斑点叉尾鮰套肠症的病原鉴定及其药敏特性

从患败血症并出现肠套叠的斑点叉尾鮰Ictalurus punctatus肝脏、肾脏及脑组织中分离到一株细菌(TE090214),经人工感染试验证实,该菌为斑点叉尾鮰病鱼的病原且具有高度致死性。对分离菌进行了形态特征、理化特性等较系统的表观分类学特征鉴定。结果表明:该菌经革兰氏染色为阴性,形状为两端钝圆的短杆菌,无荚膜及芽孢,氧化酶阳性,鸟氨酸脱羧酶阴性;能发酵葡萄糖产气,能利用甘露醇、蔗糖、阿拉伯糖和水杨苷产酸,能水解七叶苷等。对该菌的16S rDNA进行PCR扩增、克隆测序,得到1条长度为1 537 bp的核苷酸序列(GenBank登录号GQ184148);在以该菌16S rDNA序列和GenBank数据库内同源性较高的细菌16S rDNA序列构建的系统发育树中,菌株TE090214与嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophi-la聚在一簇,结合形态及生理生化特点,可将该菌株鉴定为嗜水气单胞菌。药敏试验结果显示:在供试的15种抗菌药物中,菌株TE090214对头孢哌酮、卡那霉素、氧氟沙星、恩诺沙星、诺氟沙星敏感,对链霉素、阿米卡星、复方新诺明中度敏感,对氨苄青霉素等7种药物存在不同程度的耐药性。     

鮰爱德华菌单克隆抗体的制备及其在黄颡鱼“红头病”研究中的应用

以黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco"红头病"病原——鮰爱德华菌Edwardsiella ictaluri A86为抗原,利用杂交瘤技术制备了鮰爱德华菌黄颡鱼分离株的菌体单抗5D11、1B8、1G7、3G8、5A9、3H8,其效价分别为1∶1280、1∶1280、1∶2560、1∶320、1∶160和1∶80。结果表明:6株单抗与11株鮰爱德华菌黄颡鱼分离株均可以结合,与迟缓爱德华菌、气单胞菌、大肠杆菌、链球菌、弧菌等10株参考菌株均无交叉反应,单抗5D11和1B8可与鮰爱德华菌参考菌株结合。应用免疫荧光和免疫组织化学法检测了鮰爱德华菌对黄颡鱼的侵染规律。结果表明:黄颡鱼经人工注射鮰爱德华菌A86感染6 h后,在其肝、肾、脾、心、肠和胃中检测到了阳性细菌,其中脾脏中最多,心脏中最少;感染24 h后,脑中检测到阳性细菌;30 h后,鳃中显示有阳性信号;54 h后,在眼的外边缘检测到少量阳性细菌。研究结果可为进一步研究鮰爱德华菌在黄颡鱼体内的致病机理提供技术手段及基础,对揭示黄颡鱼"红头病"的发病机制具有重要意义。     

鮰爱德华菌T6SS eivpP基因缺失突变株的构建

为研究鮰爱德华菌Edwardsiella ictaluriⅥ型分泌系统(T6SS)EivpP与其他分泌蛋白之间的相互作用及其在细菌致病过程中的作用机制,在克隆到eivpP基因上、下游同源臂的基础上,采用融合PCR技术制备了eivpP基因缺失用的融合片段,并成功克隆到自杀质粒pDM4内,再将重组自杀质粒转化到大肠杆菌S17-1λ(pir)中,与鮰爱德华菌野生菌株ATCC33202共培养。经同源重组和蔗糖负筛获得鮰爱德华菌eivpP基因缺失突变阳性克隆,经PCR鉴定结果显示,突变株未检测出eivpP基因,即eivpP基因彻底敲除成功。本试验结果可为研究eivpP基因在鮰爱德华菌致病过程中的作用机制提供数据资料,为鮰爱德华菌弱毒疫苗的研发提供理论依据。     

鮰爱德华菌T6SS eivpP基因缺失突变株的构建

为研究鮰爱德华菌Edwardsiella ictaluriⅥ型分泌系统(T6SS)EivpP与其他分泌蛋白之间的相互作用及其在细菌致病过程中的作用机制,在克隆到eivpP基因上、下游同源臂的基础上,采用融合PCR技术制备了eivpP基因缺失用的融合片段,并成功克隆到自杀质粒pDM4内,再将重组自杀质粒转化到大肠杆菌S17-1λ(pir)中,与鮰爱德华菌野生菌株ATCC33202共培养。经同源重组和蔗糖负筛获得鮰爱德华菌eivpP基因缺失突变阳性克隆,经PCR鉴定结果显示,突变株未检测出eivpP基因,即eivpP基因彻底敲除成功。本试验结果可为研究eivpP基因在鮰爱德华菌致病过程中的作用机制提供数据资料,为鮰爱德华菌弱毒疫苗的研发提供理论依据。     

