一种简便高效制备伯氏疟原虫蛋白的实验方法

目的：探讨建立简便有效的大量制备鼠伯氏疟原虫蛋白的方法.方法：采集伯氏疟原虫感染晚期的大鼠外周血经肝素抗凝,通过白细胞滤器过滤去除白细胞,再使用30%阿拉伯胶溶液经密度梯度离心法分离含虫红细胞,经皂素溶血,收集纯化的原虫,虫体经超声波破碎后离心,上清液经SDS-PAGE电泳分析.采用蛋白凝胶灰度扫描方法分析蛋白电泳条带的分布.结果：从大鼠含虫外周血可分离制备出大量的可溶性疟原虫蛋白,对大鼠分离的疟原虫可溶性蛋白与小鼠来源的原虫可溶性蛋白比较,两种蛋白的电泳图谱完全相同.结论：利用大鼠模型可简便高效地制备大鼠伯氏疟原虫,结合超声波破碎法可提取足量的可溶性疟原虫蛋白抗原.     

薄血膜及滤纸片干血滴分离疟原虫DNA方法的比较

DNA检测以特异性强、敏感性高、简便快速 ,被广泛应用于疟疾的诊断及普查。疟原虫 DNA的分离方法虽多 ,但多以静脉血分离为主 [1 ] 。有学者应用指尖取血制作滤纸片干血滴及静脉全血制作的薄血膜进行疟原虫 DNA的分离 [2 ] 。本文就两种方法对疟原虫 DNA的分离进行比较 ,探讨其应用价值。1　材料与方法1.1　血样制备1.1.1　恶性疟原虫血样品制备 :用采自非疟疾流行区、经姬姆萨染色显微镜检查确诊恶性疟原虫阴性的正常人静脉血对人工培养的恶性疟原虫 FCR3株进行倍比稀释 ,制成恶性疟原虫浓度分别为 1.5× 10 4/μl、1.5× 10 3/μl、…     

虫库FCC_1/HN恶性疟原虫分离株某些生物活性鉴定

为了便于进行疟疾疫苗保护性观察及建立恶性疟原虫克隆株的需要,对虫库保存的恶性疟原虫FCC1/HN分离株进行某些生物特性鉴定。通过体外培养条件变更以观察现存FCC1/HN分离株恶性疟原虫的生长特性,以体外微量法测定该株原虫对氯喹的敏感性及用套式PCR/RFLP分析方法对该株原虫二氢叶酸还原酶基因型进行鉴定。结果显示,现存FCC1/HN株恶性疟原虫对体外培养条件适应性强,对氯喹高度敏感,DHFR基因的第108号编码为AAC突变型。建议对虫库保存的恶性疟原虫FCC1/HN分离株的生物活性定期进行鉴定。     

恶性疟原虫4个分离株的体外培养

为了筛选在体外培养中能形成成熟配子体的虫株,以建立恶性疟原虫蚊期和红外期实验模型,我们于1990年在云南南部疟疾流行区从4个病人分离出4个恶性疟原虫分离株,暂定名为B-1(Burma-1),FCC-901/YN,FCC-902/YN,FCC-903/YN,并进行了体外培养观察。     

伯氏疟原虫抗氯喹株与氯喹敏感株在乳酸脱氢酶同功酶和蛋白谱上的差异

本研究观察了抗氯喹株及氯喹敏感株伯氏疟原虫在代谢方面的差异。纯分离的疟原虫经Disk-电泳分离后,用乳酸脱氢酶活力染色,氯喹敏感株疟原虫可见两个主带,抗氯喹株疟原虫只呈现一个主带。经SDS一电泳分离的标本以硝酸银染色后,氯喹敏感株疟原虫的蛋白分带显著多于抗氯喹株疟原虫,提示疟原虫对氯喹产生抗药性后,在代谢方面亦发生了相应的变化。     

