实时荧光定量RT-PCR检测乳腺癌VEGF mRNA的表达

目的：建立实时荧光定量逆转录一多聚酶链反应（real—timequantitative,RT—PCR）检测乳腺癌患者肿瘤组织VEGFmRNA表达的方法,并验证其与免疫组织化学LsAB方法检测VEGF蛋白表达的相关性。方法：提取组织总RNA,逆转录成mRNA,采用实时荧光定量RT—PCR检测44例乳腺浸润性导管癌、25例癌旁正常小叶组织、13例乳腺良性疾病组织中VEGFmRNA表达;采用免疫组织化学LSAB法和彩色图像病理分析系统半定量检测其VEGF蛋白表达。结果：乳腺癌组织中VEGFmRNA表达水平显著高于癌旁和良性病组织（｜P〈0．001）,而后两者之间无明显差异（P〉0．05）;VEGF蛋白表达在癌组织,癌旁和良性病组中的分布特点与VEGFmRNA完全一致。结论;本研究所建立的用于检测人乳腺组织VEGFmRNA表达的实时荧光定量RT—PCR方法,是一种快速有效、灵敏度高、特异性好的定量检测方法,与免疫组化LSAB方法检测的VEGF蛋白表达具有良好相关性,在乳腺癌的早期诊断和良恶性鉴别诊断中具有重要的参考价值。     

实时荧光定量RT-PCR检测食管癌Survivin mRNA的表达

SurvivinmRNA是近年来发现的一种新的凋亡抑制因子,属于凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosisproteins,IAP)家族的新成员,具有抑制细胞凋亡和调节细胞增殖的双重作用[1]。Survivin选择性地表达于胚胎组织和人类大多数肿瘤组织,而在正常人终末分化组织中不表达[2,3]。对Survivin的     

实时荧光定量RT—PCR定量分析mRNA表达水平原理及应用

实时荧光定量RT—PCR技术是一种新近发展起来定量检测mRNA表达水平的灵敏方法。本介绍了目前应用的四种荧光定量RT—PCR反应系统：即水解探针、杂交探针、DNA—染料结合和分子灯标RT—PCR反应系统，并对实时荣光定量RT—PCR反应系统的实验设计原则及所需仪器进行了介绍。     

实时荧光定量RT—PCR检测结直肠癌外周血hTERT mRNA的表达及临床意义

结直肠癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,死亡率较高。在常规影像学发现肿瘤转移之前检测到外周血中隐匿存在的肿瘤细胞对预测肿瘤复发、转移、指导临床治疗等方面具有重要意义。端粒酶与细胞恶变、肿瘤的发生发展密切相关,而端粒酶催化亚基（hTERT）可能在端粒酶活性调节中起重要作用。为此,本研究采用实时荧光定量PCR检测结直肠癌外周血hTERTmRNA的水平,探讨其在直肠癌中的表达及意义。     

实时荧光定量PCR检测肝癌组织中早期B细胞因子3 mRNA表达水平

目的 建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR(FQ-RT-PCR)检测肝组织中早期B细胞因子3(early B-cellfactor 3,EBF3)tuRNA含量的方法,探讨EBF3 mRNA在肝癌中的检测意义.方法 在EBF3基因第85,第9外显子区,在内参β2M第1和第2外显子区设计特异性引物,实时检测PCR产物的荧光强度,以各自标准品建立标准曲线,由软件自动计算出待测样本中EBF3及β2M mRNA含量,以EBF3 mRNA和β2M mRNA含量的比值进行EBF3 mRNA表达水平评价.结果 FQ-RT-PCR检测EBF3 mRNA含量线性范围为3.08×107～3.08×1012copies/L,批内和批间变异系数分别为8.6%和13.7%.18例肝癌和配对远端肝组织中EBF3 mRNA与β2M mRNA的对数比值分别为0.52±0.17和0.28±0.23,差异有统计学意义(t=3.56,P=0.0011).结论 FQ-RT-PCR检测EBF3 mRNA含量的方法具有较好的检测灵敏度和重复性,适用于临床研究.     

