猪囊尾蚴抗原cC1在巴斯德毕赤酵母中的表达

目的　克隆并在巴斯德毕赤酵母中表达猪囊尾蚴抗原cC1。方法　用PCR法在cC1cDNA5′端引入所需限制酶位点和酵母分泌信号肽 ,与酵母表达载体pPIC9k重组 ,构建表达质粒 pPIC9k -cC1。采用电穿孔法转化酵母菌SMD116 8,在MD平板上筛选重组克隆 ,用G4 18快速筛选高拷贝转化子 ,阳性克隆经甲醇诱导表达后 ,培养上清SDS -PAGE和Westernblot鉴定。结果　PCR产物经测序无误 ,pPIC9-cC1和 pPIC9k -cC1酶切分析与预期相符 ,获取 86 3个酵母阳性重组克隆及9个高拷贝转化子。表达产物cC1的分子量约 4 2kDa ,占分泌总蛋白 80 %以上 ,产物浓度为 2 0 0 - 35 0mg/L。Westernblot证实表达产物具有天然cC1分子的免疫原性。结论　在巴斯德毕赤酵母中成功表达了猪囊尾蚴cC1抗原 ,为进一步研究打下基础     

猪囊尾蚴抗原cC1在大肠杆菌中的克隆及高效表达

[目的 ]在大肠杆菌中克隆及高效表达猪囊尾蚴抗原cC1。 [方法 ]将cC1cDNA片段以BamHI和PstI克隆到pGEM 3Z载体 ,改换限制性内切酶位点成BamHI和PstI,加上人工接头PstI BamHI XhoI后 ,克隆到pGEX 5T ,构建重组原核表达载体pGE X5T cC1。 [结果 ]培养 3h、IPTG诱导 6h ,cC1表达量最高 ,表达量占细菌总量的 5 7% ,Westernblotting结果表明猪囊尾蚴抗原cC1蛋白与囊尾蚴病猪血清有特异性的结合条带。 [结论 ]猪囊尾蚴抗原cC1在大肠杆菌中获得高效表达。     

猪囊尾蚴特异性抗原cC1重组耻垢分枝杆菌疫苗的构建与鉴定

目的 目的 构建表达猪囊尾蚴cC1抗原的重组耻垢分枝杆菌疫苗。方法 方法 提取pET28a?cC1质粒DNA, 用xho I和 BamH I双酶切, 用Klenow酶补平xho I酶切末端, 同时提取pMV261穿梭质粒载体, 用Hind III和BamH I双酶切, 用Klenow 酶补平Hind III酶切末端, 纯化后的酶切产物通过T4连接酶连接, 构建pMV261?cC1穿梭质粒, 测序验证正确后, 将 pMV261cC1穿梭质粒经电穿孔法转化耻垢分枝杆菌, 构建重组耻垢分枝杆菌, 经热诱导后, 以猪囊尾蚴病患者血清为一抗 进行Western?blotting鉴定。此外, 比较正常耻垢分枝杆菌和重组cC1耻垢分枝杆菌生长状态并绘制生长曲线。结果 结果 构 建的重组穿梭载体经酶切、 测序验证正确。构建的重组耻垢分枝杆菌经热诱导后, SDS?PAGE电泳分析显示, 在40 kDa处 有外源性蛋白表达, 与预期值相符。Western?blotting显示其可被猪囊尾蚴病患者血清识别, 表明cC1抗原基因在耻垢分枝 杆菌中表达成功。重组耻垢分枝杆菌与正常耻垢分枝杆菌的增殖特性无明显差异。结论 结论 成功构建了表达猪囊尾蚴特 异性抗原cC1的重组耻垢分枝杆菌疫苗。     

猪带绦虫抗原基因TS76的克隆及原核表达

目的　测定和分析自猪囊尾蚴表达型cDNA文库中筛选出的cDNA克隆 (TS76 )的序列 ,并进行该片段的原核表达研究。方法　采用PCR扩增重组 (噬菌体 (TS76中的TS76cDNA片段 ,亚克隆至 pUC18,得到的重组子用于测序 ,并对测定结果进行分析及同源性比较 ;将TS76片段亚克隆到原核表达载体pGEX - 1(T中 ,免疫印迹方法筛选得到能正确表达TS76片段的重组子 pGTS76 ;制备pGTS76原核表达产物 ,进行浓度梯度SDS -PAGE和Westernblotting分析。 结果　TS76克隆含 5 16对核苷酸 ,编码含 83个氨基酸残基的多肽 ,与EMBL数据库中的猪囊虫免疫原性蛋白质mRNA有 383bp的同源区域。重组质粒在大肠杆菌中表达的融合蛋白分子量为 34KD ,能与抗猪囊尾蚴兔血清产生很强的免疫反应。结论　分离到一个编码具较强免疫原性猪囊尾蚴抗原的基因。     

