人HNA-3a基因的克隆及其在HEK-293细胞的表达

目的构建人HNA-3a基因全长的真核表达载体,探索一种检测抗人HNA-3a抗体的实验方法,观察HNA-3a蛋白表达情况。方法参照GeneBank中人HNA-3a基因序列,设计并合成引物,采用RT-PCR方法反转录HNA-3a基因外显子片段全长,定向克隆到pEGFP-N3载体中,然后采用LipofectamineTM 2000试剂将含目的基因的pEGFP-N3表达载体转染至HEK-293细胞中进行稳定表达,并以免疫荧光和蛋白质免疫印迹法（WB）鉴定目的基因的表达情况。结果免疫荧光和免疫印迹结果显示,目的基因在HEK-293细胞中获高效表达。结论成功构建了高效表达HNA-3a蛋白的真核表达载体,为检测人血浆中抗HNA-3a抗体奠定了基础。     

psiCHECK-2-eGFP-mLumin双荧光蛋白报告基因质粒的构建及在真核细胞中的表达

［摘要］目的: 以psiCHECK-2质粒为骨架,构建带有远红外荧光蛋白mLumin和增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,eGFP）的双荧光蛋白报告基因质粒psiCHECK-2-eGFP-mLumin。方法： PCR扩增mLumin和eGFP基因片段,分别取代海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶插入psiCHECK-2质粒中,构建psiCHECK-2-eGFP-mLumin双荧光蛋白报告基因重组质粒mLumin。通过测序验证插入序列,并将此质粒转入HEK293T细胞,分别用PCR和荧光显微镜鉴定eGFP和mLumin在细胞中的表达。结果： DNA测序结果证实连接在psiCHECK-2质粒上的eGFP和mLumin基因序列与基因库中的序列一致。将psiCHECK-2-eGFP-mLumin质粒转染HEK293T细胞,能成功表达eGFP和mLumin蛋白。结论： 成功构建psiCHECK-2-eGFP-mLumin双荧光蛋白报告基因质粒,且可在真核细胞中表达。     

α-actinin2增加SK2通道在HEK293膜蛋白的表达

目的：证实α-Actinin 2与小电导钙激活钾通道（Small Conductance Ca2＋-activated K＋Channels, SK）的共同表达增加SK2在HEK293细胞膜上的表达。方法：HEK293细胞用RPMI 1640培养基培养。将HEK293细胞分为两组,对照组细胞转染pIRES-SK2质粒,实验组细胞共转染pIRES-SK2和pcDNA3-α-actinin2质粒。免疫荧光共聚焦显微镜和蛋白印迹技术检测SK2通道蛋白在HEK293细胞膜上的表达。结果：免疫荧光共聚焦显微镜检测到转染pIRES-SK2质粒的HEK293细胞膜上有SK2通道蛋白的表达。蛋白印迹技术显示实验组蛋白条带亮度明显高于对照组。结论：α-Actinin 2能增加SK2在HEK293细胞膜上的表达。     

人分泌型白细胞介素2受体α链基因的克隆及其在真核细胞中的表达

删除人白细胞介素－２受体α链ｃＤＮＡ中编码胞质内１３个氨基酸及跨膜区１９个氨基酸残基的ＤＮＡ片段后，接上人工合成的终止寡核苷酸片段，改建后的ｃＤＮＡ与真核表达载体ｐＲｃ／ＣＭＶ重组成质粒ｐＣＭＶ／ｒｓＩＬ２Ｒ。用电打孔及磷酸钙法将此质粒转染ＣＨＯ细胞，经Ｇ４１８筛出表达Ｎｅｏ基因的克隆２０株，通过ｍＲＮＡ狭缝杂交及ＥＬＩＳＡ检测，有５株能稳定表达分泌型α链ｍＲＮＡ及蛋白，其中４株细胞培养上清中的ＩＬ２Ｒα链的含量达１４００Ｕ／ｍｌ以上。     

