EST技术及其在基因全长cDAN克隆上的应用策略

随着人类基因组计划的顺利进行，EST技术被广泛应用基因识别、绘制基因表达图普、寻找新基因等研究领域。利用人类基因组研究不断产生的，从ESTs即cDNA的部分序列入手，通过同源筛选，获得基因部分乃至全长cDNA序列，避免或减轻了构建与筛选cDNA库等繁锁的实验室工作。本从原理、应用有其在科学研究上产生的影响等方面对EST技术进行了概述。     

克隆新基因cDNA全长的策略和方法

克隆新基因及获得其cDNA全长是现代生命科学中研究基因功能的重要前提。随着分子生物学技术的迅速发展，克隆新基因的技术也不断得到发展和完善，尤其是生物技术与信息技术的结合和应用，计算机克隆基因开始兴起。本文介绍几种近年常用的克隆新基因cDNA全长的方法，原理及其优缺点。     

EST在克隆新基因中的应用

随着基因定位 (连锁图谱、物理图谱、转录图谱 )和DNA测序及生物信息技术的迅猛发展 ,EST已成为人类寻找新的未知基因以及克隆不同时空差异表达基因和疾病相关基因的重要标志物。随着EST数据库的进一步完善 ,网上克隆和定位候选克隆策略将成为克隆新基因的主要方法 ,并在虚拟的网上空间将模型生物基因组的研究成果成功地应用于人类基因组的研究中     

应用EST和电子克隆策略研究血吸虫表达基因谱

目的开展血吸虫表达基因谱的研究,寻找新的疫苗候选分子和药物靶标。方法应用表达序列标签（EST）和电子克隆策略。结果获得了552个EST序列和487个电子延伸序列,其中104个EST序列在延伸前未表现同源性,而延伸后表现出有意义的同源性;获得了日本血吸虫基因表达谱的信息以及发现了有潜在药物和疫苗价值的新基因序列。结论本研究为日本血吸虫基因表达谱的研究提供更有效的研究思路。     

一个新的小鼠腭裂候选基因cDNA序列的克隆

目的 克隆并筛选与小鼠腭裂发生相关候选新基因。方法 利用聚合酶链反应改良扣除杂交技术，克隆正常组与腭裂组小鼠腭突组织中差异表达的基因，经反向点杂交鉴定后挑选阳性克隆并测序及同源性分析，Northern印迹杂交检测所获的新基因mRNA的全长。结果 经大规模测序后得4个新的表达序列标签，其中1个片段全长为809bp，Northern印迹杂交结果显示为该基因的eDNA全长。结论 获得一个新的与小鼠腭裂发生相关的候选基因的cDNA全长。     

克隆新基因cDNA全长的策略和方法

克隆新基因及获得其 c DNA全长是现代生命科学中研究基因功能的重要前提。随着分子生物学技术的迅速发展 ,克隆新基因的技术也不断得到发展和完善 ,尤其是生物技术与信息技术的结合和应用 ,计算机克隆基因开始兴起。本文介绍几种近年常用的克隆新基因 c DNA全长的方法、原理及其优缺点     

LIGHT基因的克隆及其可溶性表达

目的　克隆LIGHT基因 ,构建含有人LIGHT基因的表达载体 ,诱导其在大肠杆菌中可溶性表达 ,并对表达的LIGHT蛋白的生物学活性进行检测。方法　从人的外周血单个核细胞中克隆LIGHT全长cDNA及其胞外区片段 ,并将其胞外区片段亚克隆至原核表达载体pET 11a中 ,筛选阳性重组质粒pET LIGHT ,以IPTG诱导其可溶性表达 ,并以SDS PAGE和Westernblot检测进行分析。表达的蛋白初步纯化后 ,进行生物学活性分析。结果　RT PCR扩增出了LIGHT全长 72 3bp的cDNA。SDS PAGE和Westernblot分析证实重组pET LIGHT质粒可表达出相对分子质量 (Mr)为 19× 10 3的蛋白。可溶性LIGHT重组蛋白可共刺激T细胞的增殖及诱导IFN γ的产生。结论　本实验成功地将LIGHT胞外区片段在大肠杆菌中进行表达 ,表达的蛋白具有生物学功能 ,这为进一步的LIGHT基因的功能研究打下了基础     

