表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的基因疫苗的免疫学特性

目的测定表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的两种重组质粒AZ-pcDNA3-EF和EZ-pcDNA3-AF在小鼠体内诱导的免疫应答及保护力。方法50只BALB/c小鼠随机分为5组(每组10只),将表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的两种重组质粒AZ-pcDNA3-EF和EZ-pcDNA3-AF分别免疫小鼠3次,每次间隔2周,同时设卡介苗(BCG)免疫组、空载体质粒免疫组和生理盐水对照组。最后一次免疫结束后,每组取5只小鼠血清,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测特异性抗体的滴度,并分离小鼠的脾淋巴细胞,并在体外用结核分枝杆菌(MTB)培养滤液蛋白(cu lture filtrate prote in,CFP)刺激,测定脾淋巴细胞增殖指数和γ干扰素(IFN-γ)水平。用1 m l含1×105克隆形成单位(CFU)的MTB毒株H37Rv经尾静脉感染其余每组5只BALB/c小鼠,4周后计数脾脏细菌负荷数。结果质粒AZ-pcDNA3-EF和EZ-pcDNA3-AF免疫小鼠血清的特异性抗体滴度分别为1∶1 000和1∶1 500。其脾淋巴细胞刺激指数分别为2.2和2.4,而生理盐水对照组和空载体质粒免疫组的刺激指数只有0.9和1.1;脾淋巴细胞悬液中诱发的IFN-γ分别为(5.48±0.38)ng/m l和(5.76±0.51)ng/m l,显著高于生理盐水对照组和空载体质粒免疫组(P<0.05),但与BCG免疫组的(5.55±0.31)ng/m l比较差异无统计学意义。结核毒株攻击后,与空载体质粒免疫组相比,质粒AZ-pcDNA3-EF和EZ-pcDNA3-AF免疫的BALB/c小鼠其抗MTB在脾脏中增殖有显著作用,3组脾脏细菌负荷对数值(lg,CFU/g)分别为6.08±0.25、4.63±0.11、4.50±0.32,但不及BCG免疫组的4.09±0.27。结论表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的基因疫苗在小鼠体内诱导的IFN-γ水平与BCG相当,其保护力有待进一步提高。     

分枝杆菌胞壁融合表达Ag85B-ESAT-6穿梭质粒的构建

目的　构建E coli BCG(BacilleCalmette Guerin)穿梭载体 ,在母牛分枝杆菌细胞壁融合表达结核分枝杆菌 (MTB)的分泌蛋白Ag85B ESAT 6。方法　用聚合酶链反应 (PCR)从MTB毒株H3 7Rv基因中扩增出结核分枝杆菌 190 0 0抗原 ( 19 ss)胞壁区及其上游调控元件基因 ,克隆入E coli BCG穿梭载体 pOLYG中 ,构建表达蛋白能嵌入细胞壁中的E coli BCG穿梭载体。用间接免疫荧光染色法观察该载体携带所构建的结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B和ESAT 6基因在母牛分枝杆菌宿主中的融合表达。结果　经测序证实所克隆的 19 ss基因序列正确 ,所构建的E coli BCG穿梭载体 (pCW )能完成在大肠杆菌和母牛分枝杆菌细胞之间的穿梭 ,经免疫荧光检查外源基因Ag85B ESAT 6可融合表达于分枝杆菌宿主表面。 结论　本方法可成功构建能够在分枝杆菌胞壁融合表达MTB分泌蛋白Ag85B ESAT 6的E coli BCG穿梭质粒     

结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6-CFP10的融合表达及纯化

目的在原核表达系统融合表达结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶ESAT-6和培养滤液蛋白CFP10的融合蛋白(rE6C)并纯化,测定抗原性和特异性。方法用将一个柔性的氨基酸“接头”插入原核表达载体pET32c(﹢)中,构建pET32c(﹢)-linker。PCR法扩增ESAT-6、CFP10基因。将ESAT-6克隆入改建的载体pET32c(﹢)的linker前,CFP10克隆入linker后,构建E6C融合基因,转化大肠杆菌XL1-blue,抽提质粒,酶切鉴定;在大肠杆菌BL21中表达,纯化rE6C蛋白,通过酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测其抗原性和特异性。结果重组质粒pET32c(﹢)-ESAT-6-CFP10靶基因的测序结果与预计序列完全一致。携带重组质粒的菌株经诱导产生高水平的表达产物,纯化的表达产物具备较高的纯度、抗原性和特异性。结论pET32c(﹢)-ESAT-6-CFP10质粒在BL21菌中能高效表达,rE6C融合蛋白具有良好的抗原性和特异性,有望用于结核分枝杆菌感染的临床诊断。     

