodies using sera from HIV-infected individuals. Cellular ＆ Molecular Immunology. 2008;5（4）：299-306.     

重链可变区基因随机CDR3ScFv噬菌体抗体库的构建及筛选

目的构建VH 基因随机CDR3ScFv噬菌体抗体库 ,并筛选抗HFRS病毒NP抗原的噬菌体抗体。方法采用随机引物PCR法扩增抗HFRS病毒mAb1A8的VH 基因 ,并与1A8VL 基因共同克隆入噬菌粒表达载体 pHEN1后 ,构建VH 基因随机CDR3ScFv基因库。继用辅噬菌体VCSM13超感染后得到噬菌体抗体库 ,然后用HFRS病毒抗原进行筛选。随机挑取筛选的菌落超感染 ,用夹心ELISA检测超感染上清。结果获得库容量约为107 噬菌体抗体库。夹心ELISA的结果表明 ,筛选出的噬菌体抗体可与HFRS病毒NP抗原特异性结合。结论成功地构建了库容量较高的ScFv噬菌体抗体库 ,并获得可与HFRS病毒NP抗原结合的噬菌体抗体。