Egr-1通过上调NDRG1诱导骨髓间充质干细胞成骨分化

目的 探究早期生长因子1(Egr-1)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖和成骨分化的影响.方法 采集成年男性骨髓组织,分离培养原代BMSCs并在显微镜下观察其形态,流式细胞术鉴定BMSCs表面标志物;pcDNA3.1/Egr-1转染BM-SCs,MTT检测BMSCs的增殖,茜素红钙染色试剂盒检测细胞基质内钙结节的形成,ALP活性测定试剂盒检测细胞内ALP的活性,实时定量qPCR和Western blot分别检测细胞内EgR-1、Runx2、NDRG1 mRNA和蛋白表达;Egr-1 siRNA转染BMSCs,检测细胞内ALP活性、Egr1、Runx2和NDRG1 mRNA及蛋白表达.结果 离体培养的BMSCs高表达CD90和CD29,而CD34和CD45呈阴性表达;pcDNA3.1/Egr-1转染对BMSCs增殖无明显作用,却能促进细胞基质内钙结节的形成,上调ALP活性和Egr-1、Runx2、NDRG1的表达,而Egr-1 siRNA则作用相反.结论 Egr-1通过上调NDRG1诱导BMSCs的成骨分化.     

蛋白激酶CβⅡ负调控小鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

目的观察蛋白激酶C(PKC)各亚型在小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化中的作用。方法Western blot检测小鼠BMSCs成骨分化中PKC各亚型的活化情况;利用PKC阻断剂GFX分析PKC在BMSCs体外成骨分化中的作用;碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测成骨早期分化指标ALP的活性;茜素红染色检测BMSCs体外矿化能力;实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测成骨分化相关基因Runx2、Ⅰ型骨胶原a1(ColⅠa1)和ALP的表达情况。结果小鼠BMSCs成骨分化过程中,仅检测到PKCβⅡ亚型活化,其他亚型均无明显活化。利用PKC阻断剂GFX抑制PKCβⅡ活化后,茜素红染色结果显示BMSCs的成骨分化过程受到促进;PCR结果显示成骨分化相关基因Runx2、ColⅠa1和ALP的mRNA水平均有不同程度增加;ALP活性检测结果也显示BMSCs的成骨分化过程受到促进。结论PKCβⅡ可负调控小鼠BMSCs的成骨分化。     

盘龙七片通过调节Wnt/β-catenin通路对BMSCs成骨分化的影响

目的 观察盘龙七片对人骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化的作用并探讨其机制。方法 BMSCs细胞分为对照组和盘龙七片处理组。MTT检测细胞增殖并确定盘龙七片最佳浓度。RT-PCR和western blot分别检测Runx2、Osterix、COL1A1的mRNA和蛋白表达。检测骨钙素、碱性磷酸酶(ALP)及Wnt/β-catenin通路蛋白的表达水平。结果 盘龙七片促进BMSCs增殖,且随着质量浓度的升高增加更明显(P<0.05)。盘龙七片组细胞中Runx2、Osterix、COL1A1的mRNA和蛋白表达高于对照组(P<0.05),骨钙素水平和ALP活性高于对照组(P<0.05);Wnt3和β-catenin的蛋白表达高于对照组(P<0.05),p-GSK-3β的蛋白表达低于对照组(P<0.05)。结论盘龙七片能够促进BMSCs细胞成骨分化,且其作用可能是通过激活Wnt/β-catenin通路产生的。     

精脒对衰老兔骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及机制研究

背景 研究发现衰老兔骨髓间充质干细胞(bone-marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的成骨分化能力减弱,而精脒(Spermidine)对衰老相关疾病具有保护作用.目的 探讨精脒对衰老兔骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及其作用机制.方法 复苏BMSCs并将其分为3组:对照组(Vehicle,培养基中不加入药物),D-半乳糖诱导衰老组(D-gal,培养基中加入40 g/L D-gal诱导BMSCs衰老),Spermidine干预组(Spermidine,培养基中加入40 g/L D-gal + 3 μmol/L Spermidine处理BMSCs).试剂盒检测细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)与还原型NAD+(NADH)比例,MTT法检测细胞增殖活性.成骨诱导培养后,Western blot检测Sirt1蛋白的表达,qPCR检测成骨相关基因的转录水平.结果 与Vehicle组相比,D-gal组细胞内NAD+/NADH比例降低,BMSCs增殖减弱(P<0.05);Spermidine可提高细胞内NAD+/NADH比例并促进BMSCs增殖(P<0.05).成骨诱导培养后,D-gal抑制Sirt1表达并下调成骨相关基因Runx2、Osx和ALP的转录表达(P<0.05);而Spermidine可上调Runx2、Osx和ALP的转录表达(P<0.05).当采用siRNA抑制Sirt1表达后,Spermidine上调成骨相关基因转录表达的作用明显减弱(P<0.05).结论 Spermidine可通过激活Sirt1促进衰老兔BMSCs成骨分化.     

