真菌β-葡聚糖受体Dectin-1胞外识别区的克隆和原核表达

目的为探讨真菌β-葡聚糖受体胞外识别区相关基因的分子功能,对小鼠巨噬细胞上的Dectin-1基因进行克隆、原核表达及鉴定分析。方法以小鼠巨噬细胞总RNA为模板,用RT-PCR扩增其Dectin-1基因的细胞外糖识别域,并重组到原核表达载体pET28a(+)中,转入E.coli BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导蛋白表达,通过SDS-PAGE和Western blot对目的蛋白进行检测分析鉴定。结果阳性重组质粒经Nde I和Xho I双酶切得到552 bp和5 369 bp两条片段。重组质粒测序,与GenBank上的相应序列比对完全一致,且输入片段读码框与表达载体读码框吻合。SDS-PAGE检测表达蛋白相对分子质量为22 000;Westernblot检测出特异性阳性信号。该蛋白可识别、绑定酵母多糖。结论本研究成功构建了真菌β-葡聚糖受体胞外识别区基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达相应的蛋白,为进一步探讨该基因在真菌识别中的功能奠定了基础。     

FSHR胞外区基因片段的原核表达及多克隆抗体的制备

目的 构建人卵泡刺激素受体(follicle stimulating hormone receptor,FSHR)胞外区的原核表达载体,并用纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备抗血清.方法 采用RT-PCR克隆人FSHR胞外区,将其克降到原核表达载体pET32a(+),并通过IPTG诱导目的 基因在大肠杆菌中表达,所获得的包涵体蛋白通过Ni-NAT离子交换柱层析纯化重组蛋白,并用SDS-PAGE和蛋白印迹法鉴定.结果 PCR扩增出1 047 bp目的 基因片段,测序证实克隆的基因序列与GenBank中的FSHR序列相符.工程菌pET32 a(+)/FSHR胞外区经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE显示有新生的蛋白表达条带,Mr约为58 000,与预期的一致.其表达形式为不溶性包涵体,此包涵体蛋白通过Ni-NAT离子交换柱层析纯化,纯化的蛋白质经SDS-PAGE分析可见单一条带.该蛋白免疫小鼠制备抗血清,抗体效价为1:12 800,Western blot检测证实该抗体能与目的 蛋白发生特异性结合.结论 获得了人FSHR胞外区融合蛋白及特异性多克隆抗体,为进一步研究FSHR蛋白的功能奠定了基础.     

人TLR2胞外区基因的原核表达及其抗体的制备

目的: 在原核系统中表达人Toll样受体2(TLR2)胞外区基因的融合蛋白并制备多克隆抗体.方法: 应用RT-PCR方法从人外周血单个核细胞中扩增TLR2胞外区基因, 将其克隆到表达载体pET-32a( )上构建重组原核表达质粒, 并在大肠杆菌中诱导表达, 目的融合蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化, 用SDS-PAGE和 Western blot进行鉴定.用纯化的蛋白免疫新西兰白兔, 制备多克隆抗体, 采用Western blot对抗体进行鉴定, 并用ELISA分析抗体活性.结果: 成功构建了pET-32a( )-TLR2重组表达质粒并在大肠杆菌中进行表达, 获得了纯化重组蛋白, 重组蛋白免疫白兔后能够有效地刺激抗体产生, 并具有良好的免疫活性.结论: 成功地获得人TLR2胞外区基因的融合蛋白, 制备的多克隆抗体为进一步研究TLR2胞外区的功能和生物活性奠定基础.     

