基因芯片——器官移植配型的新策略

在影响移植物长期生存率的因素中，组织型是重要因素之一，随着分子生物学的发展。HLA抗原的分型方法逐步由血清学、细胞学水平向分子水平过渡，分型的效果也逐渐达到特异，准确，快速、大量的目标。本文回顾了HLA分型方法的发展过程，评价各种DNA分型方法的优缺点，重点对基因芯片用于HLA分型的相关问题作了介绍。     

基因芯片与麻醉学

基因芯片技术是90年代兴起的一项前沿生物技术,它可以将生物学中许多不连续的分析过程,移植到固相的介质芯片上,并使其连续化和微型化。这是对传统生物技术如检测、DNA杂交、分型和测序技术等的重大创新和突破。基因芯片技术一经出现以后,就表现出强大的生命力和广阔的应用前景,目前已经在诸多医学领域得到了广泛的应用并取得了令人鼓舞的成果。本文扼要介绍基因芯片的概况及其在麻醉学中的应用前景。     

基因芯片与麻醉学

基因芯片技术是90年代兴起的一项前沿生物技术，它可以将生物学中许多不连续的分析过程，移植到固相的介质芯片上，并使其连续化和微型化。这是对传统生物技术如检测、DNA杂交、分型和测序技术等的重大创新和突破，基因芯片技术一经出现以后，就表现出强大的生命力和广阔的应用前景，目前已经在诸多医学领域得到了广泛的应用并取得了令人鼓舞的成果。本文扼要介绍基因芯片的概况及其在麻醉学中的应用前景。     

寡核苷酸DNA微阵列用于人类白细胞抗原-DR53组基因分型的研究

目的 建立用于人类白细胞抗原(HLA)-DR53组基因分型的寡核苷酸DNA微阵列。方法 根据中国汉族人群HLA-DRB等位基因的频率设计特异性的分型探针,制作寡核苷酸DNA微阵列。通过组间特异引物扩增基因组DR153相应区段的DNA,扩增中用Cy5-dCTP荧光标记,扩增标记后的产物与芯片的探针杂交,通过杂交产生的荧光信号及分布格局确定样品的基因亚型。分型结果用标准DNA和序列特异寡核苷酸探针杂交验证。结果 经寡核苷酸DNA微阵列分型,111份样本中共检出DR53组位点72个,其中DR9 34个,DR4 25个,DR7 13个,无一例假阳性或假阴性,重复率和准确率均达到100％。检测总耗时约5h。结论 寡核苷酸DNA微阵列用于HLA-DR53组基因分型具有高分辨率、高特异性和简单快速的特点,适合于临床应用。     

发囊基因芯片法和血样单克隆抗体法在HLA-Ⅱ类分型中的比较研究

目的 同步双盲法研究单克隆抗体法和基因芯片法在HLA分型中的准确性、重复性和实用性。方法 研究样本46份，单克隆抗体法采用一步法单抗分型技术，基因芯片法采用寡核苷酸芯片技术。结果 46份标本的单克隆抗体法和基因芯片法分型成功，对有差异的结果进行基因芯片法复查，重复率100％。单克隆抗体法耗时1.5h，基因芯片法耗时3.5h。基因芯片法的漏检率低于单克隆抗体法。两种方法主要在对DR2(DR15，DR16)的检测结果上不一致。结论 目前HLA-Ⅱ类抗原的分型，尤其是临床大样本分型，可以采用单克隆抗体分型技术进行快速分型。对于要求精细配型的骨髓移植，应该采用基因芯片分型或其他DNA分型技术。对于单克隆抗体分型结果可疑的样本应用基因芯片分型确认。     

基因芯片数据挖掘与肿瘤分子分型研究

当前．飞速发展的基因组、转录组、蛋白质组、代谢组等“组学”技术产生了海量研究数据。以基因表达谱芯片为例,常用商用芯片的探针数约为43000个,加上科学研究中对样本数量与重复次数的要求,一次实验实际产生的数据量异常巨大。对于“组学”研究产生数据的意义已非人眼所能识别,需引入大规模计算机程序加以处理。一般而言,单个的基因芯片研究往往是实验者根据原有研究目的分析了海量数据中的一部分信息．尚有大量有价值的信息湮没于数据中。鉴于此,在庞大数据中搜索和发现其他被忽略的重要信息．极为必要。     

基因芯片在胆管癌转移相关基因差异性表达应用研究

胆管癌是一种隐匿性进展的恶性肿瘤，生长缓慢，可较早发生胆管周围及肝内转移，切除率低。胆管癌转移是多步骤、多种因素参与的极复杂过程，涉及多个基因表达谱改变，参与细胞周期调节、凋亡、血管生成、黏附、迁移、侵袭、免疫应答、信号转导等。利用基因芯片高通量、自动化优点，对来源于不同个体、不同周期、不同分化阶段转移瘤细胞DNA进行检测，     