人CD38分子基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的：克隆并表达人CD38抗原分子的全长cDNA。方法：采用RT－PCR法，从高表达CD38抗原的Daudi细胞系中克隆出CD38全长cDNA并将其插入pGEM-T载体中，重新设计引物，引入酶切 位点，二次PCR；从重组pGEMT载体上扩增CD38抗原分子的cDNA编码序列，再亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1( )，用脂质体法转染COS7细胞。用免疫荧光及A－PAAP方法检测CD38抗原的表达。结果：克隆的CD38抗原的全长cDNA，经酶切鉴定及序列分析表明，其序列与文献报道完全一致。免疫荧光及APAAP方法检测表明，CD38抗原分子在COS7细胞中获得表达。结论：成功构建了CD38真核表达载体，并在COS7细胞中获得表达，对研究CD38分子的功能具有重要的意义。     

H—2K^b cDNA的克隆及其在多种真核细胞中的表达

目的 克隆Ｈ－２Ｋ＾ｂｃＤＮＡ及研究其在多种真核细胞中的表达。 方法 ＲＴ－ＰＣＲ法扩增Ｈ－２Ｋ＾ｂｃＤＮＡ,克隆入双顺反子逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ,ＰＡ３１７包装出重组病毒后,分别感染ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＯＳ７及ＭＭ４５Ｔ．Ｌｉ,ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ分析目的基因表达,ＦＡＣＳ分析Ｈ－２Ｋ＾ｂ在细胞膜上的表达。结果 以双顺反子逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ介导,分别建立了Ｈ－２Ｋ＾ｂ基因转导细胞：ＮＩＨ３Ｔ     

重组人白细胞介素10基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的：克隆编码人白细胞介素10（hIL-10）基因的全长cDNA,构建真核表达载体,并在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中进行表达.方法：应用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）技术,从活化的正常人外周血单个核细胞中扩增出hIL-10 cDNA,将测序正确的hIL-10 cDNA克隆至真核表达载体pcDNA3构建重组表达载体.采用磷酸钙法转染CHO细胞,用ELISA法检测hIL-10基因的表达,用单四唑（MTT）检测hIL-10蛋白的活性.结果：RT-PCR产物插入Teasy载体,经序列测定证实hIL-10基因全序列克隆成功.在CHO细胞培养上清中有hIL-10的表达,该产物能抑制淋巴细胞转化.结论：成功构建了真核表达质粒pcDNA3-hIL-10,为进一步研究hIL-10在自身免疫、移植免疫及炎症性疾病中的作用打下了基础.     

hHCN2基因的表达和电生理记录

目的将hHCN2基因有效转染到HEK293细胞，建立一种研究心肌离子通道的有效模型。方法采用Lipofactamine2000脂质体将hHCN2基因转染HEK293细胞。运用全细胞膜片钳技术检测克隆hHCN2基因表达的情况。结果pcDNA3-hHCN4真核表达载体转染HEK293细胞3d后，记录到转染成功的hHCN2基因编码的通道电流。结论该实验采用的技术稳定可靠，为开展克隆离子通道结构和功能关系的研究奠定了基础。     

重组小鼠白介素-2基因在真核细胞中的转染表达

目的：在构建重组真核表达载体pIRESneo2／mIL-2的基础上,建立能够持续稳定表达mIL-2的哺乳类工程细胞。方法：运用分子克隆技术,将由RT-PCR获得的mIL-2cDNA片断插入真核表达质粒pIRESneo2构建成mIL-2重组表达载体pIRESneo2／mIL-2。通过脂质体转染法将pIRESneo2／mIL-2导入C2C12细胞。转染后第30天,用Western blots检测mIL-2表达情况。结果：经DNA测序证明mIL-2cDNA片断插入方向和碱基组成顺序均准确无误,Western blots检测转染真核重组表达载体pIRESneo2／mIL-2的C2C12细胞系表达mIL-2。结论：利用pIRESneo2／mIL-2构建的真核表达载体在C2C12细胞系中能够持续稳定表达mIL-2。     

