人肾间质纤维母细胞培养及血管紧张素Ⅱ2型受体转染表达

目的：体外培养人肾间质纤维母细胞（hRIF)并用腺病毒介导转染表达血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）2型受体（AT2R）。方法：用肾穿刺活检法取慢性肾小球肾炎病人肾组织,以常规组织块贴壁法培养hRIF;构建带AT2R基因的重组复制缺陷型腺病毒载体（AdCMV-AT2R),体外转染hRIF;用RT-PCR方法检测AT2RmRNA表达,免疫组织化学法及蛋白免疫印迹法检测AT2R蛋白表达,流式细胞仪检测AT2R表达0率,同时检测AT1R的表达变化。结果：用肾活检组织成功培养出hRIF,构建的AdCMV-AT2R体外转染培养hRIF表达率为90.57%,以免疫组化、免疫印迹和RT-PCR检测AT2R表明,转染后AT2R表达明显增强。并随表达时间延长而增加,48h为表达峰值。AT2R转染表达不影响AT1R表达,结论：腺病毒载体可较高效率介导AT2R在hRIF的转染表达,ATIR表达不受其影响。转染表达AT2R的hRIF可作为研究AngⅡ在肾间质纤维化中作用的良好细胞模型。     

血管紧张素Ⅱ2型受体基因转染对肾间质纤维化的防治意义

目的 探讨血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2R)基因体外转染人肾间质成纤维细胞(hRIF)后对肾间质纤维化进程的影响。方法 构建AT2R基因腺病毒载体(AdCMV-AT2R),体外转染hRIF,用流式细胞仪、BrdU掺入法检测hRIF增殖。用改良Boyden趋化小室、激光共聚焦显微镜查F-actin检测hRIF迁移。用原位末端标记(TUNEL)、bcl-2和bax mRNA表达检测hRIF凋亡。结果 hRIF转染表达AT2R。S期与G_2、M期细胞比例受血管紧张素(Aug)Ⅱ作用后无明显变化(8.1%对13.9%,P>0.05)。BrdU平均掺入量降低54.2%(P<0.05)。迁移细胞数抑制比例达62.2%(P<0.01)。F-actin表达明显受抑制。TUNEL染色法显示大量凋亡细胞、bcl-2表达无明显变化、bax表达增加76.3%(P<0.05)。结论 hRIF体外转染表达AT2R基因后,明显抑制了细胞的增殖与迁移,促进了细胞凋亡,对肾间质纤维化的防治有积极的作用。     

腺病毒介导hIL-2基因转染膀胱上皮的体内研究

目的:探讨腺病毒介导人IL 2基因转染鼠膀胱移行上皮细胞及其表达的可行性,为膀胱癌的免疫治疗提供实验依据.方法:通过膀胱灌注的方法将重组腺病毒AdhIL-2灌入大鼠膀胱内,分不同时间段获取大鼠膀胱黏膜组织,利用RT PCR的方法检测hIL-2基因在膀胱移行上皮细胞中的表达.结果:腺病毒介导hIL-2在膀胱移行上皮细胞中得到有效表达,基因表达持续时间达到7天.结论:腺病毒是一种有效介导基因的工具,hIL-2在膀胱上皮细胞中的持续表达为膀胱癌免疫治疗提供新的方法.     

腺病毒介导bcl-2基因转染预防肺再灌注损伤

目的 探讨bcl-2基因对体外肺缺血再灌注损伤的保护作用.方法 按肺移植供肺获取和保存方法,对家兔的肺进行获取、保存,然后采用体外循环装置,建立体外肺缺血再灌注损伤模型.共分为3组,分别在手术前48 h从耳背静脉注入生理盐水、含标记基因Laz的腺病毒载体（Ad/LacZ）、重组人bcl-2正义腺病毒载体（Ad/s-bcl-2）.结果 Ad/s-bcl-2可使肺组织中bcl-2 Mrna表达增加,使肺组织中超氧化物歧化酶（SOD）含量升高,丙二醛（MDA）含量降低;使肺动脉压（PAP）降低,肺组织湿干重比降低;降低肺组织中的凋亡细胞数和改善肺组织病理变化.Ad/s-bcl-2组的上述指标均优于生理盐水组和Ad/LacZ组.结论 bcl-2对肺缺血再灌注损伤有明显的保护作用.     

