抑制TPP1表达对端粒保护蛋白1在染色体端粒定位及其功能的影响

目的观察TPP1受到抑制后，对端粒保护蛋白1a（Pot1a）和端粒保护蛋白1b（Pot1b）在端粒上的定位及其对端粒保护功能产生的影响。方法利用逆转录病毒介导的RNA干扰技术抑制小鼠胚胎成纤维样细胞内源性TPP1的表达后，采用免疫荧光／端粒肽核酸荧光原位杂交法检测外源性Pot1a和Pot1b在端粒上的定位，通过端粒末端脱氧尿嘧啶转移酶法检测TPP1降低后对染色体末端保护功能的影响，SA—βgal染色检测细胞衰老，Western blot检测磷酸化的P53水平和P21含量。结果TPP1受到抑制后大约65％的MEF细胞中Pot1a和Pot1b不能定位在端粒上，显著高于空载体对照组的5％（t=10．96，P〈0．01）；TdT—FITC检测结果显示，大约50％的细胞在TPP1受到抑制后出现TdT—FITC阳性，其中90％的TdT—FITC阳性信号出现在端粒上，而在空载体对照组TdT—FITC阳性细胞为4．7％（t=14．37，P〈0．01），位于端粒上的TcdT—FITC阳性信号〈3％（t=17．59，P〈0．01）；β-gal染色（细胞衰老的特征性标志）结果显示，在TPP1受到抑制后β—gal阳性细胞率分别达25．7％和22．0％，显著高于对照组细胞的1．7％（t=18．23，P〈0．01；t=16．9，P〈0．01）；进一步研究表明，TPP1受到抑制的细胞导致P53^ser18磷酸化，P21表达明显增强。结论TPP1是Pot1a和Pot1b定位在端粒上必需的，抑制TPP1导致染色体末端失去保护功能并诱导P53依赖的细胞衰老。     

4-羟基水杨酰苯胺对T淋巴细胞白血病肿瘤增殖与凋亡的影响

目的：研究4-羟基水杨酰苯胺(4-hydroxysalicylaniline,HDS)对T淋巴细胞白血病细胞Jurkat和Hut-78的抑制效果及其机制。方法：体外实验中，梯度浓度的HDS处理Jurkat和Hut-78细胞后，以CCK-8和克隆形成实验检测细胞增殖状况；用细胞流式术检测细胞周期变化，通过Western blot检测周期相关蛋白的表达水平；用细胞流式术检测细胞凋亡水平，通过Western blot检测凋亡相关蛋白的表达水平；以γ-H2AX免疫荧光染色检测DNA损伤状况，并通过Western blot检测DNA损伤相关蛋白的表达水平。体内实验中，通过皮下注射Jurkat细胞构建小鼠肿瘤模型，处理组腹腔注射HDS，对照组给予等量溶剂，记录小鼠体重与肿瘤体积变化，13 d后，取肿瘤组织，通过HE染色观察组织形态，并通过Ki67和γ-H2AX的免疫组织化学染色，分析药物对肿瘤组织增殖与DNA损伤的影响。结果：在体内和体外，证明了HDS可通过诱导Jurkat和Hut-78细胞S期细胞周期阻滞与凋亡，并且通过CHK1/CHK2信号通路的磷酸化激活，加重DNA损伤，抑制T淋巴细胞白血病...     

自噬参与促进AFB1致肝细胞DNA损伤的修复进程

目的探讨黄曲霉毒素B1(AFB1)肝毒性修复进程中细胞自噬的作用。方法以经50μmol/L AFB1预处理24 h的永生化人正常肝L02细胞建立模型,检测AFB1处理撤除不同时间点的细胞DNA双链损伤指标γH2AX蛋白和自噬标志物LC3-Ⅱ蛋白的表达水平;采用免疫荧光法检测AFB1撤除后细胞中γH2AX蛋白荧光焦点和自噬体形成情况;在AFB1撤除后联合应用自噬抑制剂3-MA进行干预实验,检测细胞内γH2AX蛋白的表达水平。结果L02细胞中γH2AX蛋白的动态表达在AFB1处理撤除12 h后达到最高,并在24 h后逐渐降低;自噬蛋白LC3-Ⅱ和自噬体的形成在AFB1处理撤除后逐渐增强;3-MA可明显减缓AFB1撤处理后细胞内γH2AX蛋白的降低进程。结论细胞自噬参与了AFB1诱导肝细胞毒性损伤的修复进程,与促进DNA损伤的修复有关。     