姜黄素促进炎症微环境下大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化

目的 研究姜黄素对炎症微环境下大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的影响。方法 分离、培养大鼠BMSCs,以10 ng/mL的肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱发细胞炎症反应,用不同浓度姜黄素处理细胞,CCK-8检测细胞增殖以便筛选出实验所需姜黄素适宜浓度;实验分组为正常组、炎症组和炎症+姜黄素组;碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色检测成骨分化,实时荧光定量PCR检测骨涎蛋白(BSP)、Runt相关转录因子2(Runx2)的表达。结果 成功分离培养BMSCs;低浓度的姜黄素无细胞毒性,1μmol/L为适宜浓度;炎症降低大鼠BMSCs成骨相关基因BSP、Runx2表达,且ALP染色变浅、矿化结节减少;而姜黄素则可以逆转这种趋势,促进炎症状态下成骨相关基因 BSP、Runx2的表达(P＜0.05),较炎症组ALP染色加深,矿化结节增多。结论 姜黄素可以促进炎症微环境下BMSCs成骨分化。     

胡椒碱对成骨细胞成骨分化的影响

目的探讨胡椒碱对成骨细胞成骨分化的影响以及机制。方法分离、培养胎鼠颅骨成骨细胞,分别给予不同浓度的胡椒碱处理,采用MTT法检测胡椒碱对成骨细胞毒性的影响;采用碱性磷酸酶（ALP）染色和ALP活性检测试剂盒检测ALP活性;采用茜素红S染色评估成骨细胞成骨及矿化水平;采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测ALP、I型胶原蛋白α1（COL1A1）、成骨相关转录因子蛋白（OSX）、骨桥蛋白（OPN）、runt相关转录因子2（Runx2）的mRNA表达水平;采用Western blot检测Wnt 1和β-catenin蛋白水平;采用免疫荧光检测β-catenin分布与表达;采用Wnt/β-catenin信号途径特异性拮抗剂IWR-1验证胡椒碱对成骨细胞成骨分化的信号通路。结果在0～60μmol·L-1浓度范围内,胡椒碱对成骨细胞活力无明显影响（P>0.05）。在0～40μmol·L-1浓度范围内,胡椒碱呈剂量依赖性促进成骨细胞ALP活性（P<0.01或P<0.001）和矿化结节形成（P<0.05或P<0.01）,促进ALP、COL1A1、OSX、OPN和Runx2的mRNA表达水平（P<0.05或P<0.01或P<0.001）,促进Wnt 1和β-catenin蛋白的表达水平（P<0.05或P<0.01或P<0.001）。用IWR-1预处理后,由胡椒碱诱导的成骨细胞的基质矿化受到明显抑制（P<0.01）。结论胡椒碱可通过增强Wnt/β-catenin信号促进成骨细胞的成骨分化。     

20(S)-原人参二醇对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及其机制

目的：探讨20(S)-原人参二醇(PPD)对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的作用,并阐明其成骨诱导机制。方法：采用全骨髓法提取SD大鼠BMSCs,分为对照组和不同剂量(2.5、5.0、10.0、20.0和40.0 mg·L^-1) PPD组,采用CCK-8法检测各组BMSCs增殖活性,采用Calcein/PI染色法观察各组BMSCs存活情况,筛选合适浓度PPD用于后续实验。将BMSCs分为对照组和PPD组,于成骨诱导第7天,采用BCIP/NBT比色法进行碱性磷酸酶(ALP)染色并定量检测各组BMSCs中ALP活性;成骨诱导第21天,采用茜素红染色检测各组BMSCs中矿化结节形成情况并定量分析细胞矿化活性;成骨诱导第7天,采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测各组BMSCs中ALP、1型胶原蛋白(COL^-1)、骨钙素(OCN)和Runt相关转录因子2 (Runx-2) mRNA表达水平,免疫荧光染色法检测各组BMSCs中Runx-2和OCN蛋白表达荧光强度。结果：PPD处理第1和3天,与对照组比较,40.0 mg·L     