人BTLA分子胞外区的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

目的:表达并纯化重组人BTLA(hBTLA)分子胞外区,制备和鉴定兔抗hBTLA多克隆抗体,为进一步实验研究奠定基础。方法:采用特异性引物扩增hBTLA胞外功能区DNA,经酶切、连接构建原核表达载体pET28a-hBTLA。将构建的重组表达质粒转化入E.coliBL21(DE3)菌株,采用IPTG诱导表达,Ni-NTA柱亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度。将纯化的目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并对抗体进行纯化、效价测定及特异性鉴定。结果:序列测定证实构建的pET28a-hBTLA重组表达载体含有hBTLA编码序列,其序列比对分析与GenBank中公布序列一致,质粒在E.coli中诱导表达相对分子质量(Mr)为15720的目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析纯化后的目的蛋白达到电泳纯。双向琼脂扩散法检测抗体效价为1∶16,ELISA法检测抗体效价为1∶20 000,Western blot分析显示抗体能特异性结合重组hBTLA蛋白。结论:成功构建了hBTLA蛋白的原核表达载体,获得高纯度的融合蛋白,制备高效价、高特异性的多克隆抗体。     

小鼠巨噬细胞炎性蛋白-1β和Ret蛋白融合基因的克隆、表达与纯化

目的构建小鼠巨噬细胞炎性蛋白-1β（murine macrophage inflammatory protein 1β，mMIP-1β）与原癌基因REF的融合基因并构建融合基因mMIP-REF的原核表达载体，在大肠杆菌中进行表达。方法用RT-PCR方法分别扩增mMIP1β和REF的基因片段，利用分子克隆的方法将这两个片段用铰链GGIPG连接，并克隆到表达载体pET22b中。双酶切且测序正确后转化大肠杆菌BL21，构建表达pET22b mMIP1β-REF／His融合蛋白的菌株。经IPTG诱导表达后，ProBond Resin进行亲和层析纯化，然后纯化产物进行复性及超滤浓缩。结果成功克隆mMIP1β和REF基因片段；成功地构建了pET22b mMIP1β-RET／His融合蛋白原核表达载体，在大肠杆菌中获得表达，并对表达产物进行了纯化，和Western blot鉴定。结论成功制备高纯度mMIP1β-Ret／His融合蛋白，为进一步研究修饰的肿瘤抗原的生物学功能奠定了基础。     

重组大鼠肝再生增强因子原核表达载体构建及多克隆抗体制备

背景:国外有1篇文献报道了肝再生增强因子在中枢神经系统内的分布与表达。由于关于重组大鼠肝再生增强因子蛋白多克隆抗体制备、鉴定及原核表达载体如何构建的相关文献较少,国内对于其在中枢神经系统的研究目前未见报道。目的:利用大肠杆菌BL21表达大鼠肝再生增强因子融合蛋白,并制备和鉴定其多克隆抗体。方法:提取SD大鼠海马组织RNA,构建原核表达重组质粒pET28a-ALR并转化到宿主菌BL21中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达目的融合蛋白,经Ni2+亲和层析纯化回收,4次免疫日本大耳白兔后,心脏取血,吸取血清作为多克隆抗体,以ELISA测定抗体血清效价,Western-blotting检测抗体的特异性和亲和性。观察:①原核表达重组质粒pET28a-ALR构建。②pET28a-ALR重组体酶切鉴定。③ELISA及Western-blotting检测结果。结果与结论:双酶切电泳检测结果显示得到了预期条带,其大小分别为5.3kb和0.4kb,经核苷酸序列分析证明成功构建了pET28a-ALR原核表达载体。成功获得分子质量约为19ku纯化的融合蛋白。ELISA测定显示多克隆抗体效价可达到1∶2000,说明抗体与纯化的重组肝再生增强因子蛋白具有良好的反应性,有较高的效价,可满足实验的要求。通过Western-blotting检测证明该抗体可以特异性识别肝再生增强因子蛋白。实验成功地利用原核表达体系表达了肝再生增强因子融合蛋白,并制备、纯化了抗肝再生增强因子蛋白的多克隆抗体,经鉴定能够满足针对肝再生增强因子免疫印迹检测的实验要求。     