大鼠GDNF真核表达载体的构建及其真在核细胞中的表达

目的：构建ｐｃＤＮＡ３／ＧＤＮＦ真核表达质粒并了解其在真核细胞内的表达．方法：将ＧＤＮＦ逆转录聚合酶链式反应产物克隆至ｐｃＤＮＡ３真核表达载体上,经酶切鉴定及测序分析并以脂质体介导法转染真核细胞,了解其在细胞内的表达及其表达蛋白的生物学活性．结果：酶切鉴定及测序分析表明重组ｐｃＤＮＡ３／ＧＤＮＦ表达质粒克隆成功,转染实验表明重组质粒能在真核动物细胞中表达出具有活性的ＧＤＮＦ蛋白．结论：以脂质体介导     

A versatile cloning vector facilitates target gene expression in prokaryotic and eukaryotic cells

Objective

To facilitate manipulation of gene expression in different host cells, we used pEGFP-Nl as backbone to construct a versatile vector that can drive foreign gene expression in prokaryotic and eukaryotic cells.

Methods

A cloning and expression vector, pEGFP-Nl-lac, was constructed by inserting the prokaryotic lac promoter of pUC19 into the eukaryotic expression vector, pEGFP-Nl, between the eukaryotic PCMV promoter and enhanced green fluorescent protein (EGFP) open reading frames. To assess the function of pEGFP-Nl-lac, the nucleotide sequence encoding the hepatitis C virus (HCV) core protein was cloned into the multiple cloning sites. Western blotting analysis was used to detect the expression of the HCV core protein in Escherichia coli DH5a and HepG2 cells.

Results

Restriction enzyme digestion and sequence analysis indicated that pEGFP-N1-lac was successfully constructed and the HCV core gene was cloned into this vector. The Western blotting results showed that pEGFP-N1-lac promoted expression of HCV core gene in prokaryotic E. coli DH5 and eukaryotic HepG2 cells. Conclusion: The pEGFP-N1-lac vector has been successfully constructed and functions in both prokaryotic and eukaryotic cells. The EGFP reporter can be used as an insert-inactivation marker for clone selection or as an expression tag. This vector can be used for cloning and expression of genes in both prokaryotic and eukaryotic cells, making gene cloning, expression and functional studies convenient as well as time- and labor-efficient.     

人宫颈癌Ca Ski 细胞 IL-24基因的克隆鉴定与真核表达

目的:克隆人IL-24基因并构建真核表达载体,转染Ca Ski细胞进行真核表达.方法:利用RT-PCR技术扩增出Ca Ski细胞中的IL-24基因.将IL-24基因克隆人pcDN3.1( )中,构建真核表达质粒pcDN3.1( )-hIL-24的表达.结果:PCR及测字结果均证实在功克隆了人IL-24,该质粒被转染人Ca Ski细胞中能表达出hIL-24蛋白.结论:成功构建了hIL-24基因的真核表达载体.     

Gene cloning of murine α-fetoprotein gene and construction of its eukaryotic expression vector and expression in CHO cells

Summary To clone the murine α-fetoprotein (AFP) gene, construct the eukaryotic expression vector of AFP and express in CHO cells, total RNA were extracted from Hepa 1–6 cells, and then the murine α-fetoprotein gene was amplified by RT-PCR and cloned into the eukaryotic expression vector pcDNA3. 1. The recombinant of vector was identified by restriction enzyme analysis and sequencing. After transient transfection of CHO cells with the vector, Western blotting was used to detect the expression of AFP. It is concluded that the 1.8 kb murine α-fetoprotein gene was successfully cloned and its eukaryotic expression vector was successfully constructed. YI Jilin, male, born in 1953, Professor     

结缔组织生长因子的克隆及其真核表达载体的构建

目的结缔组织生长因子(CTGF)在肿瘤发生,胚胎发育、骨折愈合、细胞增殖和分化、血管形成等众多领域都有着重要的作用,对结缔组织生长因子进行克隆及构建其真核表达载体,对其在功能上的进一步研究及应用有积极意义.方法以含有鼠CTGF基因序列的EST克隆为模板,通过PCR的方法克隆出目的基因CTGF,再以分子克隆学的方法将CTGF克隆入真核表达载体pAdTrack-CMV,进一步以PCR、酶切、DNA测序的方法筛选出正确的真核表达质粒.并通过Western-Blotting的方法对质粒的表达功能进行研究.结果 PCR、酶切、DNA测序的方法均证实已经成功克隆获得序列正确的目的基因CTGF,并将CTGF克隆入真核表达载体pAdTrack-CMV.Western-Blotting的结果表明构建的表达CTGF的真核表达载体高表达CTGF蛋白质.结论成功克隆目的基因CTGF并构建其真核表达质粒,证实在蛋白质水平获得了表达.     