鸢尾素对静态和牵张力作用下BMSCs成骨向分化的研究

目的：在静态及牵张力作用下,研究鸢尾素（irisin）对大鼠骨髓间充质基质细胞（bone marrow mesenchymal stromal cells,BMSCs）成骨向分化的影响。方法：分离培养原代大鼠BMSCs,应用四点弯曲加力系统建立体外细胞牵张模型。通过碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性检测在静态及牵张力作用下,不同浓度的鸢尾素对BMSCs成骨向分化的影响并筛选最适鸢尾素浓度。实验分组如下：A,对照组;B,鸢尾素组（100 ng/mL鸢尾素）;C,牵张力组（2 000 με牵张力）;D,鸢尾素+牵张力组（100 ng/mL 鸢尾素+2 000 με 牵张力）。细胞计数法检测各组细胞增殖情况,通过定量逆转录PCR（qRT-PCR）及Western blot检测成骨相关mRNA及蛋白的表达,并检测P38、ERK1/2 MAPK通路表达。采用SPSS 20.0软件对数据进行统计学分析。结果：ALP活性检测结果示,在静态及牵张力作用下,鸢尾素浓度为100 ng/mL时,BMSCs的ALP活性显著升高（P<0.01）。细胞增殖检测结果示,与对照组相比,鸢尾素+牵张力组可促进BMSCs的增殖（P<0.05）。qRT-PCR结果示,鸢尾素+牵张力可促进成骨标志物Runx2、ALP、 COL-Ⅰ、OPN表达的升高（P<0.05）。Western blot结果示,鸢尾素+牵张力可促进Runx2蛋白表达的升高（P<0.05）。此外,鸢尾素+牵张力联合作用促进BMSCs增殖与成骨向分化的机制可能与P38、ERK1/2 MAPK通路的激活有关。结论：鸢尾素对静态和体外牵张力作用下BMSCs增殖及成骨向分化具有促进作用,此效应可能通过P38、ERK1/2 MAPK通路发挥作用。     

EphB6在小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化中的初步研究

目的探讨EphB6在小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSC)成骨分化中的作用及其可能机制。方法将BMSC通过双相接种法接种于脱钙骨基质,分为4组:成骨诱导5、14 d(A、B组),普通培养5、14 d(C、D组),茜素红染色检测钙结节,定量检测各组碱性磷酸酶活性,Runx2、Osterix和EphB6的mRNA表达,采用游离态配体ephrinB1-Fc激活EphB6并重复检测上述指标。结果 ALP活性、Runx2和Osterix在A、B组增高,且B组检测到最高的ALP活性[(7.32±2.02)金氏单位/100 ml]、Runx2(3.442 6±0.258 5)倍和Osterix(2.482 3±0.329 2)倍。EphB6的表达水平在A、B组降低,且在B组最低(0.754 3±0.023 5)倍。以ephrinB1-Fc激活EphB6后,茜素红染色显示钙结节明显减少,ALP活性显著下降(P<0.05),在高浓度配体作用后ALP活性[(12.20±1.30)金氏单位/100 ml]较低浓度配体[(15.40±1.03)金氏单位/100 ml]有进一步下降(P=0.008)。配体作用后,BMSC成骨分化中Runx2和Osterix的表达显著下降。结论 EphB6通过调控Runx2和Osterix抑制BMSC成骨分化。     

脉冲电磁场对大鼠骨髓间充质干细胞增殖、成骨分化和Wnt/β-catenin信号通路的影响

目的 探讨脉冲电磁场（pulsed electromagnetic fields, PEMFs）对大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）增殖、成骨分化以及对Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法 将培养的第3代大鼠BMSCs分为3组。3个组均以LG-DMEM完全培养基培养1 d,待细胞贴壁后更换新鲜培养基,对照组不做干预处理; PEMFs组进行8 Hz、3.8 mT的PEMFs干预,每天40 min,持续21 d;成骨诱导基(OM)组加入成骨诱导剂,不予磁场干预。采用MTT法测定增殖活性;碱性磷酸酶（ALP）、茜素红S染色进行成骨分化鉴定;利用实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术检测Wnt/β-catenin信号通路及成骨分化相关基因的表达。结果 相较对照组,成骨诱导剂在干预第7、14、21 d可提高BMSCs的增殖活性（P<0.05）;PEMFs促增殖作用不明显。在BMSCs分化方面,PEMFs组及OM组ALP、茜素红S染色阳性强度均高于对照组（P<0.05）。定量RT-PCR结果显示,PEMFs组及OM组Wnt1、Wnt3a、LRP5、β-catenin、BMP-2、Runx2、ALP、OC mRNA的表达相较于对照组在相应时间点均有所上调（P<0.05）。PEMFs组各检测结果较OM组低,但趋势基本一致。结论 PEMFs在8 Hz、3.8 mT条件下可促进BMSCs的成骨分化,这可能与激活Wnt/β-catenin信号通路有关。     