蜂毒素基因重组腺病毒转染对肝癌细胞周期及磷脂酶A2表达的影响

蜂毒素(Melittin,Mel)是一种动物毒素,具有显著的抗肿瘤作用,但其溶血副作用限制了临床应用。为达到减毒增效的目的,将编码蜂毒素的基因置于人甲胎蛋白(AFP)基因启动子后,以复制缺陷型腺病毒为载体构建重组腺病毒。在初步证实该重组腺病毒对AFP阳性肝癌细胞具有特异性杀伤作用的基础上,通过观察其对肝癌细胞周期及磷脂酶A2(phospholipase A2,PLA2)表达的影响,探讨其作用机制。     

腺病毒介导TIMP-2基因转染抑制大鼠腹主动脉细胞外基质降解的实验研究

目的利用大鼠腹主动脉瘤模型，在腹主动脉局部灌注携载基质金属蛋白酶组织抑制剂-2（TIMP-2）基因的腺病毒溶液，应用形态学及组织病理学手段评价其对血管壁基质降解的影响。方法建立大鼠腹主动脉瘤弹力蛋白酶灌注模型，将通过基因重组技术构建成功的腺病毒质粒AdTIMP-2灌注至主动脉局部。2周后处死大鼠，取动脉标本行多聚甲醛灌注固定，常规石蜡包埋，对标本进行大体观察、组织病理学常规及特殊染色观察。结果灌注后14d AdCMV组和PBS组腹主动脉直径分别为（3．52±0．11）mm和（3．43±0．09）mm，明显大于AdTIMP-2组的（2．33±0．06）mm，P〈0．05；腹主动脉直径增加百分比AdTIMP-2组为（48±4）％，明显低于AdCMV组的（120±6）％和PBS组的（118±5）％，P〈0．05；AdTIMP-2组的8只大鼠均未见腹主动脉瘤形成，而AdCMV组和PBS组8只大鼠均见主动脉形成瘤样扩张；AdTIMP-2组中层弹力纤维及胶原纤维保存较完整，破坏较轻，在动脉外膜可见炎症细胞浸润。结论腺病毒介导的TIMP-2基因转染可以恢复由蛋白溶解酶引起的细胞外基质降解，阻止动脉瘤的形成，为治疗腹主动脉瘤提供了新的策略。     

骨形成蛋白-2基因转染人骨髓间质干细胞诱导异位成骨的实验研究

目的 评价腺病毒介导的人骨形成蛋白—2基因(Adv—hBMP—2)转染人骨髓间质干细胞(MSCs)的诱导成骨能力。方法 从人骨髓中分离培养获取MSCs，分为三组：①Adv—hBMP—2转染细胞组；②Adv—βgal转染细胞组；③未转染细胞组。分别于体外行western immunoblot试验、碱性磷酸酶(ALP)和Von Kossa染色、ALP定量测定，以及裸鼠肌内诱导成骨试验。共9只裸鼠，双例股后肌群内注射，每组6例。结果 Adv—hBMP—2组MSCs可分泌BMP—2蛋白；转染后第9天ALP染色多数细胞为阳性，其它两组ALP染色阳性细胞少见；ALP活性第3天开始升高，12天达高峰为14．76单位，与其它两组比较有统计学意义(P＜0．05)；于第21天后出现钙结节，而其它两组未见。裸鼠肌内注射后4周Adv—hBMP—2组X线片均有异位成骨，Adv—βgal转染细胞组未见明显成骨，未转染细胞组仅有少量骨形成。组织学检查发现：Adv—hBMP—2组也可见典型的板层骨和骨髓腔形成，Adv—βgal组主要为纤维组织，未转染组也可见散在骨小粱形成。结论 Adv—hBMP—2基因转染可诱导人骨髓问质干细胞成骨。     

XGD-1对人外周血T淋巴细胞增殖和IL-2R表达的影响

目的 探讨XGD—l的免疫抑制作用及其作用机理。方法 不同浓度的XGD—l作用于植物血凝索(PHA)和刀豆索A(ConA)诱导的正常人外周血T淋巴细胞，共同培养48h和72h，用改良MTT法观察XGD—l对人T淋巴细胞增殖的影响，用流式细胞术检测XGD—l对T淋巴细胞表面IL—2R表达的影响；同时观察联合应用CsA和XGD—l对细胞增殖及IL—2R表达的影响。结果 XGD—l对PHA和ConA诱导的正常人外周血T淋巴细胞增殖有明显的抑制作用，其作用与药物浓度有关，在一定剂量范围内，抑制作用随XGD—l剂量的递增而加强；XGD—l对PHA和ConA激活的T淋巴细胞表面IL-2R的表达有显著抑制作用，阳性率从正常对照活化细胞的47．67％降为25．03％；联合应用CsA，上述抑制作用增强。结论 XGD-l具有免疫抑制作用，能降低IL-2R表达，可能是其免疫抑制作用的重要机理之一。     