恶性疟原虫主要裂殖子表面蛋白1C末端19ku片段(MSP1-19)的表达及免疫效应检测

目的 探讨恶性疟原虫主要裂殖子表面蛋白1C末端19ku片段（MSP1-19）重组蛋白的免疫活性。方法 利用毕赤酵母高效表达系统分泌表达MSP1-19，表达产物纯化后免疫新西兰兔，3次免疫后ELISA检测其血清中IgG滴度的变化，观测重组MSP“。免疫效应。结果 MSP1-19在毕赤酵母高效表达；重组MSP1-19免疫后，兔血清中IgG滴度的变化与对照组有显著差异。结论 MSP1-19重组蛋白具有较好的免疫原性。     

猪囊尾蚴排泄分泌抗原M13h基因的克隆及原核表达

目的 研究猪囊尾蚴排泄分泌抗原M13h基因的克隆及原核表达. 方法 利用RT-PCR技术从猪囊尾蚴中扩增排泄分泌抗原M13h蛋白去除信号肽序列的基因,对其进行序列分析,并亚克隆至原核表达载体pET43a上,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),用IPTG诱导重组菌株表达融合蛋白,并用Western blot对纯化后的融合蛋白进行鉴定. 结果 从猪囊尾蚴中克隆到去除信号肽序列的M13h的基因,其序列长度为204 bp,包含198 bp的编码区,与GenBank中西班牙分离株的核苷酸和氨基酸序列的同源性均为100%,与韩国的M13h蛋白的核苷酸与氨基酸序列同源性分别为95.7%和95.3%;经SDS-PAGE电泳鉴定,重组质粒表达产物分子质量单位约74 ku,其中M13h基因表达蛋白的分子质量单位为7.87 ku,与预期结果一致;经Western blot检测,纯化后的复性蛋白质可与兔抗全囊囊尾蚴血清发生特异性反应. 结论 pET43M13h重组质粒表达产物具有较高的保守性和特异性,可用于猪囊尾蚴病的免疫诊断.     

猪带绦虫六钩蚴表膜结合蛋白45WB2基因在毕赤酵母中的表达

目的 从猪带绦虫六钩蚴总RNA中扩增45WB2基因,并在甲醇酵母分泌表达载体pPIC9K中获得高效表达。 方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR), 从孵化激活的六钩蚴克隆获得459 bp的基因, 亚克隆至酵母分泌表达载体pPIC9K中, 经测序验证读码框正确后, 重组质粒电转化毕赤酵母SMD1168菌株。用PCR方法检测结果表明, 目的基因整合进毕赤酵母染色体DNA中。 重组菌株用1%甲醇诱导, 分别取诱导 72和96 h的上清和沉淀进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析。 结果 重组菌株在毕赤酵母中的表达蛋白分子量为Mr 16 000, 表达产物占上清总蛋白量的32.8%, 且能被猪囊尾蚴病患者血清识别。 结论 基因在毕赤酵母中成功表达, 表达产物有望作为免疫原用于猪囊尾蚴病的免疫预防。     

细粒棘球绦虫(中国大陆株)诊断抗原P-29基因的表达、纯化及免疫原性初步分析

目的对细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)诊断抗原P-29(diagnostic antigen P-29)重组质粒进行原核表达、纯化,并初步分析重组蛋白的免疫原性。方法从重组质粒EgP-29/pGEM-T中获取诊断抗原P-29基因,亚克隆于表达载体pET-28a构建基因工程菌株,并表达、纯化重组蛋白,经Western-blot、ELISA分析重组蛋白的免疫原性。结果成功构建原核重组表达载体EgP-29/pET-28a/BL21(DE3)plysS,并纯化出浓度较高的重组蛋白。ELISA检测显示,用表达、纯化的重组蛋白免疫小鼠,诱导产生了特异性抗体IgG,Western-blotting鉴定该抗体能识别重组抗原及天然抗原原头蚴。结论重组蛋白具有良好的免疫原性。     

