经心包腔转染腺病毒血管内皮生长因子165基因对猪冠脉血管形成的影响

目的:探讨以腺病毒为载体的血管内皮生长因子165(Ad-VEGF165)基因经心包腔转染的表达规律、合适的剂量及对缺血心肌血管生成的作用.方法:随机将20头中华小型猪分为实验组和对照组,每组10头.采用球囊堵塞前降支第一对角支远端建立心肌梗死模型.构建后即刻,实验组采用经皮剑突下穿刺,中心静脉导管插入心包腔内,以含胶原酶1 200 u及透明质酸酶3 000 u的生理盐水2 ml预处理心包后,在心包腔内注入含Ad-VEGF165基因2.0×109pfu的生理盐水1 ml;对照组同样方法预处理心包后,在心包腔内注射生理盐水1 ml.注射后3 d(n=2)、7 d(n=2)及28 d(n=6)分别用免疫组化、超声心动图检测缺血心肌血管新生情况及心功能,并以酶联免疫吸附试验(ELISA法)检测血浆及心肌组织中Ad-VEGF165的表达.结果:Ad-VEGF165基因经心包腔转染缺血心肌组织后,在心肌组织中呈高表达,于7 d达到高峰,28 d降至基线水平,血浆中无目的基因的表达;28 d时,实验组缺血心肌微血管密度(MVD)、心功能均明显高于对照组(MVD(517.00±75.70)mm-2vs(226.50±54.10)mm-2,P=0.009;LVEF(%)(72.11±5.20)w(55.14±4.37),P=0.005).结论:用胶原酶及透明质酸酶预处理心包后,经其转染Ad-VEGF165可以诱导急性心肌梗死模型局部VEGF蛋白表达,促进缺血心肌组织血管新生并能改善心功能.     

重组腺病毒血管内皮生长因子165基因心包腔与冠状动脉转染猪心肌效果比较

目的:比较经心包腔与冠状动脉转染重组腺病毒血管内皮生长因子165(Ad-VEGF165)基因的效果.方法:20头小型猪随机等分为心包转染组和冠状动脉转染组,2组均采用球囊堵塞前降支第一对角支远端,心包组心肌梗死模型建立后即刻,采用经皮剑突下穿刺中心静脉导管心包腔内转染,胶原酶和透明质酸酶预先处理心包,然后注射Ad-VEGF165 1.0 ml(2.0×109pfu);冠状动脉组心肌梗死模型建立后即刻,经冠状动脉注射Ad-VEGF1651.0 ml(2.0×109pfu),于注射后3 d、7 d、28 d分别测定2组心肌组织内VEGF水平、微血管密度、心功能.结果:心包转染组和冠状动脉转染组的心肌组织均表达有VEGF165基因,组织内VEGF水平在7 d时达高峰,28 d时降至基线水平,心包转染组高于冠状动脉转染组((702±85)ng/Lvs(592±59)ng/L,P=0.026).2组微血管密度随转染时间增加,心包转染组心功能优于冠状动脉转染组(FS/%:32.9±2.2vs 30.6±2.1,P=0.049;EF/%:72.11±5.20vs65.87±2.16,P=0.034).结论:导管介导的心包腔与冠状动脉转染Ad-VEGF165基因治疗心肌缺血是有效、切实可行的,而前者可能是更有前途的新方法.     

复制缺陷的重组腺病毒经心包腔转染急性心肌梗死猪观察

目的:评价重组腺病毒经心包腔转染的效率及持续时间.方法:应用磷酸钙沉淀方法制备携带大肠杆菌LacZ基因复制缺陷的重组腺病毒(Ad-LacZ).12头中国小型猪随机等分为实验组和对照组,采用球囊堵塞前降支第一对角支远端,心肌梗死模型建立后即刻采用经皮剑突下穿刺中心静脉导管心包腔内注射转染,28 d后处死.实验组胶原酶1 200 u及透明质酸酶3 000 u预处理心包后,在心包腔内注射Ad-LacZ基因2.0×109噬斑集落形成单位;对照组:同样方法预处理心包后,在心包腔内注射生理盐水1 ml.于注射后3 d、7 d及28 d分别对缺血心肌进行HE、HBFP及X-gal染色.结果:冠状动脉造影证实前降支远端完全闭塞,病理学检查显示心肌有缺血和梗死.实验组注射Ad-LacZ基因后第3 d、7 d及28 d后X-gal染色有阳性细胞,以7 d最明显,对照组28 d内均未发现阳性细胞.结论:应用球囊堵塞法可成功建立猪急性心肌梗死模型,胶原酶及透明质酸酶预处理心包后,腺病毒载体可转染缺血心肌,并持续表达4周.     