人survivin蛋白的原核表达、纯化及抗原活性鉴定

目的 构建人肿瘤抗原survivin的原核表达载体,优化在大肠杆菌中的表达条件,并对survivin/His融合蛋白进行纯化和抗原活性鉴定.方法 设计针对survivin基因序列的特异引物,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增人survivin全长基因序列(538 bp)克隆至原核表达载体pET28a(+),构建重组表达载体pET28 a-survivin,并将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达survivin/His融合蛋白,并采用Ni亲和层析凝胶纯化重组蛋白.纯化后的重组蛋白经Western blot法、ELISA鉴定其抗原活性.结果 重组表达载体经BamH Ⅰ和HindⅢ鉴定正确;IPTG诱导后经SDS-PAGE分析表明获得了相对分子质量(Mr)24000大小的重组蛋白;纯化后的蛋白纯度达到90％.Western blot法和ELISA检测证实纯化的survivin蛋白能够与特异性抗体发生反应,表明其具有良好的抗原活性.结论 成功构建了原核表达载体pET28 a-survivin,利用大肠杆菌表达系统实现了融合蛋白的可溶性表达并进行纯化,纯化后survivin蛋白经鉴定具备较高的抗原活性.     

人CaMKKβ蛋白的原核表达、纯化及活性测定

目的对原核体系表达的CaMKKβ蛋白体外活性进行探索,为针对CaMKKβ、AMPK药物研发提供科研基础。方法克隆人CaMKKβ基因,建立原核表达载体pET28a-CaMKKβ,将其转化入E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞内,在16℃、0.02 mmol/L IPTG条件下诱导重组表达CaMKKβ蛋白,Ni-NTA纯化6His-CaMKKβ蛋白,并利用Glo?Max Assay方法检测其活性。结果通过基因测序表明pET28a-CaMKKβ质粒构建成功;重组人CaMKKβ蛋白可溶性表达量较高,Ni-NTA纯化6His-CaMKKβ蛋白纯度可达80%以上,活性检测结果表明,大肠杆菌体系内表达的人CaMKKβ蛋白在CaM/Ca2+存在与否情况下,酶活基本一致。结论成功构建原核表达载体pET28a-CaMKKβ,实现重组人CaMKKβ在原核体系内可溶性表达,活性测定表明原核体系内表达的CaMKKβ自主酶活性较强,受CaM/Ca2+影响较小。     

HPV16型E7重组蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

目的制备人乳头瘤病毒(HPV)16型E7原核表达蛋白及其多克隆抗体。方法用PCR方法从宫颈癌组织中扩增HPV16 E7基因,克隆至pET21a(+)载体并构建pET21a(+)/HPV16 E7重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导后表达重组蛋白,用Ni-NTA亲和层析法纯化并经SDS-PAGE及Western blot分析鉴定;纯化的HPV16 E7重组蛋白免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体,用ELISA检测多克隆抗体的效价,并用Western blot法及免疫荧光技术分析多克隆抗体的特异性。结果 HPV16 E7重组蛋白可通过原核表达系统进行表达和纯化;通过兔免疫后可制备特异性的多克隆IgG抗体,效价达1∶30 000;经Western blot法和免疫荧光染色结果证实兔多克隆抗体可特异性识别HPV16 E7蛋白。结论成功进行了HPV16 E7原核表达并制备了HPV16 E7兔多克隆抗体。     

