MicroRNA调控骨髓间充质干细胞成脂分化途径的研 究进展

骨质疏松症患者骨髓间充质干细胞（BMSCs)成骨分化能力减弱,成脂肪分化能力增强,脂肪组织增多,进而导致骨量 减少,可能是导致骨质疏松的原因之一。mioroRNA是一类起源于内源性转录物的单链非编码RNA,在BMSCs向脂肪细胞分 化及细胞发育成熟的过程中起重要的调控作用。本文通过检索有关BMSCs、mkroRNA、成脂肪细胞分化的相关文献并进行综 述,阐明了 mkroRNA通过调节Wnt、BMP和TGF-P信号通路上因子的表达来决定BMSCs向脂肪细胞分化,再通过调节 PPAR、C/EBP的表达来促使脂肪细胞成熟。因此,深人研究mkroRNA介导的BMSCs成脂肪细胞分化途径,将为我们深人了 解骨质疏松的发病机制具有重要意义。     

BMP-2活性多肽体外定向诱导大鼠BMSCs向成骨方向分化的实验研究

[目的]骨形成蛋白-2（BMP-2）具有较强的诱导大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）向成骨方向定向分化的能力。天然的BMP-2数量有限，结构复杂，限制了其广泛应用。本实验设计合成了BMP-2活性多肽，体外试验探讨其对BMSCs向成骨方向定向诱导成骨分化的能力，评价BMP-2活性多肽的诱导成骨效应。[方法]实验分2组，诱导组和非诱导组。取4周的Wistar大鼠分离培养BMSCs，传至第3代时，实验组，改用成骨诱导培养基（DMEM完全培养基＋BMP-2活性多肽200μg／ml）。非诱导组，仍采用DMEM完全培养基。继续培养2～4周，采用细胞爬片培养、碱性磷酸酶活性和钙含量测定、实时定量PCR检测Ⅰ型胶原（Col—Ⅰ）及骨桥蛋白（OPN）mRNA的表达，评价BMP-2活性多肽的体外诱导成骨能力。[结果]诱导组BMSCs生长良好，表现出与典型的成骨细胞相似的形态特征和生物学特性，ALP活性上升，钙含量增加，Col-Ⅰ和OPN的mRNA呈高表达。非诱导组，成骨特性不明显。[结论]合成的BMP-2活性多肽能有效地促进BMSCs向成骨方向分化，是组织工程化骨中理想的诱导成骨的细胞因子。具有与天然BMP-2类似的骨诱导活性，具有广阔的应用前景。     

地塞米松对人骨髓基质干细胞成脂与成骨分化的影响的初步报告

目的探讨不同浓度的地塞米松对骨髓基质干细胞成脂与成骨分化的影响。方法取人骨髓分离培养骨髓基质干细胞,经传代后分别置入地塞米松1×10-8mol/L(A组)、1×10-7mol/L(B组),应用Rt-PCR技术分别扩增成脂基因mPNA(PPARγmRNA)、成骨基因mRNA(Osteocalcin mRNA)对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。通过凝胶成像扫描系统做半定量分析,以PPARγmRNA和Osteocalcin mRNA与β-actin的吸光度比值表示上述产物mRNA的相对含量。结果对A组和B组通过凝胶成像扫描系统作PCR产物半定量分析,显示B组细胞中的Osteocalcin mRNA表达降低,而A组细胞中的表达增加。而且B组中的PPARγmRNA表达升高,A组降低。两者之间的差异均有统计学意义。结论地塞米松可以从分子水平调控骨髓基质干细胞的的分化。地塞米松浓度为1×10-7mol/L时,诱导骨髓基质干细胞向脂肪细胞分化,同时减少、抑制其向成骨细胞分化,这可能是激素骨坏死发生的机制之一。诱导体外培养的骨髓基质干细胞分化为成骨细胞,地塞米松浓度为1×10-8mol/L是比较适宜的。     