6q25区域内一个新基因MTLC的克隆及特性分析

目的：克隆6q25区域内喉癌相关新基因。方法：以表达序列标签为电子探针，在人类基因组数据库中进行电子杂交，钓出相就基因组DNA克隆后进行基因预测。根据获得的基因序列设计引物，逆转录－聚合酶链反应扩增新基因cDNA。结果：克隆了1个6q25区域内的新基因。该基因全长约21kb，含两个外显子，其cDNA序列长1006bp，编码蛋白包括235个氨基酸。其5’侧翼序列存在癌蛋白c-Myc的结合位点，将其命名为MTLC（c-Myc target from laryngeal cancer cells）基因。同源性分析表明该基因编码蛋白与小鼠MT－MC1蛋白同源性达78％。MTLC蛋白一级结构含有一个核定位信号结构域，亚细胞定位实验证实该基因主要在细胞核表达，Northern印迹分析表明MTLC基因在心肌、肝、肾、脑等多个组织有表达。结论：成功克隆了1个新基因MTLC，该基因可能作为c-Myc的靶基因以转录因子形式参与维持细胞正常生理功能。     

电子克隆技术及其在医学领域的应用

基于表达序列标签(ESTs)和基因组数据库的电子克隆(in silico cloning)策略,是近年发展起来的一门基因克隆的新技术.其技术核心是利用生物信息学技术组装延伸ESTs序列,获得基因部分乃至全长cDNA序列.它具有投入低、速度快、技术要求低和针对性强等优点.人类疾病发生与基因的关系已经被广泛证实,因此电子克隆技术必将成为疾病研究的重要手段.旨在阐述电子克隆技术在医学领域的应用进展.     

全长人穿孔素cDNA的克隆与3'端部分表达

目的克隆人穿孔素(perforin, PFP)基因并选择性地体外表达抗原特异性C端肽段。方法利用RT-PCR技术,从人肝总RNA中克隆全长PFP cDNA并进行序列测定分析。将编码PFP C端(hPFP-C)125个氨基酸的cDNA片段亚克隆,并插入载体pGEX-2T中用IPTG诱导融合蛋白表达。目的肽段采用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析和凝血酶酶切纯化,并用溶血法测定其生物学活性。结果克隆的全长人PFP cDNA与已发表的PFP基因序列相比较,有4个碱基不同,导致3个氨基酸残基改变。重组基因在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达的融合蛋白的相对分子质量(Mr)为40 000,纯化后的hPFP-C肽段Mr为14 000。重组hPFP-C肽段与兔红细胞共育,呈现钙依赖的溶血活性。结论人PFP基因可能存在多态性,其C端肽段亦有溶解兔红细胞的活性。     

PCR技术在cDNA文库构建中的应用

cDNA库在基因分离和克隆中具有重要作用。近年来,随着分子生物学技术的发展,cDNA库的构建方法有了许多改进和提高。尤其是PCR技术的发明和引进使从少量来源的组织和细胞中构建cDNA库成为可能。本就PCR技术在cDNA库构建中的应用方面的进展作一综述。     