G 试验阳性血清通过干扰 Dectin-1的内在化表达抑制 ROS 依赖性杀伤白念珠菌北大核心CSCD

目的：探讨G试验阳性血清中游离β-1,3-D-葡聚糖干扰人嗜中性粒细胞Dectin-1所介导的氧依赖性杀伤白念珠菌的机制。方法激光共聚焦显微镜检测经β-1,3-D-葡聚糖酶预处理前后的白念珠菌孢子作用下,人嗜中性粒细胞内Dectin-1表达分布的变化及与活性氧簇（ reactive oxy-gen species, ROS）的共定位关系;进一步分析Dectin-1的阻断对白念珠菌诱导下胞内ROS生成的影响;流式细胞术检测G试验阳性血清中游离的β-1,3-D-葡聚糖对白念珠菌诱导下人嗜中性粒细胞内Dectin-1和ROS表达水平的影响。结果在白念珠菌作用下,人嗜中性粒细胞内诱导性表达的Dec-tin-1主要被募集到内吞的孢子表面,且与ROS的产生具有一定的共定位关系。然而,经β-1,3-D-葡聚糖酶预处理后,胞内则未见Dectin-1的明显表达;当Dectin-1被其功能性抗体（5μg/ml）阻断后,白念珠菌诱导胞内ROS的表达与阻断前相比显著降低（LSD-t检验,P＜0．01）;经G试验阳性血清预处理的人嗜中性粒细胞中,白念珠菌诱导下胞内Dectin-1和ROS的表达水平均显著低于单一的白念珠菌作用组（LSD-t检验, P＜0．01）;线性回归分析提示G试验阳性血清中游离β-1,3-D-葡聚糖浓度分别与Dectin-1及ROS表达水平的抑制部分呈显著的剂量依存关系（ Dectin-1,R2＝0．702,P＜0．01;ROS,R2＝0．588,P＜0．01）。结论 G试验阳性血清中的游离β-1,3-D-葡聚糖可通过干扰人嗜中性粒细胞Dectin-1内在化表达的方式抑制ROS依赖性杀伤内吞的白念珠菌孢子。     

结核分枝杆菌小分子热休克蛋白16.3蛋白的原核表达及功能检测

目的进行结核分枝杆菌小分子热休克蛋白MTB Hsp16.3原核表达载体的构建、表达、纯化并初步观察其生物学效应。方法提取临床H37Rv分离株基因组DNA,PCR扩增Hsp16.3基因,将其重组到原核表达载体Pet28a中,构建原核表达载体Pet28a-Hsp16.3,进行双酶切及测序鉴定。将测序正确的重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE检测,同时通过镍柱纯化试剂盒纯化Hsp16.3,测定纯化后蛋白浓度,并进行Western blot法检测。将不同浓度纯化后蛋白作用小鼠腹腔巨噬细胞,实时定量PCR(qRT-PCR)检测巨噬细胞IL-10和IFN-γ的表达,同时设定空白对照组及阳性对照组。结果成功构建重组质粒Pet28a-Hsp16.3,并在E.coli BL21(DE3)中获得成功表达,通过镍柱纯化系统得到纯化Hsp16.3融合蛋白。qRT-PCR检测结果显示,不同浓度纯化后Hsp16.3蛋白作用小鼠腹腔巨噬细胞,可促进IFN-γ的产生而抑制IL-10的产生。结论成功克隆、表达和纯化了MTB Hsp16.3蛋白,Hsp16.3能促进小鼠腹腔巨噬细胞产生IFN-γ,抑制IL-10的产生。     

结核分枝杆菌小分子热休克蛋白16．3蛋白的原核表达及功能检测北大核心CSCD

目的进行结核分枝杆菌小分子热休克蛋白MTB Hsp16.3原核表达载体的构建、表达、纯化并初步观察其生物学效应。方法提取临床H37Rv分离株基因组DNA,PCR扩增Hsp16.3基因,将其重组到原核表达载体Pet28a中,构建原核表达载体Pet28a-Hsp16.3,进行双酶切及测序鉴定。将测序正确的重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE检测,同时通过镍柱纯化试剂盒纯化Hsp16.3,测定纯化后蛋白浓度,并进行Western blot法检测。将不同浓度纯化后蛋白作用小鼠腹腔巨噬细胞,实时定量PCR(qRT-PCR)检测巨噬细胞IL-10和IFN-γ的表达,同时设定空白对照组及阳性对照组。结果成功构建重组质粒Pet28a-Hsp16.3,并在E.coli BL21(DE3)中获得成功表达,通过镍柱纯化系统得到纯化Hsp16.3融合蛋白。qRT-PCR检测结果显示,不同浓度纯化后Hsp16.3蛋白作用小鼠腹腔巨噬细胞,可促进IFN-γ的产生而抑制IL-10的产生。结论成功克隆、表达和纯化了MTB Hsp16.3蛋白,Hsp16.3能促进小鼠腹腔巨噬细胞产生IFN-γ,抑制IL-10的产生。     