酒精对人骨髓间充质干细胞成脂与成骨分化的影响初步报告

目的观察酒精对人骨髓间充质干细胞中成脂转录因子PPARγmRNA和成骨基因osteocalcin(骨钙素)mRNA表达的影响。方法取人骨髓分离培养间充质干细胞,经传代后以0.09mol/L的酒精浓度作为诱导剂处理细胞,应用Rt-PCR技术检测实验组和对照组细胞中PPARγmRNA和骨钙素的表达。结果对实验组和对照组通过凝胶成像扫描系统作PCR产物半定量分析,显示实验组细胞中的osteocalcin(骨钙素)mRNA表达降低,而对照组细胞中的表达增加。而且实验组中的PPARγmRNA表达增加,对照组降低,两者之间的差异均有统计学意义。结论酒精能诱导人骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化,而减少骨髓间充质干细胞向成骨分化,这可能与酒精性坏死的发生机制有关。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外成脂分化能力的实验研究

目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞体外成脂分化能力与传代次数的关系。方法:用全骨髓培养法,分离骨髓间充质干细胞,加含有地塞米松、胰岛素、3-异丁基-1甲基黄嘌呤、吲哚美辛诱导剂的培养液进行诱导,诱导第10天进行细胞形态学观察和油红O染色鉴定,并进行光密度值测定。结果:随着传代次数增加,油红O染色细胞计数值与光密度值均下降。结论:大鼠MSCs成脂能力随传代次数增加而降低。     

插头框旋转录因子C2转染BMSCs后成骨作用的研究

[目的]观察过表达Foxc2基因对兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖及成骨分化的影响。[方法]构建携带Foxc2和绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组慢病毒表达载体,分离、培养兔BMSCs,分别以Lenti-GFP(GFP组)、Lenti-Foxc2(Foxc2组)转染BMSCs,另设未转染BMSCs对照组。MTT法检测过表达Foxc2对细胞增殖能力;Western blot、Real time PCR检测转染后7d各组细胞Foxc2蛋白、m RNA表达;以及转染后1、2、4周各组细胞骨钙蛋白(OCN)、骨桥蛋白(OPN)、一型胶原(COLⅠ)蛋白及m RNA表达;转染后2周,各组行碱性磷酸酶(ALP)染色和ALP活性检测。[结果]Foxc2组Foxc2 m RNA和蛋白高效表达;对照组、GFP组无Foxc2 m RNA及蛋白表达;MTT法检测示过表达Foxc2对BMSCs的增殖未产生显著影响;Foxc2组OCN、OPN、COLⅠm RNA和蛋白表达显著高于其他组(P<0.01),余组比较差异无统计学意义(P>0.05);Foxc2组ALP染色阳性区域大于其余两组;ALP活性显著高于其他各组(P<0.01)。[结论]过表达Foxc2不影响细胞增殖,可持续表达基因产物,并可促进BMSCs向成骨细胞分化。     

影响MSCs向成骨与成脂肪分化因素的研究进展

骨髓间充质干细胞是多能干细胞,通过诱导可分化成为骨、软骨、脂肪、肌腱等,其中影响其向成骨与成脂肪分化的因素很多。机体老化会使整体内环境发生巨大改变,也使骨髓内微环境与复杂的细胞内、外信号调控发生改变。控制相关的影响因素有助于诱导成骨分化而抑制成脂肪分化,进而提高骨质疏松、骨缺损和骨量丢失等相关疾病的治疗。     