心包穿刺简易装置在基因转染中的应用

目的探讨自制心包穿刺装置转染心脏的安全性、可行性。方法应用磷酸钙沉淀方法制备携带大肠杆菌LacZ基因复制缺陷的重组腺病毒(Ad-LacZ),将12头中国小型猪分为实验组和对照组,采用球囊堵塞前降支第一对角支远端,心肌梗死模型建立后即刻,采用自制简易心包腔穿刺装置经皮剑突下穿刺,成功后置中心静脉导管于心包腔内并行转染,28 d后处死。实验组:胶原酶1200 U及透明质酸酶3000 U预处理心包后,在心包腔内注射Ad-LacZ基因2.0×109p.f.u;对照组:同样方法预处理心包后,在心包腔内注射生理盐水1 mL。于注射后3、7及28 d分别对缺血心肌进行染色及病理观察。结果冠状动脉造影证实前降支远端完全闭塞,病理显示心肌有缺血和梗死;实验组注射Ad-LacZ基因后第3、第7天及28d后X-gal染色有阳性细胞,以第7天最明显,对照组无阳性细胞。结论自制的心包腔简易穿刺装置将腺病毒载体转染至缺血心肌是安全的,可行的,并且腺病毒可持续表达4周。     

大鼠心肌缺血的血管内皮生长因子基因治疗

目的：应用血管内皮生长因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ,ＶＥＧＦ）基因治疗心肌缺血,方法：雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠２０只,结扎冠状动脉前降支造成心肌梗死模型。心脏多点注射构建的ｐｃＤ２／ＶＥＧＦ真核表达质粒。应用逆转录聚合酶链反应,ＶＥＧＦ免疫组织化学染色,心肌碱性磷酸酶染色及血管计数等方法检测了ＶＥＧＦ基因在缺血心肌中的表达及生物学作用。     

腺病毒载体介导血管内皮生长因子165基因治疗新生大鼠缺氧缺血性脑损伤

目的 研究腺病毒介导血管内皮生长因子(VEGF)165基因转移对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)的治疗作用.方法 采用细菌内同源重组技术构建腺病毒重组载体Ad-VEGF.7日龄SD大鼠随机分成3组:假手术组(20只)、HIBD(20只)、Ad-VEGF移植组(Ad-VEGF组,20只),Ad-VEGF移植组在HIBD后3 d于大鼠左侧感觉运动皮层区(坐标AP:+0.3mm,ML:-2 mm,DV:-1.5 mm)立体定位注射2μl重组体腺病毒悬液.移植后7 d采用免疫组织化学法检测鼠脑VEGF蛋白;采用原位缺口末端标记法(TUNEL法)检测鼠脑神经元凋亡情况;大鼠3～4周龄时采用T迷宫觅食实验及足错误、姿势反射、肢体放置实验对其学习记忆、空间能力和感觉运动功能等行为学进行评估;采用尼氏染色法检测鼠脑海马CAl区和皮层单位面积内神经元数目.结果 免疫组织化学法结果 显示皮层与海马Ad-VEGF组VEGF阳性细胞数均明显多于HIBD组(68.09±3.37比24.65±3.37,68.37±3.17比25.14±1.86,均P<0.05).TUNEL结果 显示Ad-VEGF组鼠脑神经元凋亡数目明显低于HIBD组(151.4±21.7比264.4±16.3,P<0.05);行为学检测结果 显示Ad-VEGF组的各项行为学测试成绩均较HIBD组有明显改善(均P<0.05),尼氏染色结果 显示Ad-VEGF组鼠脑海马CAl区和皮层单位面积内神经元数日明显多于HIBD组(70.6±2.3比55.3±2.1,95.1±2.8比70.1±2.7,均P<0.05).结论 腺病毒载体介导的VEGF165基因治疗可增加VEGF蛋白的表达,减少脑细胞凋亡、改善脑损伤后的远期行为学功能,减轻缺氧缺血后的脑损伤,具有神经保护作用.     