快速盐析法提取DNA在HLA基因分型中的应用

采用快速盐析方法提取人类有核细胞ＤＳＡ，并在临床肾移植的ＨＬＡ基因配型中应用。通过对２１０份不同组织来源的样本与标准酚氯仿法同步对比研究显示：快速盐析法提取模板ＤＮＡ，无污染和有害作用；操作简单、快速，总耗时１１０分钟；方法稳定可靠，无一例失败；所获ＤＮＡ质量好，纯度高，达到酚氯仿法所获ＤＮＡ的水平；用于临床肾移植基因型均获成功，与酚氯仿法结果完全相同。证实该法提取的ＤＮＡ适用于临床器官移植基因水     

基因芯片技术在肾移植组织配型中的应用

目的比较基因芯片和特异性聚合酶链反应(PCRSSP)两种HLADR分型方法,探讨适用于肾移植供、受者分型的新方法。方法对60份肾移植供、受者的DNA样本同时采用基因芯片和PCRSSP进行HLADR分型,并进行分析比较。结果60例样本的两种分型方法结果完全一致56份,相同率达93%。结果不相同的样本共4份,经第三方验证,其中基因芯片分型漏1个位点2例、1个位点误判1例,PCRSSP分型漏1个位点1例。其中20份样本作了重复实验,其重复率达到96%。结论基因芯片用于HLA分型具有灵敏度高、效率高、标准化程度高的优点,是其它分型方法所无可比拟的,具有广阔的应用前景。     

肿瘤表达谱基因芯片筛选胆囊癌肿瘤相关基因的初步研究

我们利用表达谱芯片筛选胆囊癌相关基因组，并将筛选出的部分相关基因进行分类和生物信息学分析，选其外显子区进行PCR扩增、测序明确突变情况。为开发胆囊癌相关cDNA芯片提供实验依据，以促进胆囊癌的早期诊断水平。     

PCR－SSP快速HLA－DR52组基因分型与临床应用

采用顺序特异引物聚合酶链反应技术（ＰＣＲ－ＳＳＰ）对６５例肾移植供受者ＨＬＡ－ＤＲ５２组基因分型，同时与血清学方法对比研究。显示血清学方法错误率高达３６％；而ＰＣＲ－ＳＳＰ分型全部成功，无一例假阳性和假阴性；重复性１００％，总耗时５小时。分型结果经标准细胞株、限制性内切酶分析和寡核苷酸探针杂交等确证，特异性达１００％。结果表明：ＰＣＲ－ＳＳＰ用于ＤＲ５２组基因分型，快速、特异，结果可靠，适合于临床应用。     

采用顺序特异引物聚合酶链反应技术行快速HLA－DR53组基因配型

采用顺序特异引物聚合酶链反应技术（ＰＣＲ－ＳＳＰ）对６５例肾移植供受者的ＨＬＡ－ＤＲ５３组（ＤＲ４、ＤＲ７、ＤＲ９）进行基因水平分型。结果本组所有位点均分型成功，无一例假阳性和假阴性；每位点重复１０次，重复性１００％；总耗时５小时。分型结果经标准细胞株、限制性内切酶分析和寡核苷酸探针杂交予以确证，特异性１００％。显示本方法用于ＨＬＡ－ＤＲ５３组基因分型具有高分辨率、高特异性和简捷快速的特点，适合于临床应用。     

DNA芯片技术检测HLA-DR1,DR51组基因型

目的 采用DNA芯片技术对HLA—DRl，DR51组基因分型。方法 根据编码HLA—DR1，DR51组抗原等位基因序列设计特异分型探针，制作DNA分型芯片。通过组间特异引物扩增基因组相应区段DNA，扩增中用Cy5-dCTP荧光标记，扩增标记后的产物与芯片探针杂交，通过杂交产生的荧光信号及分布格局确定样品基因亚型。分型结果用标准DNA和PCR—SSO验证。结果130份样本共检出HLA-DR1，DR51组位点34个，包括18个：DR15，8个DR16，6个：DR10，2个DR1，无假阳性或假阴性，准确率和重复率均达100％。检测总耗时约3．5h。结论 DNA芯片用于HLA-DR1、DR51组基因分型具有高分辨度、高特异性和简单快速的优点，适于器官移植临床应用。     