ＯＧＰ 对低氧环境中小鼠ＢＭＳＣｓ 成脂分化影响的研究

目的　检测成骨生长肽(ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｐｅｐｔｉｄｅ?ＯＧＰ) 与低氧环境对小鼠骨髓间充质干细胞( ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ?ＢＭＳＣｓ)成脂肪分化的影响? 方法　实验随机分为４ 组:Ａ 组(常氧组)、Ｂ 组(１％Ｏ２ 组)、Ｃ 组(常氧＋１０￣９ｍｏｌ/ Ｌ ＯＧＰ 组)、Ｄ 组(１％Ｏ２ ＋１０￣９ ｍｏｌ/ Ｌ ＯＧＰ 组)? ＥＬＩＳＡ 法定量检测低氧诱导因子１α(ｈｙｐｏｘｉａ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ １α?ＨＩＦ￣１α)蛋白的表达?１４ ｄ 后?油红Ｏ 染色观察ＢＭＳＣｓ 脂滴形成情况?实时荧光定量ＰＣＲ 和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 检测成脂相关基因ＰＰＡＲ￣γ 和Ｃ/ ＥＢＰα 的ｍＲＮＡ 和蛋白表达水平? 结果　与Ａ 组及Ｃ 组相比?Ｂ 组与Ｄ 组ＨＩＦ￣１α 表达明显上调(Ｐ<０?? ０１)?与Ａ 组相比?Ｂ 组、Ｃ 组、Ｄ 组脂滴生成及ＰＰＡＲ￣γ 和Ｃ/ ＥＢＰα 的ｍＲＮＡ 和蛋白表达降低(Ｐ<０?? ０１)?与Ｂ 组及Ｃ 组相比?Ｄ 组中脂滴生成及ＰＰＡＲ￣γ 和Ｃ/ ＥＢＰα 的信使ＲＮＡ 和蛋白表达下调(Ｐ<０?? ０１)? 结论　ＯＧＰ 及１％低氧环境均能抑制ＢＭＳＣｓ 成脂分化?且二者抑制ＢＭＳＣｓ 成脂分化具有协同效应?     

骨髓基质干细胞成脂分化的调控及其对骨质疏松的影响

研究发现随着年龄的增长和绝经期后骨质疏松,骨髓腔内的脂肪细胞逐渐增多,取代了成骨细胞,因此抑制骨髓基质干细胞成脂分化是目前治疗骨质疏松的新途径。应用各种成脂诱导剂建立体外定向诱导骨髓基质干细胞成脂分化模型是研究新途径的基础。除了通过光学显微镜观察成脂分化的能力,还可运用分子生物学的方法定性、定量检测成脂分化的程度。过氧化物酶增殖子激活受体(PPARγ)是脂肪细胞的分化过程中起关键性作用的调节因子,组蛋白去乙酰化酶(SIRT1)被激活后能抑制PPARγ的表达,减少脂肪细胞的生成,起到预防和治疗骨质疏松的作用。笔者就以上方面和对减少骨髓脂肪分化的策略作了综述。     

微小RNA-23a-3p负调控Runx2基因抑制骨髓间充质干细胞成骨分化诱导绝经后骨质疏松的研究

目的:观察微小RNA(miR)-23a-3p通过调控Runx2基因对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的影响。方法:绝经后骨质疏松症(PMOP)患者及正常的女性志愿者各30例,检测两组血清中miR-23a-3p表达水平。建立雌性小鼠骨质疏松模型后提取BMSCs,将miR-23a-3p inhibitor和miR-阴...     

左归丸含药血清调节Runx2激活ALP、OPN蛋白促进BMSCs增殖和分化的研究

目的 探讨左归丸(Zuoguiwan, ZGW)的补肾填精、益髓壮骨的作用,促进骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)的增殖和向成骨细胞方向分化。方法 制备ZGW含药血清,设置10%FBS DMEM组、成骨诱导液组、2.5%空白大鼠血清-成骨诱导液组、2.5%ZGW含药血清-成骨诱导液组。采用MTT法观察各组对BMSCs的增殖,使用碱性磷酸酶钙钴染色法检测BMSCs向成骨细胞方向的分化能力,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)法检测细胞培养液中AKP的含量,Western blot检测BMSCs中Runt相关转录因子2(Runx2)、骨钙蛋白(osteocalcin, OPN)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)蛋白的表达。结果 2.5%ZGW含药血清-成骨诱导液组能够促进BMSCs的快速增殖,较早地进入平台期,促进BMSCs中AKP的分泌,提高ALP含量,上调BMSCs细胞中Runx2、ALP和OPN的蛋白表达水平。结论 ZGW抗骨质疏松的分子机制,可能与调节Ru...     