动物疟原虫与人疟原虫的交叉反应抗原

目的分析5种疟原虫（间日疟原虫、恶性疟原虫,食蟹猴疟原虫、伯氏症原虫,约氏疟原虫）中,可被间日疟、恶性疟病人血清识别的交及反应抗原。方法用50％、60％Percoll不连续梯度分离疟原虫感染红细胞,20mmolPBS被红细胞后,收集红内期原虫,以1％NP—40提取可溶性抗原。各种抗原经SDS—PAGE电泳后,转移至硝酸纤维膜上,分别用间日疟、恶性疾病人血清进行免疫识别。结果3神动物疟原虫红内期抗原中有多条蛋白区带可被间日疟或恶性疟病人血清识别。其中合蟹报疟原虫有14条蛋白带被间日疟病人血清识别,伯氏疟原虫有16条蛋白区带被恶性疟病人血清识别,分别多于其它疟原虫。间日疟病人血清可识别5种疟原虫共有的72kD蛋白,而恶性疟病人血清不识别该蛋白。结论人疟原虫和动物疟原虫之间有一系列支又反应抗原。会压滤疟原虫与间日疟原虫,伯氏疟原虫与恶性疟原虫之间抗原相似程度高于其它疟原虫。72kD．蛋白在间日疟无疾学诊断方面可能有实用价值。     

改进的一维二维电泳法分析疟原虫子孢子蛋白质的差异表达

目的建立及优化一维和二维凝胶电泳技术显示不同时期约氏疟原虫子孢子的蛋白差异表达的实验条件,为进一步研究疟原虫具有感染性的唾液腺子孢子和不具感染性的卵囊成熟子孢子间的差异表达蛋白研究奠定基础.方法采用优化的蛋白质抽提试剂、方法分别获得疟原虫具有感染性的唾液腺子孢子和不具感染性的卵囊成熟子孢子蛋白.采用一维和二维蛋白电泳技术对不同时期约氏疟原虫子孢子蛋白进行分析比较,建立约氏疟原虫子孢子蛋白质一维、二维电泳图谱.结果采用一维和二维蛋白电泳技术能够有效显示疟原虫具有感染性的唾液腺子孢子和不具感染性的卵囊成熟子孢子蛋白,为以后进一步研究子孢子侵入相关蛋白,进行功能学的分析奠定基础.结论所采用的一维和二维蛋白电泳相结合的方法对分离斯氏按蚊中约氏疟原虫唾液腺子孢子和卵囊成熟子孢子蛋白质具有较好的重复性和分辨率.     

芜荑抗疟作用实验研究：一,对疟原虫配子体的效应

在抗疟中药研究中发现芜荑具有抗疟作用,通过体内和体外试验证实其亲脂性提取物丙(C)是抗疟有效部位。获得国家自然科学基金会资助后,又进一步观察了对耐药疟原虫株、疟原虫配子体、红内期疟原虫及红外期疟原虫的效应。本文先报道对耐药疟原虫株的效应,其余内容将另文陆续报告。 1 材料及方法 1.1 实验用药:芜荑提取到亲脂性提取物丙(C)后,再用薄层及拄层层析进一     

SMMC/C系小鼠生物学特性研究 Ⅳ.SMMC/C系小鼠疟原虫敏感性的初步观察

在疟疾实验中,需要使用对疟原虫敏感性较高的小鼠。SMMC/C 系小鼠为本校动物所培育由昆明株小鼠近交繁殖的纯系小鼠。本实验以 SMMC/C 系小鼠为实验动物。对约氏疟原虫(Plasmoclium yaelii)。伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)ANKA 株子孢子感染及输血感染的敏感性分别进行了观察。     

约氏疟原虫合子的分离和动合子培养

目的：从感染小鼠血液直接分离约氏疟原虫合子，并在体外培养，转化为动合子，方法：体外诱导感染鼠血中的约氏疟原虫雌雄配子形成，受精，采用Ficoll 400-Hypaque密度梯度离心法分离合子，并在MEM培养基中培养。结果：从10－15只感染小鼠血液可分离到10^6数量级的约氏疟原虫合子，在22℃条件下，经18－24h培养有动合子形成，结论：可以直接从感染血中分离到约氏疟原虫合子，所得合子经培养可形成动合子。     