汉坦病毒A9株M基因片段全长cDNA克隆及其在痘苗病毒中的瞬时表达

采取反转录一聚合酶链反应（ＰＣＲ），分３个片段扩增Ｉ型汉坦病毒（野鼠型）中国毒株Ａ９株Ｍ基因片段，分别克隆入ＰＧＥＭ－Ｔ载体中。选择３个正向插入的ＴＡ９ＩＢ、ＴＡｇＣＤ、ＴＡｇＥＡ克隆，选用ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＶ进行酶切、连接，获得了１个在ＰＧＥＭ－Ｔ载体中插入３．６ｋｂ的Ａｇ株Ｍ基因片段ｃＤＮＡ克隆，酶切图谱分析证实播入片段正确。将Ａ９Ｍ片段在痘苗病毒／Ｔ７噬菌体ＲＮＡ聚合酶瞬时（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）表达系统中进行表达，用抗汉坦病毒糖蛋白单克隆抗体进行免疫荧光检测，观察到很强的特异性荧光，证明ＡｇＭ基因ｃＤＮＡ能进行表达。     

人THANK cDNA的克隆及其在大肠杆菌中表达

目的克隆THANKcDNA,并在大肠杆菌中进行表达。方法采用RT-PCR技术,从人外周血单个核细胞的总RNA中扩增人THANK全长编码区基因及THANK胞外区编码基因,PCR产物直接克隆于pMD-18T载体中,重组克隆进行DNA测序。将测序证实的THANK胞外区基因亚克隆到原核表达载体pET-11a中。阳性重组子,以1mmol/LIPTG进行诱导表达,以SDS-PAGE分析THANK胞外区的表达。对表达的蛋白作初步纯化处理后,进行生物学活性检测。结果RT-PCR扩增出一个858bp的DNA片段,限制性内切酶图谱分析和测序结果显示,该片段为编码人THANK的cDNA,与公布的人THANK基因序列一致。将胞外区片段克隆入表达载体,转化大肠杆菌表达后发现,与阴性对照相比,在相对分子质量（Mr）26×104处多显示出一条条带。对该蛋白进行初步活性测定显示其可显著地抑制U937细胞的生长。结论本实验成功地克隆了人THANK基因,并将其可溶性胞外区片段在大肠杆菌中进行了表达,表达的重组蛋白可抑制U937细胞的生长。这为进一步进行THANK基因的功能研究及其开发和临床应用奠定了基础。     

一个新的蛋白激酶基因DYRK3的克隆及其特征分析

目的分离一个与人的蛋白激酶ＤＹＲＫ２高度同源新的蛋白激酶的全长ｃＤＮＡ，并推测其分类和功能。方法应用与人的蛋白激酶ＤＹＲＫ２高度同源的３′端部分ｃＤＮＡ序列为探针，筛选ｃＤＮＡ文库和ｇＤＮＡ文库，并进行氨基酸序列同源性分析和ＦＩＳＨ定位。结果从人的骨骼肌ｃＤＮＡ文库和睾丸ｃＤ－ＮＡ文库各分离到一个新的蛋白激酶的全长ｃＤＮＡ。骨骼肌来源的ｃＤＮＡ编码５８８个氨基酸的蛋白质，睾丸来源的ｃＤＮＡ编码５６８个氨基酸的蛋白质，前者第２７个氨基酸以后的序列与后者第７个氨基酸以后的序列完全一致。结论推测这两个ｃＤＮＡ是同一基因在骨骼肌组织和睾丸组织中的不同剪接本。由于该基因与人的ＤＹＲＫ２高度同源，故称之为ＤＹＲＫ３基因。ＤＹＲＫ３与丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶酵母Ｙａｋ１，人和果蝇的Ｍｎｂ，人的Ｃｌｋ１等有较高的同源性，也与人的Ｃｄｋ２等其它丝氨酸／苏氨酸激酶有同源性。作者认为ＤＹＲＫ３是属于丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶ＣＭＧＣ组Ｃｌｋ家族新的一员。该基因定位在１ｑ３２。     