实时荧光定量PCR检测乳腺癌组织中KLK4 mRNA表达

目的探讨KLK4基因在人乳腺癌组织中表达的临床意义。方法用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)的方法检测39例乳腺癌组织和25例正常组织中KLK4 mRNA的表达,以及mRNA表达量与雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、CerbB-2及肿瘤的转移情况进行相关性分析。结果正常乳腺组织和癌组织KLK4 mRNA的相对表达水平分别为0.0120±0.0044和0.0272±0.0067,两者差异显著(P<0.01);乳腺癌组织中KLK4的相对表达水平在ER( )和ER(-)组分别为0.0269±0.0070和0.0276±0.0067;在PR( )和PR(-)组分别为0.0270±0.0065和0.0275±0.0081;在CerbB-2( )和CerbB-2(-)组分别为0.0270±0.0064和0.0301±0.0074;在肿瘤有、无转移组分别为0.0258±0.0061和0.0276±0.0066,各组间KLK4mRNA表达水平均无显著性差异(P>0.05)。结论在乳腺癌组织中KLK4 mRNA的表达水平显著高于正常乳腺组织,但在肿瘤是否转移,雌激素受体、孕激素受体及CerbB-2阳性和阴性组间无显著性差异。     

逆转录实时荧光定量PCR检测p73 mRNA在结肠癌的表达

目的:建立一种实时定量PCR方法检测p73mRNA的表达水平,探讨其与结肠癌发生、发展的可能关系。方法:采用SYBRGreenⅠ逆转录实时荧光定量PCR检测39例结肠癌组织和其癌旁组织中p73mRNA的表达。结果:p73基因在结肠癌肿瘤组织的表达水平高于其在癌旁组织的表达(P<0.01);表达水平与肿瘤的恶性程度、分化及淋巴结转移显著相关(P<0.05)。结论:p73的高表达可能与结肠癌的发生、发展及预后有联系。     

DD3基因实时荧光定量RT—PCR检测前列腺癌特异性方法的建立

目的 建立DD3基因实时荧光定量PCR检测前列腺癌特异性方法,为前列腺癌的快速诊断提供分子诊断依据.方法 根据Genebank中的 DD3 mRNA全序列,设计DD3基因的特异引物和探针,采用基因重组技术构建用于DD3基因检测的定量标准品;建立DD3基因的实时荧光定量方法.结果 成功构建了用于DD3基因荧光定量PCR检测的标准重组质粒和DD3基因实时荧光定量PCR方法;经稳定性、特异度、重复性和敏感度实验方法学评价,DD3基因实时荧光定量PCR方法的最低检测限为1.64 copy/ml,线性范围为1.64～1.64×1012copy/ml.结论 DD3基因实时荧光定量PCR检测前列腺癌特异性方法的建立,将为前列腺癌特异性诊断及其临床应用奠定方法学基础.     

实时荧光定量PCR测定TRAIL mRNA质粒标准品的构建

目的 构建pGEM-T-TRAIL重组质粒标准品为临床检测TRAIL mRNA水平奠定基础.方法 在TRAIL基因第二和第三外显子区设计特异性引物和荧光探针,提取血清HBV DNA阳性乙肝患者的外周血单个核细胞总RNA,逆转录合成cDNA,扩增目的 片断,纯化PCR产物与pGEM-T Easy载体连接,转化感受态菌DH - 5α,经蓝白斑筛选,PCR鉴定阳性克隆,并进一步测序分析.提取重组质粒测定DNA浓度后,10倍倍比稀释,建立TRAIL质粒标准品.结果 扩增目的 片段长度为110 bp,测序结果证实所构建的质粒序列与NCBI基因库TRAIL序列性一致.结论 成功构建了实时荧光定量PCR 测定TRAIL mRNA质粒标准品.     

实时定量RT-PCR监测造血干细胞移植前后CML28 mRNA表达

本研究的目的在于建立检测CML28mRNA的SYBRGreenI实时定量PCR(RQPCR)的方法,并探讨CML28表达水平与异基因造血干细胞移植(AlloHSCT)后白血病复发之间的相关性,为此构建了pcDNA3.1HisACML28质粒作为定量模板,选择14例白血病患者进行研究。14例患者包括:10例慢性髓系白血病(CML),3例急性髓系白血病(AML),1例Ph阳性急性淋巴细胞白血病(Ph ALL)。应用RocheLightCyclerPCR仪动态监测患者移植前后不同时间段的50份骨髓单个核细胞中CML28表达水平。研究结果表明:RQPCR的灵敏度为10-4(0.05ng)水平,标准品日间差及日内差均小于10%,重复性好。初治组中AML和CML加速期(CMLAP)与急变期(CMLBC)患者CML28呈高表达(6.58±2.34)×10-2,预处理前组CML28水平为(2.19±0.32)×10-2,移植后1月组CML28水平为(1.35±1.28)×10-2,移植后3月及以后组(以下简称移植后3月组)CML28水平为(4.57±6.39)×10-3。定期随访表明,3例CMLAP或BC患者与1例CML慢性期(CMLCP)患者,在AlloHSCT3个月后检测仍呈阳性,其中2例CML28mRNA的水平<2×10-2,获无病生存;2例CML28水平>2×10-2者,一年内均出现复发,其中1例死亡,另1例行第2次AlloHSCT后CML28水平虽然迅速下降,但仍>2×10-2,2个月后再次复发。结论:CML28水平与疾病的演变过程存在良好的相关性,对于造血干细胞移植受者,动态监测CML28水平比单一的结果价值更大,实时定量检测移植后CML28水平对预测白血病复发有一定的意义。     