结核分枝杆菌融合基因疫苗的研究进展

BCG在不同地区的免疫保护作用差异很大（0％～80％），加上耐多药菌株的出现，寻找比BCG免疫保护效果更好的疫苗成为当今抗结核疫苗研究的当务之急。结核病DNA疫苗中，单一抗原免疫的免疫保护作用不及两种抗原混合免疫，但是DNA混合免疫又有费用高、副作用多和难推广等缺点，而融合基因疫苗则可克服混合免疫的不足。     

结核分枝杆菌Ag85A DNA疫苗抗结核作用的研究

结核病是由Mtb引起的一种呼吸道传染病,全球结核病疫情仍然十分严峻,而卡介苗预防结核病的效果并不理想,研究新型结核病疫苗已成为国内外结核病研究的热点之一。将本课题组自1998年至今研究Mtb Ag85A DNA疫苗的免疫原性、治疗效果进行综合与概述,结果表明Mtb Ag85A DNA疫苗可诱导小鼠体液免疫和Th1型细胞免疫应答,可减少小鼠组织中的Mtb尤其是耐多药Mtb的数目,该疫苗与常规化疗联合不仅可提高机体免疫力,并可有效地杀灭或抑制Mtb,从而提高化疗效果。     

结核分枝杆菌Ag85A／ESAT-6嵌合型质粒DNA疫苗和抗结核药物联合治疗小鼠耐药结核病的效果研究

目的研究结核分枝杆菌Ag85A／ESAT-6嵌合型质粒DNA疫苗和抗结核药物联合治疗小鼠耐药结核病的效果。方法用结核分枝杆菌高耐利福平低耐异烟肼临床分离株HB240尾静脉注射BALB／c小鼠1个月后，将小鼠随机分成2组，第1组用利福平（RFP）、异烟肼（INH）治疗12周，第2组用RFP、INH和结核分枝杆菌Ag85A／ESAT-6嵌合型质粒DNA疫苗（免疫5次）联合治疗12周；治疗结束后4和8周，分别取肺、肝和脾观察病理改变、称取质量、作菌落计数。结果治疗结束后4和8周，第2组小鼠体质量均超过第1组，但无显著性差异（P〉0．05）。治疗结束后4周，第2组肺、脾脏指数（0．017，0．011）均略低于第1组（0，020，0，012）（P〉0．05）；治疗结束后8周，第2组肺、肝脏指数（O．021，0．047）均略低于第1组（0．022，0．048）（P〉0．05）；而第2组脾脏指数（0．008）显著低于第1组（0．012）（P〈0．05）。治疗结束后4周，第2组有4例脾脏未见明显病变，第1组仅1例脾脏未见明显病变；治疗结束后8周，第2组有1例肺门淋巴结肿大，而第1组有3例；第2组有5例脾脏未见明显病变，第1组仅2例脾脏未见明显病变。治疗结束后4周，第2组肺菌落计数和脾菌落计数比第1组显著减少，分别减少70％和80％。结论DNA疫苗和抗结核药物联合治疗小鼠耐药结核病疗效高于单纯化疗。     

结核分枝杆菌Ag85复合物相关疫苗研究进展

目前全球TB疫情呈上升趋势,而惟一使用的结核病疫苗--BCG的保护效力大不如前,因此新型结核病疫苗的开发迫在眉睫。利用Ag85复合物在Mtb感染中具有明显保护性效应为基础而研制的疫苗受到广泛关注。笔者对Ag85复合物相关亚单位疫苗、重组BCG和基因疫苗研究取得的成果进行综述,结果表明少数Ag85复合物相关疫苗的保护作用超过BCG,某些新疫苗作为初种疫苗给予新生儿、儿童和青少年接种是安全、有效的;作为增强剂给予成人接种,可以提高机体免疫力;某些疫苗与化疗药物联合可以提高机体的免疫力,提高化疗效果,但能否取代BCG尚需大规模临床实验证实。     