华支睾吸虫特异性富甘氨酸2a类抗原基因的克隆、表达和免疫学诊断价值评价

目的采取免疫学方法筛选华支睾吸虫成虫cDNA表达文库,寻找新的抗原基因。方法使用华支睾吸虫病人混合血清以及华支睾吸虫排泄分泌抗原的免疫小鼠血清,分别免疫学筛选华支睾吸虫成虫λ ZAP cDNA表达文库;将阳性噬菌体克隆、测序以及核苷酸序列比对分析;将目的基因的编码区克隆至原核表达质粒pET28a(+)中,采用制备不带N端融合标签的天然蛋白的策略表达融合蛋白,使用组氨酸标签亲和纯化柱（Ni NTA树脂）纯化融合蛋白;采用间接ELISA法,检测血清中的特异性抗体,共检测35例华支睾吸虫虫卵粪检阳性血清,36例正常人血清,15例日本血吸虫、15例卫氏并殖吸虫和13例猪囊尾蚴病人血清,评价重组蛋白的免疫学诊断价值。结果发现华支睾吸虫特异性富甘氨酸2a（GRA2a）类抗原基因家族,将其中的Cs4抗原基因植入重组表达质粒pET28a(+)的NcoI位点,成功实现融合蛋白的表达,并进一步纯化得到可溶性重组蛋白。采用间接ELISA法检测血清中的特异性抗体,该ELISA法的敏感性为80.0%,特异性为97.2%,总符合率为88.7%;日本血吸虫、卫氏并殖吸虫和猪囊尾蚴病人血清的假阳性率分别为6.7%、6.7%和7.7%。经核苷酸序列同源性比较,华支睾吸虫GRA2a类抗原是迄今为止尚未进行功能研究的华支睾吸虫特异性抗原。结论发现华支睾吸虫GRA2a类抗原基因家族;成功构建重组表达质粒,并表达、纯化出可溶性重组蛋白;该抗原具有较高的免疫学诊断价值。     

弓形虫复合抗原基因P30-ROP2在毕赤酵母中的表达、纯化与鉴定

目的构建含弓形虫主要表面抗原P30与致密颗粒蛋白ROP2复合基因重组质粒,并在毕赤酵母中表达、纯化与鉴定。方法用亚克隆技术把P30-ROP2复合基因克隆入表达载体,构建酵母表达载体pGAPZαA-P30-ROP2;线性化重组酵母表达载体,电穿孔法导入毕赤酵母GS115中,抗生素Zeocin筛选、PCR法鉴定阳性转化子;酵母工程菌大量摇瓶表达,纯化产物,免疫活性鉴定。结果获得pGAPZαA-P30-ROP2重组表达载体,SDS-PAGE和Western Blot结果显示P30-ROP2复合基因表达蛋白产物分子量约为66kD,具有一定的免疫活性。结论弓形虫复合抗原基因P30-ROP2在毕赤酵母中成功分泌表达,表达产物具有免疫活性,为弓形虫病诊断抗原及疫苗研制奠定基础。     

猪囊尾蚴抗原cC1与γ-干扰素融合蛋白在大肠杆菌中的表达

目的： 构建含猪囊尾蚴抗原ｃ Ｃ１ ｃ Ｄ Ｎ Ａ 与猪γ 干扰素（ Ｉ Ｆ Ｎ γ） 的融合表达载体。方法： 从已克隆的含人猪囊尾蚴共通抗原ｃ Ｃ１ 的质粒中, 用 Ｐ Ｃ Ｒ 方法扩增出含酶切位点及接头的ｃ Ｃ１ 和 Ｉ Ｆ Ｎ γｃ Ｄ Ｎ Ａ, 两ｃ Ｄ Ｎ Ａ 经接头融合后构建成融合形式的原核表达载体转入大肠杆菌 Ｘ Ｌ Ｂｌｕｅ。结果： 经酶切分析, 表明重组载体中含１５ｋｂ 插入片段。 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 显示一５２ ｋ Ｄａ 的诱导产物。结论： 猪 Ｉ Ｆ Ｎ γ和猪囊尾蚴抗原ｃ Ｃ１ 融合ｃ Ｄ Ｎ Ａ 在大肠杆菌中获得表达。     

以融合蛋白为抗原的简化Western blot法诊断囊虫病

目的：为囊虫的诊断提供简便有效的方法。方法：猪囊尾蚴cDNA表达文库中筛选出的β－半乳糖苷糖－猪囊虫cDNA编码的融合蛋白为抗原，进行简化的Westernblot分析。结果：四个克隆的融合蛋白（cC1、cC2、cP1和cH1）联合使用，检测124例人囊虫病血清中的抗囊尾蚴IgG抗体，阳性率达93．7％，三个克隆的融合蛋白（cC1、cC2、和cP1）联合使用，检测38例猪囊虫病血清中的相应抗体，阳性率达100％，均高于各克隆融合蛋白单独使用的阳性率，且与其他寄生虫病血清无交叉反应。结论：以融合蛋白为抗原所进行的Westernblot分析具有高度灵敏性和特异性，且简便易操作。     