腺病毒介导的骨形态发生蛋白2基因转染对成骨及血管化的影响

目的 观察骨形态发生蛋白2(BMP-2)基因转染人骨髓基质干细胞(hBMSC)对诱导成骨及血管化的影响，方法 基因转染后，检则骨钙素、Ⅰ型胶原和血管内皮生长因子(VEGF)的表达。并利用转染后的培养液上清诱导小鼠成纤维细胞(L929)。然后将转染后细胞接种到PLA／PCL(聚乳酸／聚己内酯)支架上，然后扫描电镜观察。结果 BMP-2基因转染后，可诱导hBMSC有L929骨钙索、Ⅰ型胶原呈阳性表达，VEGF的表达明显增高。转染细胞在支架中上生长良好，能量谱仪测得钙质分泌。蛋白印迹法检测到培养液中有BMP-2蛋白产生。结论 BMP-2基因转染可诱导hBMSC成骨转化，且通过上调VEGF表达促进血管化，复合转染后细胞构建的组织工程骨对治疗骨缺损具有重要意义。     

过氧化物酶体增殖物活化受体γ激动剂对人肾间质成纤维细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)激动剂在抗肾间质纤维化方面的潜在作用.方法原代培养正常人肾间质成纤维细胞(HFB),PPARγ配体15-脱氧前列腺素J2(15d-PGJ2)和PPARγ激动剂TZDs(曲格列酮和齐格列酮)作用细胞24至72 h.应用台盼蓝染色进行活细胞计数,四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)检测细胞增殖情况,应用流式细胞技术检测细胞凋亡和细胞周期.结果在PPARγ激动剂作用下,HFB的活细胞数较对照组明显减少(P＜0.05).MTT检测发现PPARγ激动剂能明显抑制H邝细胞增殖(P＜0.05).流式细胞技术检测,PPARγ激动剂处理组细胞凋亡明显,与对照组比较差异有显著性意义.凋亡率分别是对照组(3.49±0.60)%,15d-PGJ2组(14.07±0.24)%,齐格列酮组(13.46±0.81)%,曲格列酮组(14.78±1.17)%,与对照组比较,各用药组P分别＜0.01,＜0.01,＜0.05.PPARγ激动剂处理48～72 h后用流式细胞仪观察到G0/G1细胞数明显增加,与对照组比较差异显著(P均＜0.01).结论PPARγ激动剂可以促进HFB细胞凋亡,通过G1期停滞抑制其增殖,提示PPARγ可能作为防止肾间质纤维化的一个潜在的治疗靶目标.     

人骨形态发生蛋白2腺病毒表达载体转染人骨髓基质干细胞和对其增殖及分化的影响

目的：研究人骨形态发生蛋白-2腺病毒表达载体(Ad-BMP-2)转染人骨髓基质干细胞(hBMSC)对其增殖及分化的影响。方法：利用免疫组化、原位杂交染色和蛋白印迹法检测转染后细胞。BMP-2的表达。流式细胞仪和ALP活性测定分析BMP-2基因转染对细胞增殖、分化的影响。结果：转染后，hBMP-2基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达。蛋白印迹法检测到培养液中有BMP-2蛋白阳性表达，S期细胞比例和ALP活性明显增高。结论：Ad-BMP-2可高效转染hBMSC，且促进细胞增殖和成骨转化。     

shRNA靶向抑制COX-2基因表达对胃癌细胞SGC-7901增殖的影响

目的 探讨环氧化酶-2(COX-2)短发夹RNA(shRNA)对胃癌细胞SGC-7901的生长和细胞周期的影响.方法 构建COX-2基因的特异性小RNA干扰质粒,构建靶向抑制COX-2基因的重组表达载体pshRNA-COX-2.实验分3组:未转染胃癌细胞组,阴性对照HK组,pshRNA-COX-2转染组.用质脂体lipofectamine~(TM) 2000转染胃癌细胞SGC-7901,RT-PCR和Western blot分别检测COX-2基因mRNA和蛋白表达情况,流式细胞术检测细胞周期,细胞计数检测细胞的生长变化.结果 与阴性对照组相比,pshRNA-COX-2重组表达载体抑制COX-2 mRNA及蛋白表达的抑制率分别为70.1%和43.2%;G_0～G_1期细胞由61.5%上升至70.2%,S期细胞由27.3%下降至21.7%;细胞生长明显减慢.结论 pshRNA-COX-2重组表达载体能显著抑制COX-2的表达,从而抑制胃癌细胞生长.     