结核分枝杆菌MPT64蛋白的表达，纯化及初步应用

目的 获得重组MPT64蛋白,研究其特性,评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法 应用基因工程技术表达、纯化MPT64蛋白,通过Western blotting分析其抗原性。分别以结核分枝杆菌PPD或纯化的rMPT64蛋白为抗原,通过ELISA方法及结核病一步法检测血清中抗结核抗体。结果 重组质粒pE T15b-MPT64测序表达除83位密码子由CCA突变为CCG外,其余密码子均与报道的相同,但其氨基酸序列无变化。它在大肠杆菌BL21（DE3）细胞内以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的20－30％,分子量约26kDa,Western blotting分析它与抗结核分要支杆菌多克隆抗体具有良好的免疫反应性。纯化后的rMPT64样品经SDS－PAGE和光密度扫描分析表明其纯度约为80％左右,每100ml培养菌可获得10mg左右的重组蛋白。以33例正常人血清的OD值＋2S为正常界限值,PDD的特异性和敏感性分别为 94％（31／33）、63.7%(21/33)、66.7%;rMPT64纯化蛋白分别为94%(31/33)、30.3(10/33);一步法分别为88％（29／33）。结论 pET15b－MPT64大肠杆菌工程菌能以包涵体形式高效表表重组 MPT64蛋白,该蛋白具有较高的抗性和免疫反应性。rMPT64纯化蛋白有可能成为结核病血清学诊断的组合抗原之一。     

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达与纯化

目的构建结核分枝杆菌esat-6基因原核表达载体,使其在大肠杆菌中表达融合重组蛋白,并纯化。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出esat-6基因片段,克隆至pMD18-T载体,PCR筛选阳性克隆并测序;用限制性内切酶消化后,目的片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2,构建pGEX-esat-6重组质粒,将其转化入大肠杆菌JM109;PCR和双酶切鉴定转化菌落;将阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达;用谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法纯化融合蛋白。结果PCR扩增出esat-6 288bp的基因,克隆到pMD18-T载体中,经测序与GenBank中序列一致;随后亚克隆到表达载体pGEX-4T-2构建重组表达质粒,在JM109中表达了ESAT-6融合蛋白,表达的蛋白能被GST免疫血清识别;通过亲和层析纯化获得的蛋白能被结核病人血清识别。结论成功构建esat-6重组表达质粒,该质粒在JM109中表达ESAT-6融合蛋白,并获得较纯的蛋白。     

结核分枝杆菌抗原融合蛋白Ag85B-ESAT6和Rv2031c-Rv2626c重组腺病毒的构建及鉴定

目的 构建表达结核分枝杆菌多阶段抗原融合蛋白Ag85B-ESAT6(AE)和Rv2031c-Rv2626c(R2)的重组腺病毒,为其用于结核病新型疫苗的研究奠定基础.方法 体外合成人延长因子1α(EF1α)启动子DNA序列,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建含有CMV、EF1α双启动子的腺病毒穿...     

分泌表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的重组卡介苗菌株的筛选

目的筛选获得分泌表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的重组卡介苗(BCG)菌株。方法采用多聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌毒株H37Rv中扩增出热休克蛋白60(Hsp60)基因及其信号肽序列α-ss，将测序正确的hsp60和α-ss基因分别克隆人大肠杆菌(E.coli．)-BCG穿梭载体pOLYG中，构建分枝杆菌分泌表达载体pDE22，按相应的酶切位点将ag85b和esat6按照不同的连接方式联合克隆入pDE22载体，分别命名为pDE22-Ag85B-ESAT6和pDE22-ESAT6-Ag85B，将纯化的重组质粒电穿入BCG，经潮霉素抗性筛选和PCR的方法鉴定出含目的基因的重组BCG阳性克隆。收集重组BCG的培养上清液，经浓缩和透析后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和固相化蛋白质免疫学测定(Western-blot法)分析。结果两株重组：BCG菌株的培养上清液分泌表达相对分子质量约37000的蛋白，且分别可与抗Ag85B和抗ESAT6蛋白免疫小鼠的血清有相应的结合条带。结论分泌表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的重组BCG菌株构建成功，有望为结核病的预防提供有效的疫苗。     