IncRNA-TUG1促进放射后人骨髓间充质干细胞衰老

目的 探讨IncRNA-TUG1在放射导致的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)衰老中所起的作用.方法 实验分为IncRNA-TUG1干扰组、IncRNA-TUG1对照组,用γ射线造成放射损伤后,采用实时荧光定量PCR (RT-PCR)检测IncRNA-TUG1在2组的表达变化,采用Western blot检测2组的γ-H2AX蛋白反映DNA损伤,检测衰老相关蛋白p53表达以及β-半乳糖苷酶染色反映细胞衰老.结果 γ射线放射显著增加了BM-MSCs中IncRNA-TUG1表达(P＜0.01),BM-MSCs中迅速出现γ-H2AX磷酸化,p53蛋白水平升高,BM-MSCs衰老明显增加;而干扰IncRNA-TUG1后,放射后BM-MSCs的DNA损伤修复加快,p53蛋白水平下降,细胞衰老明显减少(P＜0.01).结论 放射可能通过IncRNA-TUG1促进BM-MSCs的衰老.     

上皮性卵巢癌细胞原代培养及放化疗相关的DNA损伤应答机制的研究

目的 通过上皮性卵巢癌组织细胞原代培养,检测DNA损伤应答过程中相关蛋白细胞定位的动态变化。方法 选取临床新鲜卵巢上皮性肿瘤标本28例（交界性浆液囊腺瘤6例,高分化浆液腺癌5例,中分化浆液腺癌6例,低分化浆液腺癌11例）,组织块经胶原酶A消化后培养,比较不同培养基（MCDB/M199培养基、原代细胞专用培养基、DMEM培养基）对原代肿瘤细胞正常形态维持、增殖潜力及纤维化的影响。离子射线（X光）、喜树碱（CPT）处理诱导细胞DNA损伤,间接免疫荧光法检测ATM蛋白激酶依赖性信号转导通路中DNA损伤（双链断裂）应答相关蛋白〔p53结合蛋白1（53BP1),磷酸化组蛋白H2AX(γ-H2AX)〕的应答特征。结果 MCDB/M199培养基有利于卵巢上皮性肿瘤细胞维持正常形态并减缓纤维化。未经处理前各级别卵巢肿瘤原代细胞中均存在不同程度的内源性损伤(53BP1、γ-H2AX灶点),且随着肿瘤细胞恶性程度的增加,53BP1、γ-H2AX灶点逐渐增多（P <0.05）。X光、CPT可以在卵巢癌原代细胞中诱导大量DNA损伤,提示原代培养的细胞有经典的DNA损伤应答反应。结论 成功建立了卵巢上皮性肿瘤直接分离培养方法,在卵巢上皮性肿瘤发展过程中,ATM转导通路检验点信号可被内源性损伤激活,CPT、X线处理会造成上皮性卵巢癌原代细胞中ATM通路的进一步激活来抑制肿瘤增殖,阻止肿瘤进展。     

DNA损伤应答靶向抑制剂对卵巢癌细胞的化疗增敏作用

目的 观察DNA损伤应答抑制剂及其联合常规化疗药物（顺铂等）在卵巢癌耐药细胞株OVCAR-8中的作用,研究其化疗致敏效应。方法 利用针对DNA损伤应答关键信号蛋白质的抑制剂,与顺铂等连用处理卵巢癌细胞,分析这些药物处理方式对卵巢癌细胞的杀伤能力。MTT法检测不同药物作用后OVCAR-8的增殖抑制情况;免疫荧光法检测OVCAR-8中磷酸化组蛋白2A变体（γH2AX）和p53结合蛋白1（53BP1）的表达,观察二者在DNA损伤位点的募集和形成灶点的能力。结果 毛细血管扩张共济失调突变蛋白（ATM）/ATM和Rad 3相关蛋白（ATR）抑制剂与顺铂联用能抑制损伤修复机制的活化,明显减弱OVCAR-8细胞的增殖活力（P<0.01）,促进其凋亡;在羟基脲和Wortmannin联合处理时,OVCAR-8细胞的ATR转导信号（如γH2AX）减弱,细胞生存率明显降低（P<0.05）;多聚ADP-核糖聚合酶（PARP）抑制剂与顺铂联合处理OVCAR-8细胞未发现明显的增敏作用（P>0.05）。结论 适当的DNA损伤应答抑制剂有潜力提高常规化疗药物的抗肿瘤效果,以达到快速清除肿瘤细胞和防止产生耐药性的效果。     