斑点叉尾鮰暴发性海豚链球菌病的研究

于2006—2007连续两年在广西横县、邕江及合浦等网箱养殖的斑点叉尾鮰Ictalurus punctatus中暴发一种流行性传染病,该病波及面广、传染性强,死亡率为30%¹00%。鱼的主要发病症状为:浮头、转圈、狂游,发病后期鱼的单边眼睛浑浊、突出,且全身大面积弥漫性出血。作者先后从症状较为典型的斑点叉尾鮰的脑、肝脏、脾脏和肾脏组织等部位取样,分离到7株代表性菌株(CMS003100%。鱼的主要发病症状为:浮头、转圈、狂游,发病后期鱼的单边眼睛浑浊、突出,且全身大面积弥漫性出血。作者先后从症状较为典型的斑点叉尾鮰的脑、肝脏、脾脏和肾脏组织等部位取样,分离到7株代表性菌株(CMS003^CMS005、CMS009CMS005、CMS009^CMS012)。人工感染试验结果表明,分离菌株对健康斑点叉尾鮰具有很强的致病力,发病症状与自然发病斑点叉尾鮰的症状相同。采用常规形态、生理生化及海豚链球菌Streptococcus iniae特异性PCR诊断和16S rRNA基因序列系统发育进化分析的方法,对分离菌株进行分类鉴定,结果表明,分离的7株细菌均为海豚链球菌。目前,海豚链球菌已成为广西斑点叉尾鮰网箱养殖的高致病性病原菌。     

黄芪皂甙对斑点叉尾鮰非特异性免疫和抗病力的影响

分别向基础饲料中添加黄芪皂甙Astragalus membranaceus0(对照组)、300(低剂量组)、500(中剂量组)、800 mg/kg(高剂量组)制备4种试验饲料,饲喂同一家系的1龄斑点叉尾鮰Ictalures punctatus,饲喂期为60 d。以斑点叉尾鮰血清溶菌酶(LSZ)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)活性以及肝脏、脾、头肾组织中Toll样受体——TLR2、TLR3表达水平为指标,结合嗜水气单胞菌攻毒试验,探讨了不同剂量的黄芪皂甙对斑点叉尾鮰免疫抗病力的影响。结果表明:中、高剂量组斑点叉尾鮰血清中LSZ、AKP活力均显著高于对照组和低剂量组(P<0.05),其中高剂量组血清LSZ活力显著高于其它各组(P<0.05),具有明显的剂量效应;与对照组相比,各试验组斑点叉尾鮰血清中SOD活力有所提高,但无显著性差异(P>0.05);黄芪皂甙可以显著提高TLR3基因在肝脏中的表达量,低、中、高剂量组斑点叉尾鮰肝脏中TLR3基因的表达量均显著高于对照组(P<0.05);高剂量黄芪皂甙可以显著提高TLR3基因在脾、头肾组织中的表达量(P<0.05),呈现较为明显的剂量效应;与对照组相比,黄芪皂甙中、高剂量组斑点叉尾鮰脾中TLR5表达量均有显著性提高(P<0.05);黄芪皂甙对TLR5基因在肝脏、头肾组织中的表达具有剂量效应,中、高剂量黄芪皂甙可以显著提高TLR5基因的表达水平(P<0.05),低剂量组与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。攻毒后试验鱼累积死亡率表明,摄食含有不同剂量的黄芪皂甙饲料以后,斑点叉尾鮰抵抗嗜水气单胞菌感染的能力显著增强,对照组斑点叉尾鮰的最终累积死亡率(61.11%±6.94%)显著高于中、高剂量组(31.11%±3.75%、30.01%±5.34%)(P<0.05)。上述结果说明:特定剂量的黄芪皂甙可以显著提高斑点叉尾鮰机体的非特异性免疫力,黄芪皂甙可以作为一种安全高效的口服免疫增强剂应用于斑点叉尾鮰健康养殖及病害防治。     

养殖大菱鲆感染迟缓爱德华氏菌的分离、毒力基因及ERIC-PCR分析

为了调查辽宁省葫芦岛市养殖患病大菱鲆Scophthalmus maximus病原菌感染情况,选用迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda特异性引物对分离菌株进行PCR鉴定,共分离得到22株迟缓爱德华氏菌。结果表明:迟缓爱德华氏菌毒力基因的PCR扩增显示,22株菌均含有kat B、fim A、gad B、esa V等基因;人工感染试验表明,22株迟缓爱德华氏菌感染并致大菱鲆累积死亡率均为100%;ERIC-PCR结果显示,迟缓爱德华氏菌模式菌株(ATCC15947)与分离株可分为2个基因型,分别标记为Ⅰ和Ⅱ型,其中22株迟缓爱德华氏菌分离株均为Ⅱ型,与ATCC15947菌株为Ⅰ型明显不同。本研究结果为养殖大菱鲆迟缓爱德华氏菌感染的防控提供了依据。     