结核杆菌Ag85A DNA疫苗在小鼠体内的免疫效应比较

目的探索增强结核杆菌DNA疫苗有效性的新方法，为研制并开发新一代高效结核杆菌DNA疫苗奠定基础。方法分别构建结核杆菌Ag85A抗原基因真核表达质粒及其与小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的真核嵌合表达质粒，体外转染COS7细胞检测两种重组质粒的表达活性后，将其分别用作DNA疫苗给BALB／c小鼠肌内注射，检测小鼠体内特异性体液免疫和细胞免疫应答相关指标，同时进行动物免疫保护性实验，比较分析两种DNA疫苗在小鼠体内的免疫效应。结果结核杆菌Ag85A抗原蛋白基因与小鼠粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子的嵌合DNA疫苗在小鼠体内的免疫原性明显强于Ag85A抗原基因非嵌合DNA疫苗，但两种DNA疫苗的免疫保护性无明显差异。结论粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子与结核杆菌免疫保护性抗原基因嵌合DNA疫苗能显著增强结核病DNA疫苗的免疫原性。     

结核分支杆菌Ag85B DNA疫苗的构建及其免疫作用的研究

目的 研究pcDNA3-Ag85B质粒DNA疫苗的免疫原性及其诱生细胞免疫应答的作用。方法 将结核分支杆菌Ag85B基因插入载体pcDNA3中,制备pcDNA3-Ag85B DNA疫苗。分别以生理盐水、pcDNA3及pcDNA3-Ag85B免疫BALB／c小鼠,检测小鼠抗Ag85B抗体水平（ELISA）和体外循异抗原刺激诱导的免疫小鼠脾细胞IL－2、IL－4、IL－10、IFN－γ表达水平。结果 pcDNA3-Ag85B诱生的抗Ag85B效介明显高于生理盐水组和pcDNA3组;pcDNA3-Ag85B免疫小鼠脾细胞在Ag85B抗原刺激下,IL－2和IFN－γ mRNA转录水平明显高于对照组,而IL－4和IL－10 mRNA转录水平在3组中无明显变化。结论 pcDNA3-Ag85B质粒DNA疫苗不仅能增强体液免疫,亦可诱导Th1型细胞免疫。     

结核分枝杆菌DNA疫苗对小鼠结核病免疫治疗作用的实验研究

目的探讨结核分枝杆菌DNA疫苗pcD85B、pcDMPT64以及小鼠白细胞介素12(IL-12)真核表达质粒psIL12对结核分枝杆菌感染的疗效与机制。方法将结核分枝杆菌H37Rv感染的C57BL/J6小鼠100只随机分成生理盐水对照组、pcDNA3.1对照组,psIL12治疗组,pcD85B、pcDMPT64、pcD85B+pcDMPT64、pcD85B+psIL12DNA疫苗治疗组。感染4周后分别给予生理盐水、空质粒、psIL-12及DNA疫苗,第1次治疗后2个月处死小鼠,检测器官荷菌量、脾淋巴细胞特异性γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素4(IL4)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的分泌水平,并于第1次治疗后2个月、5个月观察小鼠肺、脾组织病理改变情况。结果pcD85B治疗组肺组织荷菌量(lg-1CFU/g)为6.99±0.40,比生理盐水对照组(8.15±0.37)、pCDNA3.1对照组(8.19±0.29)显著降低(P<0.01);脾组织荷菌量(lg-1CFU/g,x±s)为5.17±0.33,比生理盐水对照组(5.76±0.16)及空质粒对照组(5.88±0.21)显著降低(P<0.05)。psIL12治疗组的肺(7.41±0.50)、脾(5.31±0.21)荷菌量比对照组显著降低(P<0.05);pcD85B+psIL12治疗组肺、脾荷菌量与pcD85B组比较差别无统计学意义。pcD85B组脾淋巴细胞IFN-γ、TNFα水平比对照组显著升高(P<0.05),各组间IL4水平差异无统计学意义。生理盐水对照组、pCDNA3.1对照组肺组织     