人血管内皮细胞生长因子165基因转染大鼠内皮祖细胞的实验研究

目的探讨人血管内皮细胞生长因子165（hVEGF165）基因转染骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）及对其影响。方法体外分离、培养、鉴定大鼠骨髓EPCs,ELISA检测转基因EPCs表达VEGF蛋白,MTT法检测对其增殖的影响。结果FITC-UEA-I和DiI-ac-LDL荧光双染证实分化的EPCs,脂质体介导pcDNA3-hVEGF165质粒转染组EPCs培养基上清中表达VEGF,hVEGF165基因转染促进EPCs增殖,注射转基因EPCs的大鼠皮下局部血管增加。结论hVEGF165基因可成功转染EPCs,并且具有血管内皮增殖刺激活性,为进一步研究hVEGF165基因修饰EPCs治疗血管内膜损伤性疾病提供实验依据。     

大鼠心肌缺血的血管内皮生长因子基因治疗

目的：应用血管内皮生长因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ, ＶＥＧＦ） 基因治疗心肌缺血。方法：雄性Ｗｉｓｔａｒ 大鼠２０ 只,结扎冠状动脉前降支造成心肌梗死模型。心脏多点注射构建的ｐｃＤ２／ＶＥＧＦ真核表达质粒。应用逆转录聚合酶链反应,ＶＥＧＦ免疫组织化学染色,心肌碱性磷酸酶染色及血管计数等方法检测ＶＥＧＦ 基因在缺血心肌中的表达及生物学作用。结果：转移ＶＥＧＦ基因后在大鼠缺血心肌中有ＶＥＧＦｍＲＮＡ 高表达, ＶＥＧＦ 免疫组化染色可见ＶＥＧＦ蛋白表达水平升高。心肌碱性磷酸酶染色显示,转移ＶＥＧＦ基因能够促进缺血心肌新生血管的形成。结论：ＶＥＧＦ基因能够在大鼠缺血心肌中获得表达,并发挥其促进新血管形成的作用。为ＶＥＧＦ 基因治疗心肌缺血奠定基础。     

血管内皮生长因子基因治疗兔下肢缺血的实验研究

目的：了解血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）基因治疗兔下肢缺血模型后新生血管和侧支循环形成状况。方法：构建ｈＶＥＧＦ１６５的真核表达载体,通过直接肌肉注射将ｈＶＥＧＦ１６５基因转染缺血部位肌细胞,经颈总动脉插管行下肢血管造影。结果：ＶＥＧＦ治疗组在质粒转染后２和４周动脉血管造影显示,新生血管数目和侧枝血管形成较对照组明显增加。结论：肌细胞能够吸收裸露的ＶＥＧＦ ｃＤＮＡ质粒并获得局部高效表达,产生刺激体     

血管内皮生长因子基因重组腺病毒载体的构建

目的 :构建携带人血管内皮生长因子基因的重组腺病毒载体。方法 :将人源性的 VEGF1 6 5c DNA正向插入到穿梭质粒 p HCMVSP1A的 CMV启动子之下 ,构建重组质粒 ,通过脂质体与 p JM17共转染 2 93细胞 ,经同源重组获得携带人 VEGF1 6 5基因的重组腺病毒 ,通过 PCR扩增法鉴定所构建的腺病毒 ,扩增、纯化并测定滴度。结果 :人VEGF1 6 5c DNA成功地正向插入到 p HCMVSP1A载体中 ,以重组病毒基因组 DNA为模板 ,同时扩增出 5 76 bp的VEGF1 6 5c DNA基因片段和 86 0 bp的腺病毒骨架基因片段 ,证实了所构建病毒的正确性 ,病毒滴度为 2 .5× 10 9pfu/ m l。结论 :成功构建了表达人 VEGF1 6 5基因重组腺病毒载体 ,使 VEGF基因的高效转染成为可能     

Comparative study of catheter-mediated gene transfer into heart

ObjectiveTo investigate the feasibility and features of 3 catheter-mediated approaches of gene transfer into heart, including direct myocardial injection (DMI), coronary artery perfusion (CAP), and intrapericardial cavity injection (ICI).MethodsFifteen dogs were used, and 03ml (1×10［9］ pfu) of an adenovirus (Adex1SR LacZ) was injected into the heart by 3 methods.The dogs were killed 5 days following injection, and gene expressions in heart and liver were evaluated by histochemical analysis.ResultsThe results showed that ① the CAP method was relatively less damaging and induced sparse LacZ expression in the myocardium, and the gene expression was also foundin both vessels within the myocardium and liver; ② gene transfer by DMI resulted in intense LacZ expression around the injection accompanied by a local inflammatory response; ③ LacZ expression elicited by ICI was detected in either the inner surface of the parietal pericardium or epicardial surface of the heart,and also in the myocardium underlying the visceral pericardium.ConclusionThree catheter-mediated methods of gene transfer into the heart may be used and a reasonable approach should be chosen according to purpose     

Improvement of cardiac function by hepatocyte growth factor via intracoronary transfection in the swine myocardial infarction model