生长分化因子7体外促进BMSCs向肌腱细胞分化的研究

目的探讨生长分化因子7(growth differentiation factor7,GDF-7)在体外能否促进BMSCs向肌腱细胞分化,为改善BMSCs修复肌腱疗效提供依据。方法采用密度梯度离心法从绿荧光大鼠骨髓组织中分离培养BMSCs,通过成骨、成脂和成软骨分化鉴定其多向分化能力。取第3代BMSCs根据成肌腱培养液中加入不同浓度GDF-7(0、12.5、25.0、50.0ng/mL),分为A、B、C、D组。体外诱导培养2周后,实时荧光定量PCR检测各组scleraxis、tenomodulin、tenascinC和Ⅰ型胶原mRNA表达,免疫细胞化学染色观察tenomodulin、tenascinC和Ⅰ型胶原蛋白表达,Western blot法检测A、C组tenomodulin蛋白的表达。结果经鉴定,分离培养的BMSCs具有成骨、成脂和成软骨分化的多向分化能力。实时荧光定量PCR检测结果示,B、C、D组的tenomodulin mRNA表达分别较A组增加了2.85、3.41、3.07倍(P<0.05),scleraxis mRNA表达增加了2.13、1.50、2.56倍(P<0.05),tenascin C mRNA表达增加了2.45、2.86、1.88倍(P<0.05),但B、C、D组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。B、C组Ⅰ型胶原mRNA表达较A组分别增高了1.92和2.45倍(P<0.05);D组较A组有所增高,但差异无统计学意义(P>0.05)。免疫细胞化学染色示,B、C、D组均有tenomodulin、tenascin C和Ⅰ型胶原蛋白表达,而A组均未表达;除C组Ⅰ型胶原表达高于B、D组外,其他蛋白表达B、C、D组间无明显差异。Western blot检测示C组比A组有更高的tenomodulin蛋白表达。结论 GDF-7在体外能促进大鼠BMSCs向肌腱细胞分化。     

透明质酸对BMP-2转染的羊BMSCs增殖、分化的影响

目的观察透明质酸（HA）对携带人骨形态发生蛋白-2的腺病毒（Adv-BMP-2）转染的羊骨髓基质干细胞（BMSCs）体外增殖、分化的影响。方法将羊骨髓体外分离、扩增BMSCs,分成5组：转染Adv-BMP-2的BMSCs＋HA组（Ⅰ组）,转染Adv-BMP-2的BMSCs组（2组）,BMSCs＋HA组（3组）,BMSCs组（4组）,转染携带β半乳糖苷酶的腺病毒（Adv-β-gal）的BMSCs组（5组）。采用细胞计数、绘制细胞生长曲线和流式细胞分析观测细胞增殖;采用碱性磷酸酶（ALP）检测以及RT-PCR检测Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）、骨连接素（ON）和骨涎蛋白（BSP）的mRNA表达。结果①细胞增殖：3 d后各组细胞增殖无显著差异,1周后第1组和第3组的细胞增殖明显高于其他组。②ALP活性：3 d后第3组ALP活性明显低于第4、5组,而第1、2组则显著高于第4、5组;7 d后前3组ALP活性较后两组均显著增加,而第1、2组ALP活性增加更为显著。③Col-Ⅰ、ON和BSP的mRNA表达：3 d和7 d后前3组较后两组均有不同程度的增多。结论HA与BMSCs体外复合培养后可促进BMSCs的增殖、增加ALP的活性以及Col-Ⅰ、ON和BSP基因的表达。     