结核分枝杆菌Rv2352c基因的克隆表达及其抗原活性鉴定

目的构建含结核分枝杆菌(M.tb)rv2352c基因原核表达载体,经转化E.coli以表达Rv2352c融合蛋白,并研究其抗原性。方法用PCR扩增M.tb rv2352c基因,克隆入pET30a(+)质粒,构建pET30a(+):rv2352c重组质粒,阳性克隆测序验证正确后转化入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导Rv2352c蛋白表达。经Ni+-NTA层析柱纯化融合蛋白,通过SDS-PAGE和结核患者血清Western blot进行鉴定。将纯化的重组蛋白分别免疫家兔,制备抗Rv2352c抗血清,抗血清的效价测定采用酶联免疫吸附试验法(ELISA),取兔抗血清与纯化蛋白Rv2352c通过Western blot方法,检测抗体特异性。结果经酶切鉴定和测序分析证实rv2352c原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE和Western blot结果显示,在45 kD处呈现单一蛋白条带。用重组蛋白Rv2352c免疫接种后可诱导出高滴度的特异性抗体。纯化蛋白通过Western blot鉴定证实为目的蛋白,有较强的免疫原性。结论成功构建原核表达重组质粒pET30a(+):rv2352c,制备和纯化的Rv2352c融合蛋白具有较好的纯度和生物学功能,为进一步研究结核病的潜在分子标志物奠定基础。     

结核杆菌Ag85A及ESAT-6双价抗原融合表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

目的　为结核病新型疫苗研究提供靶基因和靶抗原。方法　采用PCR扩增的方法获得结核杆菌两种免疫保护性抗原Ag85A及ESAT - 6的基因 ,将其定向克隆入真核及原核穿梭表达型载体 pBK -CMV构建含嵌合目的基因的重组质粒 ,转化大肠杆菌后用IPTG进行诱导表达 ,并通过SDS -PAGE和Western -blotting对表达蛋白进行初步分析。结果　 1)从结核杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出Ag85A及ESAT - 6基因。 2 )成功构建了结核杆菌Ag85A及ESAT - 6双价抗原融合表达质粒 pBK - 85A -E6。 3)重组质粒 pBK - 85A -E6经IPTG诱导后能在大肠杆菌中稳定表达 38kDa的融合蛋白。 结论　成功构建了结核杆菌Ag85A及ESAT - 6双价抗原融合表达载体 ,并在大肠杆菌中实现了稳定表达 ,为进一步研究其在结核病基因工程疫苗研制中的应用奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv3803c、Rv3846基因的克隆、表达、纯化与鉴定

目的 克隆结核分枝杆菌Rv3803c和Rv3846基因,并在大肠埃希菌(E.coli)中进行表达和纯化。 方法 以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增出Rv3803c和Rv3846基因片段,克隆至pGEX-6P-1表达载体中,测序正确后,在E.coli Rosetta中诱导表达,GST标签亲和层析法纯化蛋白,考马斯亮蓝染色及Western-blot分析鉴定。 结果 重组质粒pGEX-Rv3803c、pGEX-Rv3846测序表明核苷酸序列与设计完全一致。其在E.coli Rosetta中的存在形式均为可溶部分约50%、包涵体约50%,相对分子质量约为56 000和45 000, 纯化的GST-Rv3803c、GST-Rv3846样品纯度90%以上。完整的GST-Rv3803c的浓度大约为0.1 mg/ml,完整的GST-Rv3846的浓度大约为0.5 mg/ml。即相当于每升E.coli Rosetta培养物中,GST-Rv3803c产量为：0.25 mg/L、GST-Rv3846产量为1.25 mg/L。 结论 成功获得了纯化蛋白Rv3803c（MPT51）和Rv3846（SodA）,为进一步研究MPT 51和SodA蛋白的辅助诊断价值、构建保护性疫苗提供了实验依据。