约氏疟原虫红内期18S UrRNA和Pir基因扩增实验条件的研究

目的 扩增红内期约氏疟原虫相关基因方法的建立和优化.方法 收集约氏疟原虫感染昆明株小鼠抗凝全血,不处理或分别用淋巴细胞分离液去除白细胞、分离后破碎红细胞,提取总RNA,分别用Olig(dT)15和随机引物进行常规反转录,在不同的MgCl2浓度条件下,PCR扩增约氏疟原虫18S UrRNA和Pir基因.结果 经过淋巴细胞分离液分离处理组提取的RNA的纯度相对较高,可达1.9以上,但是3种处理方式在MgCl2浓度大于等于2 mmol/L条件下,可成功扩增出约氏疟原虫的Pir基因,但是只有随机引物进行反转录组才能成功扩增出18S UrRNA.结论 不处理疟原虫感染全血提取的RNA纯度较低,但是能在2 mmol/L MgCl2条件下成功扩增疟原虫相关基因;18S UrRNA只能从随机引物进行反转录组中成功扩增.     

Nested polymerase chain reaction in detection of Plasmodium vivax sporozoites in mosquitoes

目的　检测蚊体内间日疟原虫DNA。方法　以疟原虫SSurRNA为模板 ,采用套式PCR扩增间日疟原虫特异性 12 1bp片段。结果　在实验感染蚊中 ,套式PCR可检测到低至 3个间日疟原虫子孢子的DNA或 10 0只蚊中的一只阳性蚊 ,而其它 3种人疟原虫或正常蚊DNA未扩增出条带。结论　套式PCR的敏感性及特异性表明 ,该方法在检测蚊体内少量疟原虫感染时 ,比DNA探针或直接PCR具有更大优越性。     

ELISA抑制法检测约氏疟原虫红细胞内抗原的动态观察

用免疫学试验测定宿主体液内寄生虫抗体,是寄生虫病实验诊断的研究趋向。近来,在疟疾研究中有人试用免疫标记技术测定宿主红细胞内疟原虫抗原,Mackey(1980、1982)及Avraham(1981)以放射免疫测定和酶联免疫吸附试验抑制法(简称IELISA)检测鼠疟原虫和人疟原虫红细胞内抗原。为     

间日型疟原虫杂交瘤单克隆抗体研究——抗原制备—红内期原虫的浓集与分离

作者用一种较新的细胞分离剂——Percoll,首次从宿主(猴、人)血液中浓集与分离间日型红内期原虫获得较为满意的结果。食蟹猴疟原虫成熟滋养体、裂殖体及配子体的回收率分别为25.12、53.97及20.33％,纯度为95.31％。人间日疟原虫相应各期的回收率分别为37.80、52.35及37.41％,纯度为94.39％。     

常山提取物对氯喹敏感株和抗氯喹株鼠疟原虫的效应观察

在动物实验和人工培养疟原虫中观察了常山提取物对疟疾的疗效。实验结果显示该提取物与氯喹一样具有抗疟作用。常山提取物对于抗氯喹株疟原虫有良好效果,而且对氯喹敏感株和抗氯喹株疟原虫的疗效相同。同时证实对人工培养的恶性疟疟原虫亦有效果。     

伯氏疟内质网塑形蛋白SEY1敲除质粒的构建及转染

目的:为了研究重要内质网塑形蛋白SEY1在疟原虫致病性方面的作用,本研究构建敲除伯氏疟原虫PbSEY1的质粒,结合疟原虫转染技术筛选PbSEY1缺失疟原虫突变体。方法:选取PbSEY1编码区中相邻的两个片段作为同源臂进行PCR扩增,并引入特定酶切位点,借助T4 DNA连接酶和In-Fusion无缝克隆的方法将其插入载体pL0034中;利用疟原虫同步化培养及电转染技术将该质粒转入疟原虫,基于基因同源重组原理在疟原虫中敲除PbSEY1并进行药物筛选。结果:（1）获得可用于基因敲除及回复实验的重组质粒pL0034-△PbSey1;（2）在伯式疟原虫中敲除PbSEY1。结论:利用重组质粒pL0034-△PbSey1和疟原虫转染技术初步获得PbSEY1缺失疟原虫突变体,为进一步研究PbSEY1在疟原虫致病性中的作用提供了必要工具。     