Bikunin的分子克隆及真核分泌型表达载体的构建和表达

目的 构建含有Bikunin的哺乳类细胞表达载体pSecTag2B-Bikunin,应用哺乳类细胞表达系统,表达分泌型Bikunin融合蛋白.方法 用RT-PCR方法,从人肝细胞系L02扩增Bikunin编码区序列,将其克隆于pMD18-T Simple Vector中构建pMD18-T-Bikunin,经酶切、PCR...     

凋亡抑制因子survivin基因的克隆及在真核细胞中的表达

目的:克隆Survivin编码序列并在真核细胞中表达.方法:RT-PCR扩增Survivin编码序列,建立与绿色荧光蛋白(GFP)共表达的融合重组质粒,转染哺乳动物细胞,利用GFP绿色荧光和WesternBlot检测Survivin蛋白的表达.结果:RT-PCR扩增出421bp的Survivin编码序列,构建融合重组质粒pEGFP-C1-Survivin,利用GFP荧光和Western Blot证实Sur-vivin蛋白的表达.结论:成功克隆Survivin基因并在真核细胞中表达.     

肺炎衣原体0308基因真核表达载体构建及表达检测

目的构建肺炎衣原体AR39株Cpn0308基因真核表达重组质粒,体外转染HeLa细胞并检测表达情况,为Cpn核酸疫苗的研制做准备。方法应用PCR技术从CpnAR39株基因组中扩增Cpn0308全长基因,重组入pcDNA3.1/HisA真核表达载体相应位点,进行酶切鉴定和序列分析后,运用脂质体介导重组质粒转染HeLa细胞,间接免疫荧光技术检测目的蛋白在真核细胞中表达情况。结果 PCR扩增得到393bp的特异性Cpn0308基因,筛选鉴定出pcDNA3.1/HisA-Cpn0308真核表达重组体,序列测定证实与GeneBank登录的CpnAR39株Cpn0308基因一致;间接免疫荧光法检测到重组质粒转染的HeLa细胞能够表达目的蛋白。结论成功构建pcDNA3.1/HisA-Cpn0308真核表达重组体,且该重组体能够在体外真核细胞中表达目的蛋白,为进一步研究CpnDNA疫苗以及研究该蛋白的生物学功能提供实验基础。     

含HSV-TK基因的真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的　构建AFP增强子CMV启动子调控下的HSV -TK真核表达质粒用于肝细胞癌的靶向基因治疗。方法　采用PCR方法从HepG2细胞基因组DNA中扩增AFP基因增强子最小的功能片断 ,插入pcDNA3.1-LUC质粒的BglII位点 ,从而构建重组表达质粒 pAFP -LUC。HSV -TKcDNA全长序列替换pAFP -LUC质粒中EcoRI位点的LuciferasecDNA全序列构建重组表达质粒 pAFP -TK。质粒 pAFP -LUC采用脂质体法转染AFP阳性的肝癌细胞系HepG2及AFP阴性的非肝癌细胞系HeLa ,用Luciferase分析试剂盒分析Luciferase的表达情况。结果　PCR扩增所得AFP增强子片段的长度和序列通过琼脂糖凝胶电泳、DNA测序得到证实。采用限制性内切酶酶切及PCR方法证实质粒pAFP -LUC中插入的AFP增强子大小、位置及方向均正确。酶切后凝胶电泳分析证实HSV -TK已成功地定向克隆入真核表达载体中。Luciferase报道基因的表达受AFP增强子的调控 ,在AFP阳性肝癌细胞HepG2中高效表达 ,而在AFP阴性的HeLa细胞中表达很低 ,这种差异具有显著性 ,P <0 .0 5。结论　AFP增强子CMV启动子调控的HSV -TK真核表达质粒的构建及其在HepG2细胞中的特异性表达为肝细胞癌的靶向基因治疗提供了实验基础。