肾细胞癌中bcl-2、p53、增殖细胞核抗原表达与细胞增殖和凋亡

目的 探讨肾细胞癌(RCC)中bcl—2、p53、增殖细胞核抗原(PCNA)表达与细胞增殖、凋亡及病理参数之间的关系。方法 应用链霉亲和素辣根过氧化物酶(SABC)法分析34例RCC标本中bcl—2、p53和PCNA蛋白的表达，应用末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷苦(dUTP)缺口末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡。结果 34例RCC标本中，15(44．1％)例bcl-2阳性表达，表达阳性率与增殖指数(PI)、凋亡指数(AI）及RCC病理学参数无关；仅有3例p53表达阳性；PI为6．0％--24．0％(平均为12．3％)，AI为2．0％--8．0％(平均为5．4％)；PI与肿瘤分级、分期密切关系，AI与肿瘤分级有明显关系。结论 明显增高的PI和AI与肿瘤恶性表型有关，提示在RCC中肿瘤细胞过度增殖伴有频繁的凋亡发生。     

凋亡抑制基因bcl—2产物在肾细胞癌中的表达及其意义

凋亡抑制基因ｂｃｌ２产物在肾细胞癌中的表达及其意义王思齐刘同才张铭铮王立忠李振华李芳李书章孔垂泽李泽良应用免疫组织化学方法和微波炉抗原修复法观察ｂｃｌ２基因产物在肾癌中的表达及其与肾癌临床分期、组织病理分型、分级和疾病预后的关系。材料与方法收集我...     

腺病毒介导反义细胞外信号调节蛋白激酶2基因转染可延缓移植肾慢性纤维化进程

严重制约肾移植受者长期存活的重要因素是慢性移植。肾纤维化。慢性移植肾纤维化由免疫学和非免疫学因素引起,临床上一般通过调整免疫抑制方案和其他辅助方法予以治疗,目前还没有直接对移植肾纤维化起作用的药物或治疗方案。我们的研究试图寻找可以保护移植物,阻止或延缓移植肾纤维化的方法和相应的治疗靶点。     

腺病毒介导BMP-2联合低氧诱导因子1α突变型与单基因BMP-2分别转染BMSCs后成骨效应的比较研究

目的比较腺病毒载体Ad-BMP-2-内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)-低氧诱导因子1α突变型(hypoxia inducible factor 1αmu,HIF-1αmu)与Ad-巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)-BMP-2-IRES-人源化海肾绿色荧光蛋白1(human renilla reniformis green fluorescent protein 1,hrGFP-1)分别转染BMSCs后的成骨效应,优化成骨细胞种子来源。方法取1月龄新西兰大白兔骨髓分离培养BMSCs。取第3代BMSCs进行病毒液转染,根据转染病毒液不同将实验分为4组,A、B、C组分别采用感染复数(multiplicity of infection,MOI)为50、100、150和200的Ad-BMP-2-IRES-HIF-1αmu、Ad-CMV-BMP-2-IRES-hrGFP-1、Ad-CMV-IRES-hrGFP-1(空腺病毒载体)转染细胞,D组为未被转染的BMSCs。选择最佳MOI值进行观察。转染后采用免疫组织化学染色检测BMP-2表达,Western blot检测BMP-2和HIF-1α蛋白表达,ALP活性测定和钙结节茜素红染色检测细胞成骨分化能力。结果 A、B、C组最佳MOI值分别为200、150和100。免疫组织化学染色示,A、B组BMP-2染色呈阳性,C、D组呈阴性;A组阳性细胞数明显多于B组(P<0.05)。Western blot检测示,A、B组BMP-2蛋白表达明显高于C、D组(P<0.05),A组高于B组(P<0.05);A组HIF-1α蛋白表达明显高于其余3组(P<0.05),其余3组间差异无统计学意义(P>0.05)。A、B组ALP活性明显高于C、D组(P<0.05),A组高于B组(P<0.05)。茜素红染色示,A、B组可见明显钙结节,C、D组未见钙结节形成;且A组钙结节数量多于B组(P<0.05)。结论单载体双基因Ad-BMP-2-IRES-HIF-1αmu与单载体单基因Ad-CMV-BMP-2-IRES-hrGFP-1分别转染兔BMSCs后,前者BMP-2和成骨效应表达均高于后者。     