H37Rv结核分枝杆菌蛋白脯氨酸-谷氨酸8(PE8)的表达及其兔多克隆抗体制备

目的克隆Rv1040c结核分枝杆菌脯氨酸-谷氨酸8(PE8)基因、构建pET28a-PE8重组载体和表达纯化PE8蛋白,制备抗PE8多克隆抗体。方法利用重组克隆技术,将PE8基因克隆至原核表达载体pET28a,测序鉴定后,转化至大肠杆菌BL21(DE3),用0.5 mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达、稀释复性与纯化。用纯化PE8蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,间接ELISA和Western blot法进行效价及特异性鉴定。结果成功构建pET28a-PE8原核表达载体, ITPG诱导后PE8蛋白在大肠杆菌主要以包涵体的形式表达,复性后纯化PE8蛋白纯度达90%,纯化多克隆抗体效价为1∶430 080以上,能与PE8蛋白发生特异性反应。结论大肠杆菌表达的PE8重组蛋白免疫新西兰大白兔获得高效价的多克隆抗体。     

人可溶性DC-SIGN的原核表达及鉴定

目的构建可溶性DC-SIGN（sDC-SIGN）原核表达载体,获得不含标签蛋白的sDC-SIGN蛋白。方法采用PCR方法,从含人DC-SIGNcDNA的重组质粒pGM-DC-SIGN扩增DC-SIGN胞外区基因片段,插入原核表达载体pET17b,构建重组表达载体pET17b-sDC-SIGN,经酶切图谱和测序鉴定,转入E.coliBL21（DE3）诱导表达蛋白,用抗人DC-SIGN抗体-Sepharose4B亲和层系纯化表达产物,以SDS-PAGE和Westernblot鉴定。结果从重组质粒pGM-DC-SIGN扩增获得1300bp目的基因片段,构建重组表达质粒pET17b-sDC-SIGN,其酶切图谱和序列与预期相符。纯化表达产物sDC-SIGN,鉴定其分子质量为38000,Westernbolt证明其可与抗人DC-SIGN抗体特异性结合。结论获得了能高效表达重组人sDC-SIGN的大肠杆菌菌株和不带任何标签蛋白的sDC-SIGN蛋白,为深入研究sDC-SIGN的功能奠定了基础。     

LIGHT基因的克隆及其可溶性表达

目的　克隆LIGHT基因 ,构建含有人LIGHT基因的表达载体 ,诱导其在大肠杆菌中可溶性表达 ,并对表达的LIGHT蛋白的生物学活性进行检测。方法　从人的外周血单个核细胞中克隆LIGHT全长cDNA及其胞外区片段 ,并将其胞外区片段亚克隆至原核表达载体pET 11a中 ,筛选阳性重组质粒pET LIGHT ,以IPTG诱导其可溶性表达 ,并以SDS PAGE和Westernblot检测进行分析。表达的蛋白初步纯化后 ,进行生物学活性分析。结果　RT PCR扩增出了LIGHT全长 72 3bp的cDNA。SDS PAGE和Westernblot分析证实重组pET LIGHT质粒可表达出相对分子质量 (Mr)为 19× 10 3的蛋白。可溶性LIGHT重组蛋白可共刺激T细胞的增殖及诱导IFN γ的产生。结论　本实验成功地将LIGHT胞外区片段在大肠杆菌中进行表达 ,表达的蛋白具有生物学功能 ,这为进一步的LIGHT基因的功能研究打下了基础     