Objective： To study the amelioration effect of AdenovirusS-mediated human hepatocyte growth factor （AdsHGF） on postinfarction heart failure in the swine myocardial infarction model. Methods： Twelve SuZhong young swine were randomly divided into 2 groups with 6 swine in each group： Ad5-HGF-treated group and null-Ad5 group. Four weeks after ligation at left anterior descending coronary artery in swine hearts, Ad5-HGF was transferred to the swine myocardium. Simultaneously, Gated myocardial perfusion imaging was performed to evaluate cardiac perfusion and heart function. After three weeks, Gated myocardial perfusion imaging was performed again, then the hearts were harvested and sectioned to examine the expression of HGF through ELISA. Results： High expression of human HGF was observed in the myocardium of Ad5-HGF-treated group. From 4 weeks to 7 weeks after operation, Left ventricular ejection fraction was increased in Ad5-HGF-treated group. The improvement in LVEF was greater in Ad5-HGF-treated group than that in null-Ad5 group at 7 weeks after operation. Cardiac perfusion was significantly improved in the Ad5-HGF-treated group. Conclusion： High expression of human HGF was observed in the myocardium through intracoronary transfection, which suggests that HGF can ameliorate heart function in swine with postinfarction heart failure.     

酸性成纤维细胞生长因子基因转染猪慢性缺血心肌促进侧支血管的增生

目的：探讨人酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)基因重组腺病毒载体（Ad.aFGF)转染缺血心肌后促进侧支血管增生的作用。方法：实验用小型猪开胸于左冠回旋支（Lcx)放置Ameroid环，4周后，将Ad.aFGF(n=7)、Ad.Null(n=6)、PBS（n=6)直接注射到Lcx供血区域，每只10点，每点10^9pfu或100μl；4周后心脏超声检测局部心功能的改善，体外冠状动脉造影观察侧支血管的增生，注射点心肌Ⅷ因子免疫组化染色检测心肌中的新生血管。结果：冠状动脉造影显示Ad.aFGF组较其他两组心肌中有明显的侧支血管增生，局部室壁功能显著提高；Ⅷ因子免疫组化染色显示Ad.aFGF组心肌中新生血管的密度显著高于另两组（P＜0.01)。结论：Ad.aFGF转染慢性缺血心肌后可促进侧支血管增生，可以成为治疗缺血性心脏病的有效途径。     

PTCA球囊封堵冠状动脉制作猪急性心肌梗死再灌注模型及判定

目的：探讨PTCA球囊封堵猪冠状动脉建立急性心肌梗死再灌注动物模型的实验方法并进行判定。方法：选用中华小型猪8只,将PTCA球囊放至冠状动脉左回旋支第一钝缘支,堵闭血流90min,再灌注60min后,用坏死特异性对比剂（EC-60）增强MRI在活体确定梗死区;离体标本进行氯化三苯基四氮唑（Trc）组化染色验证梗死区。结果：成功建立8只猪急性心肌梗死动物模型,活体ECIII-60增强MRI高信号区与离体TTC染色所示梗死区部位与面积一致（P〉0．05）。结论：应用PTCA球囊封堵猪冠状动脉可成功建立急性心肌梗死动物模型,这种模型具有重复性好、可控性强的优点,且创伤较小,接近临床病理生理王寸程．可作为急性心肌梗死研究的技术平台。     

猪急性心肌梗死模型建立中心律失常的防治体会

目的：总结猪急性心肌梗死模型建立过程中心律失常的发生特点及防治方法.方法：选择健康雌性家猪14只,3～5月龄,体重25～40 kg.随机分为2组：实验组（n＝8）行缺血预适应处理,依次扩张球囊阻断前向血流1 min、2 min、5 min,每次间隔60 s,然后扩张60 min,扩张压力为2 atm.在建立模型过程中,心率＞150次/min时即静脉推注美托洛尔5 mg.对照组（n＝6）不行缺血预适应处理,直接扩张球囊阻断前向血流60 min,扩张压力为2 atm,静脉不推注美托洛尔.2组动物发生室性早搏后均静脉推注利多卡因,发生室性心动过速、室颤后均行直流电复律.建立模型前、后行心电图检查,术中行心电监护.结果：2组动物在建模过程中均有室性心律失常发生,实验组6只发生室早（75.0%）,4只发生室速（50.0%）,3只发生室颤（37.5%）,无一只死亡,建模成功率为100%.对照组4只发生室早（66.7%）,4只发生室速（66.7%）,6只发生室颤（100%）,死亡2只（33.3%）,建模成功率为66.7%.实验组3只发生再灌注心律失常（37.5%）,对照组6只发生再灌注心律失常（100%）,2组比较差异有统计学意义（P＜0.05）.实验组动物较对照组动物缺血性心律失常发生晚（P＜0.05）.实验组动物直流电转复成功率高于对照组.结论：缺血预适应、静脉推注美托洛尔可以有效地减少急性心肌梗死建模过程中心律失常的发生,提高建模成功率.     