日本血吸虫信号蛋白14-3-3在毕赤酵母菌中的分泌表达及其抗原性分析

目的 在毕赤酵母菌（Pichia pastoris）表达系统中表达日本血吸虫信号蛋白14-3-3（Sj14-3-3），并与原核表达rSj14-3-3比较其抗原性。 方法 以重组质粒pET28a-rSj14-3-3为模板，PCR扩增Sj14-3-3基因，将特异片段连接到pMD18-T载体, DNA序列分析后，亚克隆目的片段Sj14-3-3至酵母菌分泌表达载体pPICZαB。测序正确后，重组质粒经电转化转染至毕赤酵母菌X-33菌株，经抗生素Zeocin筛选得到高拷贝转化子。经甲醇诱导表达，取诱导上清进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 和蛋白质印迹法(Western blotting) 分析。 用间接ELISA法比较毕赤酵母菌表达的rSj14-3-3和原核表达rSj14-3-3检测血吸虫病患者血清抗体的特异性和敏感性。 结果 目的基因已在酵母菌基因组中得到整合, PCR扩增得到约1 300 bp的片段。 经甲醇诱导，Sj14-3-3表达并分泌到培养上清中。 表达产物经SDS-PAGE 测定为 Mr 35 000。Western blotting 结果显示，Mr 35 000 蛋白可被Sj14-3-3单克隆抗体识别，表明该真核表达产物具有免疫反应性。间接ELISA检测结果表明，该重组蛋白检测36份急性血吸虫病患者血清rSj14-3-3抗体，阳性率为81％。与12份华支睪吸虫感染者血清未见交叉反应, 32份健康人血清假阳性反应率为9.3％。以原核表达的rSj14-3-3为抗原，间接ELISA检测，36份急性血吸虫病患者血清的 rSj14-3-3 抗体阳性率为88.9％；与12份华支睪吸虫感染者的交叉反应率为16.7％, 32份健康人血清假阳性反应率为12.5％，其差异均无统计学意义（P＞0.05）。 结论 在毕赤酵母菌中成功表达了Sj14-3-3，培养上清中产物丰度较高，且免疫反应性良好。     

猪囊尾蚴抗原与猪白细胞介素-4基因融合DNA疫苗载体的构建

目的： 为增强猪囊尾蚴抗原ｃ Ｃ１ 的免疫保护作用而构建一表达猪白细胞介素 ４（ Ｉ Ｌ ４）与 ｃ Ｃ１ 抗原融合蛋白的 Ｄ Ｎ Ａ 疫苗载体。方法： 通过聚合酶链反应（ Ｐ Ｃ Ｒ）,分别扩增猪 Ｉ Ｌ ４ｃ Ｄ Ｎ Ａ 和ｃ Ｃ１ｃ Ｄ Ｎ Ａ 片段并进行融合,获得的嵌合基因 Ｉ Ｌ ４ｃ Ｃ１ 中含有１０ 个氨基酸的中间接头序列,同时对其５’ Ａ Ｕ Ｇ 侧翼序列进行翻译优化突变。结果：经酶切鉴定,证实有一１．５ ｋｂ 的片段插入载体,其 Ｄ Ｎ Ａ 序列分析结果与文献报道和实验设计完全一致。结论：表达猪 Ｉ Ｌ ４ 与猪囊尾蚴抗原ｃ Ｃ１ 融合蛋白的 Ｄ Ｎ Ａ 疫苗载体构建成功。     

Induction of neutralizing antibodies and partial protection from viral challenge in Macaca fascicularis immunized with recombinant dengue 4 virus envelope glycoprotein expressed in Pichia pastoris

A recombinant vaccine that expresses the envelope (E) gene of dengue virus type 4 was tested for immunogenicity and protection in Macaca fascicularis. One hundred micrograms of semipurified recombinant E protein (E4rec) expressed in Pichia pastoris was used to immunize three animals. Neutralizing antibodies to dengue 4 virus with a titer of 1:30 were detected in all immunized monkeys prior to challenge. Animals were challenged with 10(5) plaque-forming units of dengue 4 virus. One vaccine-immunized monkey was protected from viremia, while the other two were partially protected. Monkeys immunized with E4rec elicited the highest neutralizing antibody titers (P < 0.05) ranging from 1:85 to 1:640 at day 30. In both immunized and control animals, the longest duration of viremia correlated with earliest and highest level of IgM antibody to dengue virus. The vaccinated animals showed anamnestic antibody responses upon virus challenge, indicating successful priming by the recombinant vaccine. Our results suggest that E4rec expressed in P. pastoris can provide partial protection against viremia. However, the results were not effective enough to use it as a vaccine candidate. Further work is required to improve the quality of the immunogen.