miR-187-5p 对骨髓间充质干细胞成骨分化能力的调控作用

目的利用小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的成骨分化模型,探讨miR-187-5p在成骨分化中的表达趋势及调控作用。方法通过切除雌性小鼠双侧卵巢构建小鼠骨质疏松模型;应用qRT-PCR技术检测组织和细胞中miR-187-5p的表达;应用基因转染技术观察过表达或敲减miR-187-5p对BMSCs向成骨分化的影响;应用茜素红和碱性磷酸酶染色检测BMSCs中矿化结节的数量和矿化区域的染色面积。结果 qRT-PCR结果显示miR-187-5p在骨质疏松模型小鼠的骨组织及BMSCs中均表达下降。过表达miR-187-5p可提高ALP、Collagen-1、Runx2、BMP4、OCN和OPN等成骨分化相关基因mRNA的表达,促进BMSCs向成骨分化;而敲减miR-187-5p降低ALP等成骨分化相关基因mRNA的表达,抑制BMSCs向成骨分化。在体实验同样证实,过表达miR-187-5p可以显著促进骨质疏松小鼠BMSCs向成骨分化,改善小鼠的骨质疏松表型。结论过表达miR-187-5p促进BMSCs向成骨分化,敲减miR-187-5p抑制BMSCs向成骨分化。     

基于Hippo信号通路探讨鹿茸提取液对BMSCs成骨分化的影响

目的 观察鹿茸提取液对SD大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）向成骨分化及Hippo信号通路的影响。方法 将3、4代BMSCs随机分为正常组、诱导组以及鹿茸组。酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法分别检测6、12 d以及18 d碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性及水平;茜素红染色法检测3组BMSCs钙结节生长增殖情况;qRT-PCR法和蛋白质印迹法（Western blot）检测RUNX2及Hippo信号通路 MST1和YAP的转录表达与蛋白表达水平。结果 ELISA实验结果表明,鹿茸提取液可以提高ALP的活性,12 d鹿茸组ALP的活性达到最高,18 d鹿茸组ALP的活性显著上调（P＜0.01）;茜素红实验结果显示,鹿茸组观察到大量且密集的钙结节形成,提示鹿茸提取液可有效促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化;qRT-PCR的实验结果表明,与正常组相比,鹿茸组YAP和RUNX2 mRNA显著上调（P＜0.01）;Western blot法检测结果显示,鹿茸提取液可显著上调YAP蛋白表达水平（P＜0.01）,并且明显上调RUNX2蛋白表达水平（P＜0.05）。结论 鹿茸提取液能够影响RUNX2以及Hippo信号通路中 MST1和YAP相关蛋白进而推进骨髓间充质干细胞向成骨细胞的转化。     

大鼠骨髓间充质干细胞复合n-HA/PLA支架异位成骨的实验研究

[目的]研究大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)复合纳米羟基磷灰石/聚乳酸(n-HA/PLA)支架材料体内异位成骨情况.[方法]取SD大鼠股骨胫骨骨髓,进行贴壁培养BMSCs,将第3代BMSCs接种到n-HA/PLA支架材料上,加入成骨诱导液,3d后置人大鼠体内,设为实验组;将单纯支架材料置入组为对照组.4、8、12周时取材进行大体和组织学观察.[结果]8、12周时实验组可见类骨质成分形成,并且支架材料维持置入时形状,对照组无类骨质形成.[结论]BMSCs复合n-HA/PLA构建组织工程骨有很好的异位成骨能力,且能在体内维持良好塑型.     