养殖大菱鲆感染迟缓爱德华氏菌的分离、毒力基因及ERIC-PCR分析

为了调查辽宁省葫芦岛市养殖患病大菱鲆Scophthalmus maximus病原菌感染情况,选用迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda特异性引物对分离菌株进行PCR鉴定,共分离得到22株迟缓爱德华氏菌。结果表明:迟缓爱德华氏菌毒力基因的PCR扩增显示,22株菌均含有kat B、fim A、gad B、esa V等基因;人工感染试验表明,22株迟缓爱德华氏菌感染并致大菱鲆累积死亡率均为100%;ERIC-PCR结果显示,迟缓爱德华氏菌模式菌株(ATCC15947)与分离株可分为2个基因型,分别标记为Ⅰ和Ⅱ型,其中22株迟缓爱德华氏菌分离株均为Ⅱ型,与ATCC15947菌株为Ⅰ型明显不同。本研究结果为养殖大菱鲆迟缓爱德华氏菌感染的防控提供了依据。     

虾夷马粪海胆致病菌强壮弧菌的PCR检测方法

强壮弧菌Vibrio fortis是虾夷马粪海胆Strongylocentrotus intermedius的一种致病菌。为建立强壮弧菌的PCR检测方法,根据强壮弧菌gyrB基因的高度变异区序列设计引物,筛选出特异性强的3对引物VF-6、VF-7及VF-8,分别对强壮弧菌S0907及20株参比菌株进行PCR扩增,结果显示,3对引物均对强壮弧菌扩增出与预期大小一致的目的基因片段且参考菌株无扩增条带。以不同稀释度的菌悬液制备的DNA模板进行PCR扩增,结果显示,3对引物VF-6、VF-7及VF-8可检测的最低细菌浓度分别为4.1×104、4.1×103、4.1×102 cfu/mL;对不同稀释度的细菌DNA模板进行PCR扩增,结果显示,3对引物VF-6、VF-7及VF-8可检测的最低DNA含量分别为1.4、0.14、0.014 pg/μL。试验结果表明:3对引物的特异性均较好,但灵敏度存在差异,其中以VF-8为引物的PCR检测方法最佳;使用以VF-8为引物的PCR检测方法对实验室养殖海胆及其生境样品进行初步检测,健康海胆、养殖海水及投喂的海带均为阴性,而自然海域海水中带有一定量的强壮弧菌。     

迟钝爱德华氏菌Ⅲ型分泌系统基因的克隆及多重PCR检测方法的建立

采用PCR法扩增大菱鲆Scophthalmus maximus出血性败血症病原菌迟钝爱德华氏菌Edwardsiella tardaL-49231菌株Ⅲ型分泌系统(TTSS)的装置蛋白(esaC)、效应蛋白(eseB、eseC、eseD)和调节蛋白(esrA、esrB)6种基因,并将其克隆到载体PMD19-T中分别进行测序;通过优化反应条件,建立一次检出效应蛋白eseB、eseC和eseD 3种基因片段的多重PCR方法;采用所建立的多重PCR方法检测迟钝爱德华氏菌不同菌株(L-49231、GhAn080310、GhAn080313和GhAn080314)、沙门氏菌Salmonella enterica、大肠杆菌Escherichia coli和肠杆菌Enterobacter中效应蛋白基因的存在情况。结果表明:L-49231菌株中存在esaC、eseB、eseC、eseD、esrA和esrB 6种基因片段,大小分别为837、184、934、445、464、458 bp,与GenBank中迟钝爱德华氏菌PPD130/91菌株的这6种基因的同源性分别为99%、97%、99%、99%、99%、98%;通过优化反应条件,在退火温度为54℃,基因eseB、eseC和eseD引物浓度(μmol/L)组合比为5∶10∶2,Mg2+浓度为1.5 mmol/L时,能够得到清晰、稳定且均一的多重PCR产物,并与目的条带分子量一致;采用所建立的多重PCR方法进行检测,迟钝爱德华氏菌L-49231菌株中存在eseB、eseC和eseD 3种基因片段,迟钝爱德华氏菌GhAn080310、GhAn080313、GhAn080314菌株中存在eseB和eseC基因片段,但未检出eseD基因片段;沙门氏菌、大肠杆菌和肠杆菌中均未检出eseB、eseC和eseD基因。表明所建立的多重PCR方法对迟钝爱德华氏菌具有较好的特异性,可检出具有Ⅲ型分泌系统效应蛋白的菌株。