PCR－SSP快速HLA－DR2、DR7、DR9基因配型研究

采用顺序特异性引物聚合酶链式反应（ＰＣＲ－ＳＳＰ）ＤＮＡ分型技术，首次对３５例肾移植供受者和４份标准ＤＮＡ进行ＨＬＡ－ＤＲ２、ＤＲ７、ＤＲ９基因配型。ＰＣＲ扩增条件为９４℃变性３０秒，６０℃退火５０秒，７２℃延伸４０秒，５个循环后降低退火温度至５８℃共３４个循环，即可在凝胶电泳上出现清晰可辨的特异性产物和阳性对照条带。经分子量标志初步鉴定，标准ＤＮＡ和地高辛标记的特异性探针Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交确定性鉴定证实。实验结果稳定可靠，特异性和重复性达１００％，无假阳性和假阴性，耗时５小时。显示ＰＣＲ－ＳＳＰ基因配型具有高分辨度、高特异性和简捷快速的特点，适合于临床应用．     

HLA-DR antigen and HLA-DRB1 genotyping with nonobstructive azoospermia in Japan.

We previously reported that the HLA-A33, -B13, and -B44 antigens, which are major histocompatibility complex class I molecules, are involved in the susceptibility of nonobstructive azoospermia in Japanese men. In this report, HLA-DR antigens, which are class II molecules, are investigated by advanced DNA typing in addition to classical serological typing to study a more complex genotype of HLA-DRB2. Genotyping was performed by the polymerase chain reaction-sequence-specific primer (PCR-SSP) method of analysis and/or by a commercial rapid assay based on the polymerase chain reaction (PCR), followed by reverse dot-blot hybridization of PCR products (the Inno-LiPA assay). The allele frequencies of the HLA-DR13 antigen and the -DRB1*1302 allele were significantly higher in Japanese subjects with nonobstructive azoospermia compared with a control group of healthy Japanese men, and these alleles were associated with relative risks for nonobstructive azoospermia of 4.2 and 4.9, respectively. If we suppose this strong linkage to both HLA class I and II antigens is due to linkage disequilibrium, it may suggest the existence of a novel gene involved in spermatogenesis in the class III region, which is located between the class I and class II regions and contains several genes other than HLA.     

Negative regulation of HLA-DR expression on endothelial cells by anti-blood group A/B antibody ligation and mTOR inhibition

Donor-specific antibody (DSA), particularly against HLA class II, is a major cause of chronic antibody-mediated rejection (CAMR) after transplantation, although ABO-incompatible kidney transplantation has recently demonstrated favorable graft outcomes. The condition of no injury even in the presence of anti-donor antibody has been referred to as “accommodation”, which would be one of the key factors for successful long-term graft survival. The purpose of this study was to analyze the beneficial effect of anti-blood group A/B antibody ligation on endothelial cells against HLA-DR antibody-mediated, complement-dependent cytotoxicity (CDC). Blood group A/B-expressing endothelial cells EA.hy926 or Human Umbilical Vein Endothelia Cells (HUVEC) were incubated with IFNγ in the presence or absence of anti-blood group A/B antibody or mTOR inhibitor (mTOR-i) for 48 h. The effects on signaling pathway, HLA expression, complement regulatory factors, and CDC were investigated. Expression of HLA-DR on EA.hy926 or HUVEC were successfully elicited by IFNγ treatment, although little or no expression was observed in quiescent cells. Pre-incubation with anti-blood group A/B antibody had resistance to HLA-DR antibody-mediated CDC against IFNγ-treated cells in a concentration-dependent manner. This finding was ascribed to decreased expression of HLA-DR by post-translational regulation and increased expression of CD55/59, which was related to ERK and mTOR pathway inhibition. mTOR-i also inhibited HLA-DR expression by itself. Furthermore, the combination of mTOR-I and anti-blood group A/B ligation had an additive effect in preventing HLA-DR antibody-mediated CDC. Anti-blood group A/B antibody might play a preventive role in CAMR. Inhibition of the ERK and mTOR pathways may contribute to the development of a novel treatment in the maintenance period after transplantation.     

应用高密度寡核苷酸(Oligo)基因芯片筛选胶质瘤相关基因

目的应用高密度寡核苷酸（Oligo）基因芯片技术筛选胶质瘤相关基因。方法抽提5例胶质瘤和10例正常脑组织的总RNA并逆转录为cDNA，其中Cy5、Cy3的dNTP分别掺人胶质瘤和正常脑组织的cDNA，混合后杂交含22000个人类基因人类高密度Oligo基因芯片，经过洗片和扫描，获得荧光信号图像并用计算机分析，随机抽取3种差异表达基因用PCR验证它们胶质瘤和正常脑组织中的差异表达。结果从22000条基因中筛选出差异表达基因242条，其中123条表达上调，119条表达下调，包括细胞周期蛋白、细胞凋亡、细胞骨架和运动蛋白等相关基因。结论基因芯片技术的胶质瘤基因表达谱分析能够高通量筛选胶质瘤相关基因，并高效对基因功能进行研究，有助于认识肿瘤发病机制。