GH/IGF-1系统在BMSCs成脂分化过程中作用机制的实验研究

目的 研究温肾健脾、活血化瘀含药血清对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成脂分化作用过程中生长激素(GH)/胰岛素样生长因子1(IGF-1)系统的调节机制。方法 将40只SPF级雄性SD大鼠用随机数字表法分成4组,依次为正常组、成脂诱导组、温肾健脾组、活血化瘀组。对大鼠进行7 d灌胃,制备含药血清,按一定比例将含药血清与完全培养基进行配比用以BMSCs成脂分化的培养。油红O染色观察BMSCs成脂分化情况后,用ELISA法测定脂肪细胞中GH、IGF-1的蛋白水平。结果 GH蛋白表达水平结果：与正常组比较,成脂诱导组低于正常组,差异不具有统计学意义(P>0.05)。与成脂诱导组相比,温肾健脾组、活血化瘀组结果均优于成脂诱导组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。温肾健脾组与活血化瘀组相比,活血化瘀组结果优于温肾健脾组。(2)IGF-1蛋白表达水平结果：与正常组相比,成脂诱导组结果高于正常组,且差异具有统计学意义(P<0.05)。与成脂诱导组相比,温肾健脾组、活血化瘀组结果均低于成脂诱导组,且差异均具有统计学意义(P<0.05)。温肾健脾组、活血化瘀组相比,活血化瘀组结...     

恒河猴骨髓间充质干细胞体外培养及诱导分化成骨细胞的实验研究

[目的]体外分离培养非人类灵长类动物恒河猴骨髓MSCs,研究其生长、扩增及诱导分化为成骨细胞的特性.[方法]梯度离心法分离、纯化恒河猴骨髓源MSCs,观察不同接种密度和换液时间对细胞生长的影响;在体外应用成骨添加剂(含地塞米松10-7mol/L、β-甘油磷酸钠10 mmol/L、维生素C 50 mg/L)或rhBMP-2(100 ng/L)定向诱导分化,对分化后的细胞进行免疫组化染色和ALP、BGP定量测定以鉴定成骨细胞,并比较两种定向诱导分化方法的效果.[结果]梯度离心法分离、纯化得到的恒河猴骨髓源MSCs具有分裂和克隆增殖的能力,种植细胞密度为10×104～30×104/cm2,48 h后半量换液,以后每3 d全量换液的方法较合理,MSCs能少量表达ALP活性,分泌的钙量较少;诱导分化后的细胞具有和体内成骨细胞相同的形态学特征,ALP染色阳性,能表达Ⅰ型胶原,不表达Ⅱ型胶原,细胞融合后3 d,ALP和BGP分泌明显增加,融合后14 d细胞ALP、BGP的分泌水平略有升高,但无明显增加;采用成骨添加剂和rhBMP-2诱导分化MSCs后相同时期成骨细胞ALP活性、BGP含量无明显差异.[结论]密度梯度离心法分离得到的非人类灵长类动物骨髓源MSCs,体外培养具有分裂、克隆增殖的能力,在加有成骨细胞诱导剂或rhBMP-2的培养基里能诱导分化为成骨细胞,化学药物在定向诱导分化过程中具有和生长因子相一致的作用.     

衰老骨髓间充质干细胞中端粒短缩与成骨能力下降相关性研究

目的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是组织工程中修复骨和软骨缺损的重要种子细胞。老年供体BMSCs的增殖速度和分化能力均低于年轻供体,其相关机制仍不清楚,希望通过相关实验对其进行探究。方法采用SD大鼠的BMSCs进行培养,并通过应用H_2O_2处理和连续传代诱导细胞衰老。通过β-半乳糖苷酶染色和端粒长度分析检测衰老,同时对细胞增殖和成骨分化能力进行检测。应用Olaparib维持端粒长度来研究端粒长度在细胞衰老、增殖和分化能力方面的影响。结果 H_2O_2可以增加BMSCs中β-半乳糖苷酶染色阳性率、缩短端粒长度、降低细胞增殖率和碱性磷酸酶活性。BMSCs长期传代后也可观察到成骨分化的衰老。抑制端粒长度下降可降低H_2O_2诱导所致的β-半乳糖苷酶染色阳性率增加,促进细胞增殖,增强成骨分化能力。结论端粒长度下降可引起BMSCs的衰老,从而降低其成骨分化能力、抑制干细胞增殖。