肺癌组织中调控PUMA基因 的miRNA筛查和MiR-221表达差异研究

目的 肺癌组织中调控PUMA基因的miRNA筛查并比较MiR-221的表达差异。方法 收集肺癌组织和肺良性病变组织作为研究对象,利用生物学信息分析查询可能调控PUMA的miRNA,应用定制的试剂盒进行初步筛查,并检测miRNA-221在两种组织中的表达情况。结果 根据生物学数据库的分析共筛查出可能调节PUMA的miRNAs有96个; 初步筛查结果显示有10种miRNAs在肺癌组织中表达上调。miR-221进一步验证显示,在肺癌组织中和肺良性病变组织中表达差异有统计学意义(P<0.05),转移与非转移之间表达差异有统计学意义,但与病理组织类型无关。结论 肺癌组织中与PUMA基因相关的10种miRNAs表达上调,提示这些miRNA可能参与PUMA基因的表达调控及肺癌的发生发展有关。miRNA-221在肺癌组织中表达与是否转移有关。     

实时荧光定量PCR检测血清miR-375表达及临床应用

目的建立ploy(A)聚合酶加尾的SYBR GreenⅠ实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测血清miR-375,并进行临床初步应用。方法用Trizol试剂提取血清总RNA。miR-375ploy(A)聚合酶加尾逆转录获得cDNA,进行SYBR GreenⅠ实时定量PCR扩增检测。制作C.elegans-miR-39模拟物浓度梯度稀释的标准曲线,绝对定量血清中miR-375的表达水平。结果该方法能定量检测血清miR-375表达水平,熔解曲线呈单峰,PCR扩增产物特异,在103~106 copy/μL范围内有良好的线性关系(r2=0.997),并且检测重复性好。糖尿病患者血清中miR-375表达水平明显高于健康体检者,差异有统计学意义(P0.05)。结论所建立的ploy(A)聚合酶加尾SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR能敏感、特异地检测血清中miR-375的表达水平,为下一步临床应用研究奠定了方法学基础。     

针刺对肥胖模型大鼠下丘脑瘦素受体mRNAB的表达与针刺的影响:SYBR Green实时定量聚合酶链反应检测

背景:脂肪细胞合成的瘦素作用于下丘脑,引起食欲降低,能量消耗增加.导致降低体质量,减少体脂.但单纯性肥胖病患者由于瘦素抵抗导致肥胖.目的:观察针刺对肥胖大鼠血清瘦素含量和下丘脑瘦素受体OB-Ra和OB-Rb表达的影响,探讨针灸减肥的机制.设计、时间及地点:随机对照动物实验.于2006-10/2007-01在南京中医药大学动物实验中心完成.材料:刚断乳的健康清洁级雄性SD大鼠90只,体质量50-70 g.实验过程中对动物处置符合2006年科学技术部发布的<关于善待实验动物的指导性意见>.方法:随机挑选10只普通饲料喂养为正常组.另一组80只高脂致肥饲料喂养,将造模成功的肥胖大鼠30只随机分为肥胖模型组和针刺组,每组各15只.采用实时定量聚合酶链反应技术测定瘦素受体(OB-Ra,OB-Rb)基因表达水平,酶联免疫测定法测定血清中瘦素的含量.主要观察指标:针刺治疗前后肥胖大鼠体质量、血清中瘦素的含量以及下丘脑OB-Ra与OB-Rb基冈表达的变化.结果:肥胖模型组大鼠体质量、血清瘦素水平均显著高于正常大鼠,而下丘脑OB-Rb基因表达水平均明显低于正常大鼠.针刺治疗取得良好减肥疗效的同时,针刺组大鼠血清瘦索明显回降,而下丘脑OB-Rb基因表达水平却明显升高.OB-Ra表达量3组差异无著性意义.结论:针刺可改善肥胖大鼠瘦素抵抗状态以及促进下丘脑OB-Rb基因表达可能是针刺减肥的细胞分子重要机制.     