一个在小鼠头部特异表达的新基因BSG1 cDNA的克隆及研究

目的 克隆小鼠头部发育过程中特异表达的新基因并对新基因可能的功能进行初步分析。方法 采用消减差异筛选的方法筛选小鼠头部特异表达的新基因,并用生物信息学的方法对克隆到的新基因进行序列分析和蛋白结构域的预测。同时,还采用了小鼠胚胎原位杂交、小鼠脑部切片的原位杂交以及鸡胚的原位杂交方法研究BS61基因的表达情况。结果 克隆到1个与小鼠头部发育相关的新基因BSG1(brain specific gene 1),其Gen Bank的登录号为AY210402。该基因包含1个2133bp的完整阅读编码框,编码1个710aa的C2H2型锌指蛋白。它与人的KIAA0441基因在氨基酸水平上有82.8％的同源性。该基因定位在小鼠的第10号染色体上,含7个外显子,6个内含子。BSG1主要在小鼠胚胎、鸡胚的头部表达,并且BSG1在小鼠头部表达的部位局限在海马、齿状回和小脑。结论 BSG1是1个可能的转录因子,在脑部特异表达。对其研究有助于进一步揭示大脑发育的分子机理。     

鸭α干扰素成熟蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

鸭Ⅰ型干扰素基因是在1995年由Schults等成功克隆的。基因总长度为1．2kb，其蛋白质由191个氨基酸组成，其中N末端的30个疏水氨基酸为信号肽，成熟多肽为161个氨基酸。本实验利用PCR技术从pMD-18-duIFN-α重组体上克隆出鸭α干扰素成熟蛋白基因(mDuIFN-α)，并用pET30a表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中进行了高效表达。     

人LIGHT基因的克隆及其重组腺病毒载体的构建

目的 克隆人LIGHT基因，构建其重组腺病毒载体，以研究LIGHT过表达与腺病毒感染对细胞生长的影响。方法 用RT-PCR法从人外周血单个核细胞（PBMC）中克隆人的LIGHT全长基因。将LIGHT cDNA克隆到穿棱载体pAdTrack-CMV-LIGHT重组质粒中，经酶切线性化后，将重组质粒pAdTrack-CMV-LIGHT和骨架质粒pAdEasy-1，以电穿孔法共转染大肠杆菌BJ5183，获得重组腺病毒质粒。最后，将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒，用荧光显微镜、PCR及Western blot分析LIGHT基因的表达。结果 用RT－PCR法从人的PBMC中，扩增出723bp的cDNA，测序证实为人LIGHT基因。荧光显微镜、PCR及Western blot证实，LIGHT重组腺病毒可感染293细胞，并在293细胞内进行有效的复制。结论 成功地克隆了人LIGHT基因，并构建了其重组腺病毒载体，为进一步研究LIGHT基因的功能提供了条件。     

人IL-1RⅡ基因的克隆及其表达

克隆人IL 1RⅡ基因 ,构建其逆转录病毒载体 ,以探讨其在IL 1主导疾病中的作用。方法 :用RT PCR法从人外周血单个核细胞 (PBMC)中克隆人的IL 1RⅡ基因。将其克隆到原核表达质粒PET2 2b中 ,构建重组质粒PET2 2b IL 1RⅡ。将该重组质粒依次进行PCR、酶切鉴定及测序后 ,转化BL2 1菌 ,以IPTG诱导表达。表达产物用Westernblot鉴定。另外 ,将以酶切重组质粒PET2 2b IL 1RⅡ所获IL 1RⅡ基因的全长ORF ,克隆到逆转录病毒质粒中并转染 2 93细胞 ,用免疫组化染色法检查IL 1RⅡ基因的表达。结果 :用RT PCR法 ,从人PBMC中扩增出 12 0 3bp的cDNA ,测序证实为人IL 1RⅡ基因。Westernblot表明 ,重组质粒可表达IL 1RⅡ蛋白。免疫组化染色表明 ,IL 1RⅡ重组逆转录质粒可在 2 93细胞中高效表达IL 1RⅡ蛋白。结论 :成功地克隆了人IL 1RⅡ基因 ,构建了其原核表达载体和重组逆转录病毒载体 ,并在BL2 1菌中表达IL 1RⅡ重组蛋白 ,为进一步研究IL 1RⅡ基因在相关疾病中的作用创造了有利条件