广西中华按蚊对间日疟原虫和恶性疟原虫易感性的实验观察

关于中华按蚊对间日疟原虫易感性的实验研究国内已有一些报导,但多属黄淮平原疟疾流行区的蚊种和虫种.至于对恶性疟原虫的易感性,国内尚缺乏实验研究报导.我们于1981～1982年对广西中华按蚊的易感性进行了实验观察,目的在于对我国中华按蚊种型及间日疟原虫虫株问题的研究,以及评价本蚊在我国南方地区传播疟疾的作用提供进一步的科学资料.     

伯氏疟原虫静息巯基氧化酶表达阶段的确定

目的 观察伯氏疟原虫静息巯基氧化酶(PbQSOX)的表达阶段及表达特点.方法 分别采用SignalP-5.0 Server与TMHMM Server 2.0在线软件对PbQSOX蛋白的信号肽与跨膜区进行预测分析.利用同源重组技术,将PbQSOX-HA标签型打靶质粒经限制性内切酶NotⅠ酶切使其线性化,将线性化的质粒电转染至伯氏疟原虫株内并感染小鼠.经乙胺嘧啶筛选耐药型疟原虫血症小鼠,取小鼠外周血进行PCR鉴定,获取PbQSOX-HA标签型疟原虫.培养纯化裂殖体、配子体与动合子阶段的PbQSOX-HA标签型疟原虫,采用蛋白质印迹法与间接免疫荧光实验检测PbQSOX蛋白在伯氏疟原虫中的表达阶段与表达特点.结果 生物信息学分析发现PbQSOX蛋白存在信号肽,不存在跨膜区,蛋白均在细胞膜外表达.经PCR鉴定,PbQSOX-HA标签型打靶质粒与伯氏疟原虫同源重组正确,并成功获得了PbQSOX-HA标签型疟原虫及纯化的PbQSOX-HA标签型裂殖体、配子体与动合子.蛋白质印迹法检测显示PbQSOX蛋白主要在配子体与动合子阶段表达,间接免疫荧光实验结果显示PbQSOX表达于配子体、雄配子、合子、retort与动合子表面.结论 PbQSOX是伯氏疟原虫在有性生殖阶段表达的蛋白,主要表达于配子体、雄配子、合子、retort与动合子表面.     

鸡疟原虫在蚊体寄生各阶段发育规律和形态学观察

为了研究用免疫方法预防疟疾而取得抗原,必须大量培养繁殖疟原虫。目前国内外关于疟原虫的人工离体培养尚未成功,在培养过程中发育各阶段的形态变化规律也缺乏系统的完整资料。为了掌握这些规律以利进行人工培养,我们对疟原虫的发育各阶段的形态变化做了比较详细的观察。当前国内研究疟原虫的动物实验所用虫种有猴疟原虫、鼠疟原虫和鸡疟原虫,这三种虽媒介不同,但其在蚊体的发育规律基本相似,而其中以鸡疟的实验条件最为简便易行。因此我们对鸡疟原虫在伊蚊体内寄生阶段进行了以下实验观察。     

恶性疟原虫顶端膜抗原1基因转染伯氏疟原虫模型的建立

目的：建立恶性疟原虫顶端膜抗原1（AMA-1）基因转染伯氏疟原虫的模型．方法：将含有恶性疟原虫AMA-1基因的重组转染质粒pDB.DTm. DB./AB. AF. DB．用Bgl Ⅰ酶切线性化．伯氏疟原虫经体外培养和分离后进行电转化,转化的原虫经药物筛选后进行PCR检测．结果：PCR检测显示转染伯氏疟原虫存在恶性疟原虫AMA-1基因．结论：成功建立了恶性疟原虫AMA-1基因转染伯氏疟原虫的模型,为进一步研究提供了基础．