SYBR Green实时定量PCR检测胰腺癌中HIF1α、VEGF和bFGF的表达及其临床意义

目的:研究胰腺癌及癌旁组织中HIF-1α、VEGF和bFGFmRNA的表达情况及其临床意义。方法:利用实时荧光定量聚合酶链反应技术对22例胰腺癌细胞及其对应的癌旁组织中HIF-1α、VEGF和bFGFmRNA进行定量检测,并分析其与临床病理特点之间的关系。结果:统计结果显示HIF-1α、VEGF和bFGF在胰腺癌中的表达高于癌旁组织(P<0.01),相关性分析显示肿瘤组织中HIF-lα表达与VEGF、bFGF表达呈显著正相关(P<0.01)。HIF-1α表达与肿瘤大小和淋巴结转移显著相关(P<0.01),与TNM分期有关(P<0.05),与性别、年龄无相关性,VEGF表达与肿瘤大小和淋巴转移相关(P<0.05),bFGF高表达与肿瘤大小、淋巴转移淋巴转移相关(P<0.05),而与TNM分期、性别及年龄无相关性。结论:HIF-1α、VEGF和bFGF在胰腺癌中存在高表达,HIF-1α表达与TNM分期、肿瘤大小和淋巴转移相关,VEGF和bFGF表达与肿瘤大小和淋巴转移相关。实时荧光定量PCR检测HIF-1α、VEGF和bFGF对评估胰腺癌患者预后可能有一定的价值,也为胰腺癌的治疗提供了治疗靶点。     

肺癌和癌旁组织Survivin基因mRNA表达

目的探讨Survivin基因在肺癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系。方法采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）的方法,检测41例手术切除的肺癌组织及其13例癌旁组织中Survivin基因表达。结果 68.29%肺癌组织有Survivin基因表达,癌旁组织中无Survivin基因表达（P〈0.01）,Survivin基因与肺癌组织病理分级、TNM分期、淋巴结转移正相关,与性别、年龄、吸烟史无明显相关性（P〉0.05）。结论 Survivin的表达在肺癌组织的浸润、转移及发展中具有重要意义。     

SYBR GreenI染料法定量PCR检测疟原虫感染及鉴别虫种的临床应用

目的评价一种可以快速定量检测疟原虫及虫种鉴别的荧光定量PCR法。方法将SYBRGreenI法与TaqMan探针法检测疟原虫进行比对,评价定量的准确性及方法的敏感度。以PCR-DNA测序法为金标准,评价SYBRGreenI法分型的准确性。结果两个方法的定量拷贝检测数无显著性差异（P〉0．05）。SYBRGreenI法检测疟原虫的最低检测下限为1×10^2copy／mL至5×10^2copy／mL之间。与PCR-DNA测序法比较,SYBRGreenI法能准确的对感染的疟原虫虫种做准确的鉴定。结论SYBRGreenI染料法定量可同时进行人体疟原虫的定量检测和虫种鉴别,且成本低廉,操作简便快速,可以在疟疾的高发地区推广使用。     

人胃癌组织LIN28基因的定量检测及意义

目的检测LIN28基因在胃癌组织及对应癌旁组织中的表达差异,分析其与临床参数间的关系及在胃癌发生、发展中的作用。方法用Trizol提取总RNA,RT-PCR检测30例手术切除的胃癌组织及相应癌旁胃黏膜组织中LIN28 mRNA的表达,用SYBR实时荧光定量PCR进行比较。结果胃癌组织和癌旁组织中LIN28 mRNA均为阳性;胃癌组织LIN28 mRNA的平均表达强度为1.80×10-4,癌旁组织的平均表达强度为7.41×10-4,经配对t检验,P<0.01,有统计学差异。LIN28的表达与其他临床参数无明显相关性(P>0.05)。结论胃癌组织LIN28 mRNA的表达较癌旁组织明显下降;LIN28的表达与患者年龄、性别、肿瘤的分化程度、有无淋巴结转移等无明显的相关性。