AGGF1在结直肠癌细胞DNA损伤修复及化疗敏感性中的作用

目的研究血管生成因子AGGF1在人结直肠癌细胞DNA损伤修复及化疗抵抗中的作用及机制。方法顺铂诱导结直肠 癌细胞株HCT116 细胞DNA损伤模型,运用siAGGF1 及siNC 转染结直肠癌细胞干扰AFFF1 的表达。Western blot 实验检测 AGGF1、γH2AX基因表达水平,免疫荧光法检测顺铂诱导HCT116细胞DNA损伤（双链断裂）后,γH2AX和AGGF1在损伤位点 的募集情况;MTS法检测损伤细胞的增殖情况;免疫组织化学方法检测结直肠癌及癌旁正常组织中AGGF1的表达水平。结果 Western blot结果显示顺铂处理HCT116细胞明显下调AGGF1表达,干扰AGGF1的表达抑制了γH2AX和NBS1;免疫荧光实 验表明AGGF1和γH2AX共定位,细胞增殖实验表明结直肠癌细胞对化疗的敏感性增加（P<0.01）;AGGF1在结直肠癌组织中表 达高于相应癌旁组织（P<0.01）,表明其可能与肿瘤的恶性表型相关。结论下调AGGF1基因可抑制结直肠癌细胞的DNA损伤 修复,提高其对化疗的敏感性,机制上可能与NBS1磷酸化相关。     

端粒酶及其在肿瘤中的应用研究

端粒是线性染色体末端的一段特殊的DNA -蛋白质复合物 ;端粒酶是一种粒蛋白逆转录酶 ,能以自身的RNA为模板 ,反向合成 -TTAGGG - ,不断加在DNA末端。目前研究认为 ,端粒一端粒酶参与细胞的增殖过程 ,大多妇科恶性肿瘤有端粒酶的表达。抑制端粒酶的活性 ,将导致癌细胞端粒序列重新变短并激活细胞衰老途径。因此 ,端粒酶可以作为恶性肿瘤治疗的理想靶目标     

下调Pygo2抑制脑胶质瘤U251细胞增殖、侵袭及其cyclin D1的表达

目的构建RNA干扰(RNAi)重组体抑制Pygo2的表达,并探讨其对脑胶质瘤U251细胞增殖、侵袭的影响及其机制。方法针对Pygo2cDNA序列设计并合成一对特异性的含有短发卡的寡核苷酸序列及其阴性对照序列,经退火后插入pSuper中构建重组体。经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定和DNA测序后,用脂质体2000将其转染脑胶质瘤U251细胞,采用实时定量PCR和蛋白质印迹方法检测Pygo2shRNA对U251细胞Pygo2mRNA和蛋白表达的干扰效果,MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期分布,BrdU掺入法检测DNA合成,Transwell检测细胞侵袭。采用蛋白质印迹和免疫荧光法检测Pygo2shRNA对U251细胞cyclin D1、β-catenin蛋白水平和亚细胞定位的影响。结果双酶切和测序鉴定证实插入序列完全正确;Pygo2shRNA显著抑制了U251细胞Pygo2mRNA和蛋白的表达;Pygo2shRNA抑制U251细胞Pygo2表达后,细胞增殖显著降低,细胞更多地阻滞在G1期,且BrdU掺入显著减少,侵袭细胞数显著减少。此外,抑制Pygo2表达可显著下调U251细胞cyclin D1的表达但不改变其亚细胞定位。U251细胞β-catenin表达及其亚细胞定位无明显改变。结论成功构建了抑制Pygo2表达的重组载体。抑制Pygo2表达能有效地抑制脑胶质瘤U251细胞DNA合成,可能通过下调Wnt信号靶基因cyclin D1的表达,使细胞阻滞于G1期而抑制细胞增殖和侵袭。     

HSP90功能抑制对乳腺癌细胞端粒酶和突变型P53的影响

目的应用HSP90功能抑制剂格尔德霉素(geldanamycin,GA)研究HSP90功能抑制对乳腺癌细胞增殖及端粒酶活性和突变型P53表达的影响。方法培养人乳腺癌细胞株MDA-MB-435s,采用MTT法检测GA对MDA-MB-435s细胞的生长抑制作用,流式细胞术分析细胞周期,用TRAP-ELISA法检测细胞端粒酶活性,Western blot检测细胞内突变型P53蛋白表达变化。结果GA对MDA-MB-435s细胞增殖有明显抑制作用,呈时效量效依赖关系,GA作用后细胞呈现G2/M期阻滞,细胞内端粒酶活性下降,突变型P53蛋白表达明显下调。结论乳腺癌细胞中端粒酶活化和突变型P53表达与HSP90功能有关,用GA抑制HSP90功能可降低端粒酶活性和突变型P53表达,从而抑制乳腺癌细胞增殖。