大鼠钙结合蛋白S100A9基因克隆、表达及纯化研究

目的构建大鼠钙结合蛋白S100A9的原核表达质粒并获得纯化重组蛋白。方法根据大鼠S100A9基因mRNA序列,设计PCR引物,常规扩增后重组连入原核表达载体pET32a,并进行序列测定。利用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)和不同温度诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定结果,并亲和层析纯化重组蛋白。结果 PCR扩增获得的条带与预期的DNA表达片段大小一致,克隆构建了pET-32a-S100A9原核表达载体,测序结果与预期完全一致,经亲和层析纯化获得毫克级纯化重组蛋白,并发现该蛋白在21℃有比较强的表达。结论为进一步探讨S100A9蛋白生物学功能奠定基础。     

人SUMO-1基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备与鉴定

目的 构建人SUMO-1基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备兔抗人SUMO-1抗血清.方法 从质粒pcDNA-HA-SUMO1-GG中用PCR方法克隆到编码人SUMO-1 N端97个氨基酸的基因片段,构建了SUMO-1原核表达载体pET41a(+)-SUMO1,转化大肠杆菌B121(DE3)pLysS,IPTG诱导蛋白表达并利用GST亲和层析柱进行纯化,以纯化后的融合蛋白GST-SUMO1为抗原免疫家兔,获得抗血清.Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清.结果 成功构建原核表达载体,纯化到融合蛋白GST-SUMO1,用纯化的融合蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功.结论 成功获得了人SUMO-1多克隆抗体,为进一步研究人SUMO-1蛋白的功能奠定了基础.     

脆性X智力低下蛋白的克隆表达与纯化

目的 探讨脆性X智力低下蛋白(FMRP)的克隆表达与纯化条件.方法 用分子克隆的方法构建重组质粒pET22b( )-FMR1,并将其转入原核表达菌株E.coli BL21(DE3)中诱导表达;用固化Ni2 吸收色谱纯化重组FMRP,Western-blot鉴定并将纯化得到的蛋白与已知的RNA片段进行结合反应.结果 成功构建了重组表达质粒pET22b( )-FMR1,在E.coli BL21(DE)中表达出相对分子质量约79 000的蛋白;该蛋白为FMRP,且可与特定RNA相互作用.结论 在原核系统中表达得到了纯度和活性都较为理想的FMRP蛋白,为相关功能性研究奠定了基础.     

提高树突状细胞腺病毒感染效率的融合蛋白的表达及活性鉴定

目的构建表达靶向树突状细胞融合蛋白CT40L的原核表达载体,在大肠杆菌中表达,并对CT40L融合蛋白进行纯化鉴定及功能验证。方法从GenBank上查找柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)、T4噬菌体fibritin和小鼠CD40L的基因序列,并将其主要功能区域连接形成拼接序列;序列进行原核表达密码子优化后将其克隆至原核表达载体pET42a(+),构建重组表达载体pET42a-CT40L,并将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达CT40L/GST融合蛋白,并采用GST琼脂糖凝胶纯化重组蛋白。纯化后的重组蛋白经Western blot法、间接ELISA鉴定其免疫活性。结果重组表达载体经NcoⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定正确;IPTG诱导后经SDS-PAGE分析表明获得了相对分子质量(Mr)78 000大小的重组蛋白;纯化后的蛋白纯度达到90%。Western blot法和ELISA检测证实纯化的CT40L分子能够与特异性抗体及相应受体发生反应,表明该融合蛋白具有良好的免疫学活性。结论成功构建了原核表达载体pET42a-CT40L,利用大肠杆菌表达系统实现了融合分子的可溶性表达,纯化后CT40L融合蛋白经检测具备较高的免疫学活性。