成人特发性膜性肾病患者肾组织中PLA2R表达与免疫抑制治疗疗效关系的meta分析

目的:探讨肾活检组织表达PLA2R对成人特发性膜性肾病免疫抑制治疗疗效的影响。方法:检索中国知网、万方、维普、中国临床注册中心、中国生物医学文献数据库(CBM)、PubMed、Embase、Cochrane图书馆、Web of science、美国临床注册中心等数据库中自建立至2021年6月国内外公开发表的关于肾活检组织PLA2R表达与特发性膜性肾病免疫抑制治疗的相关文献。根据纳入和排除标准筛选文献。采用非随机对照研究的评价量表(NOS)对纳入研究质量进行评估。汇总各研究的尿蛋白总缓解率,整理为四表格整理来估算粗RR(HR)以及95%CI值。通过RevMan 5.3和Stata 16软件进行meta分析。并采用依次减少一篇文献的方法进行敏感性分析,通过Egger漏斗图检验文献发表偏倚。结果:共筛选出10篇文献。累计病例570例,其中PLA2R阳性表达组患者434例,阴性组136例。异质性检验提示存在明显的异质性(Cochrane-Q为I²=85.8%,P=0.000)。通过敏感性分析确定异质源,删除异质研究后,余下研究异质性检验提示不存在异质性(Cochrane-...     

SST2R与DPC4、p53、Ras基因在胰腺癌中表达的相关性研究

有研究结果表明，DPCA、Ras、p53突变基因是肿瘤血管形成的重要突变基因；人体胰腺癌细胞SST2R基因的表达变化与肿瘤血管形成密切有关的促血管生成因子如转化生长因子（TGF）-β有关。本研究旨在分析它们之间的相关性，探讨SST2R基因表达变化与胰腺肿瘤血管发生机制的关系。     

透明质酸水凝胶包封对携带BMP-2基因的腺病毒转染骨髓间充质干细胞增殖活性及其表达的影响

目的:探讨携带骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)基因的腺病毒转染骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)后应用透明质酸水凝胶(hyaluronic acid hydrogel,HAH)包封对BMSCs增殖能力及其表达目标蛋白BMP-2的影响。方法:体外分离、提取、鉴定BMSCs,并将提前构建好的Ad-BMP-2转染BMSCs并使用HAH进行包封,激光共聚焦显微镜下观察Ad-BMP-2转染的BMSCs在HAH包封下的三维形态。实验分为4组(各组培养条件无差异):A组(未转染BMP-2的BMSCs);B组(HAH+未转染BMP-2的BMSCs);C组(转染BMP-2的BMSCs);D组(HAH+转染BMP-2的BMSCs)。分别一周内不同时相点(1d、2d、3d……7d)使用CCK-8法检测各组OD值来评价细胞增殖活性;ELISA法检测各组BMP-2的量(pg/ml)来评价目标蛋白的表达状况。结果 :激光共聚焦显微镜三维重建可观察到BMSCs可在HAH中任意平面铺展,有充足的生长空间。BMSCs的增殖活性检测显示,随着培养时间延长,细胞增殖活性逐渐增强,A组、C组4d后的OD值较1d时明显增大(P0.05);B组和D组5d后的OD值较1d时明显增大(P0.05);至7d时,A组OD值为1.283±0.061,B组为1.844±0.075;C组为1.570±0.099;D组为1.976±0.142,包封HAH的B、D组OD值均优于没有包封HAH的A、C组(P0.05)。BMP-2的表达在A、B组较弱,不同时间点间无显著性差异(P0.05);C、D组的BMP-2表达各时间点均明显高于A、B组(P0.05);从4d时起,C、D两组的BMP-2表达显著增加(与1d时比较P0.05),且D组明显优于C组,差异有显著性(P0.05)。结论 :三维环境下(即包封HAH后),Ad-BMP-2转染的BMSCs不仅有较强的增殖活性;而且对BMP-2的表达具有一定的促进作用。