缺血后处理对减小猪急性心肌梗死面积的作用

目的探讨缺血后处理限制猪心肌梗死范围的作用。方法滇南小耳猪10只,随机分为2个组。实验组(n=5):在X线的监控下,经右股动脉置入冠状动脉球囊导管至左前降支,球囊扩张阻断血流60min,予8次球囊放气30s、充气30s短暂缺血再灌注即缺血后处理;对照组(n=5):不行缺血后处理,直接撤除球囊。测定缺血前、再灌注2h及24h心肌酶学指标。再灌注72h采用2,3,5氯化三苯基氯四氮唑(TTC)染色确定心肌梗死面积。结果再灌注后2h,两组的磷酸肌酸激酶(CK)及乳酸脱氢酶(LDH)较缺血前明显增高,差异有统计学意义(P<0.05);再灌注后24h,实验组的CK、LDH较对照组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。病理学检查显示缺血后处理组梗死面积明显小于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论缺血后处理有缩小猪急性心肌梗死面积的保护作用。     

注射腺病毒介导的Cyr61基因对鼠缺血心肌血管生成影响的实验研究

目的:探讨Cyr61基因的血管生成作用。方法:制备大鼠心肌梗死模型,随机分3组:Ad-Cyr61组;Ad-null组;单纯心肌梗死组;每组24只,根据处死大鼠不同时间点每组又分成3个亚组,每亚组8只。在缺血区心肌内注射Ad-Cyr61及Ad-null。于梗死后3、7、14d处死大鼠,通过RT-PCR检测Cyr61mRNA的表达,免疫组化检测CD31及α-SMA。结果:注射Ad-Cyr61组3d时Cyr61mRNA显著表达,与Ad-null组及单纯心肌梗死组比较,吸光光度值有显著性差异(0.394±0.119对0.158±0.017和0.149±0.014,P<0.01),7、14d时仍有表达,但无显著差异。注射Ad-Cyr61组毛细血管密度3d时与Ad-null组及单纯心肌梗死组比较没有明显变化,7、14d时毛细血管密度明显增加,与后二者比较有显著性差异(P<0.01)。Ad-null组α-SMA阳性的小动脉于14d时较Ad-null组增多。结论:心肌注射Ad-Cyr61后,缺血心肌表达Cyr61,并且促进了血管生成作用。     

人趋化素样因子1基因转移对急性心肌梗死大鼠心功能的影响

目的：探讨人趋化素样因子1（chemokine-like factor 1, CKLF1）基因转移对急性心肌梗死大鼠梗死面积及心功能的影响。方法：雄性3月龄Sprague-Dawley（SD）大鼠30只,随机分为3组,盐水组、CKLF1组、空质粒组,分别于股直肌内注射生理盐水100 μg、CKLF1真核表达质粒或空载质粒100 μg,并予以直流方波电脉冲刺激,第6天结扎冠状动脉前降支构建大鼠急性心肌梗死模型,第22天行超声心动图及血流动力学检查,然后处死大鼠,测定心肌梗死面积。结果：CKLF1组,左心室射血分数（67.02%±12.24%）明显高于盐水组（43.64%±7.82%）及空质粒组（47.56%±4.10%）,P＜0.05;左心室短轴缩短率（33.83%±10.15%）明显高于盐水组（18.49%±3.96%）及空质粒组（20.85%±2.24%）,P＜0.05;左心室压力上升最大速率［（5 720.01±826.32） mmHg/s,1 mmHg=0.133 kPa］明显高于盐水组［（3 955.69±685.91） mmHg/s］及空质粒组［（4 412.03±500.74） mmHg/s］,P＜0.05;左心室压力下降最大速率［（4 636.23±407.17） mmHg/s］明显高于盐水组［（2 984.82±615.24）mmHg/s］及空质粒组［（2 963.87±419.36） mmHg/s］,P＜0.05;而CKLF1组大鼠心肌梗死面积（29.63%±3.93%）明显小于盐水组（38.01%±5.48%）及空质粒组（37.50%±6.33%）,P＜0.05。结论：CKLF1基因转移可以缩小大鼠心肌梗死面积并改善其心功能。