BMPER通过Wnt/β-catenin信号通路减轻高糖高脂对MC3T3-E1细胞成骨分化的抑制

目的:探究骨形态发生蛋白内皮细胞前体来源调节因子（BMPER）在成骨分化中的生物学作用。方法:将MC3T3-E1细胞分为对照（control）组、成骨诱导（OM）组和成骨诱导+高糖高脂（OM+HG/PA）组。采用Western印迹法检测各组细胞Runt相关转录因子2（Runx2）、Ⅰ型胶原α1（Col1α1）、BMPER的表达。将空载体对照质粒及BMPER过表达质粒转染到MC3T3-E1细胞中,将细胞分为p-NC和p-BMPER组。使用Western印迹法检测各组细胞BMPER、Runx2、Col1α1、Wnt1、Wnt3a、active β-catenin表达。碱性磷酸酶（ALP）染色检测BMPER对成骨分化的影响。应用非特异性siRNA及合成的靶向沉默BMPER小干扰RNA（siRNA）转染MC3T3-E1细胞,将细胞分为si-NC组及si-BMPER组,使用Western印迹法检测各组细胞Wnt1、Wnt3a、active β-catenin表达。结果:与OM组相比,OM+HG/PA组中Runx2、Col1α1、BMPER蛋白表达显著减少（t=7.572、 8.568、10.742,均P< 0.05）。与p-NC组相比,p-BMPER组Runx2、Col1α1、Wnt1、Wnt3a、active β-catenin蛋白表达水平显著升高（t=9.816、8.331、8.413、14.343、9.156,均P<0.05）,ALP染色加深。与si-NC组相比,si-BMPER组Wnt1、Wnt3a、active β-catenin的表达显著下调（t=10.807、8.678、10.167,均P<0.05）。结论:BMPER通过Wnt/β-catenin信号通路减轻高糖高脂对MC3T3-E1细胞成骨分化的抑制。     

链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化

目的 观察糖尿病大鼠模型骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外增殖、抗凋亡和成骨分化能力。方法 将40只6周龄雌性SD大鼠随机分为2组,每组20只,实验组腹腔注射链脲佐菌素,对照组注射等量的生理盐水。处理10周后,采用贴壁法获得2组大鼠的BMSCs。应用CCK-8检测第2代BMSCs增殖能力,0.3%过氧化氢和血清剥夺诱导的BMSCs凋亡;成骨诱导培养4周后, RT-PCR检测I型胶原蛋白(COL-I)、骨钙素(OCN)和核心结合蛋白因子-2(Runx-2)的mRNA表达水平;应用酶联免疫吸附法定量分析细胞碱性磷酸酶活性;茜素红染色及von Kossa染色分析矿化能力。结果 链脲佐菌素成功诱导制备糖尿病大鼠模型。与对照组比较,实验组BMSCs增殖和抗凋亡能力降低,细胞成骨相关基因表达下降,细胞碱性磷酸酶活性显著降低,细胞成骨分化能力减弱(P<0.01)。结论 糖尿病大鼠来源的BMSCs体外增殖、抗凋亡作用减弱,成骨分化能力显著下降。     

PERK信号通路对实验性绝经后骨质疏松雌性大鼠成骨细胞分化的影响

目的：探讨实验性雌性大鼠绝经后骨质疏松（PMOP）治疗前后骨组织中PERK、ATF4、Runx2、osterix、RANKL和OPG的变化,阐明PERK信号通路在PMOP发生中的作用。方法：复制雌性大鼠卵巢去势骨质疏松模型。45只大鼠分为正常对照组（大鼠不做处理,15只）、骨质疏松组（雌性大鼠卵巢摘除,15只）和骨质疏松治疗组（大鼠卵巢摘除后尾静脉注射雌激素,15只）。观察各组大鼠血清中Ⅰ型胶原（ColⅠ）、碱性磷酸酶（ALP）和骨钙素（OCN）水平。饲养3个月后取各组大鼠股骨骨干做病理切片,RT-PCR法检测各组大鼠骨组织中PERK、ATF4、Runx2、osterix、RANKL和OPG基因表达水平,Westernblotting法分析PERK、ATF4、Runx2、osterix、RANKL和OPG蛋白表达水平。结果：与对照组比较,骨质疏松组大鼠血清中ColⅠ、ALP和OCN水平明显降低（P<0.05或P<0.01）;与骨质疏松组比较,骨质疏松治疗组大鼠血清中ColⅠ、ALP和OCN水平明显升高（P<0.01）。与对照组比较,骨质疏松组大鼠骨组织中PERK、ATF4、Runx2和osterix基因表达水平明显下降（P<0.05或P<0.01）,RANKL基因表达水平明显升高（P<0.01）;与骨质疏松组比较,骨质疏松治疗组大鼠骨组织中PERK、ATF4、Runx2和osterix基因表达水平明显升高（P<0.05或P<0.01）,RANKL基因表达水平明显降低（P<0.01）。与对照组比较,骨质疏松组大鼠骨组织中PERK、Runx2和osterix蛋白表达水平明显下降（P<0.05或P<0.01）,RANKL蛋白表达水平明显升高（P<0.05或P<0.01）;与骨质疏松组比较,骨质疏松治疗组大鼠骨组织中PERK、Runx2和osterix蛋白表达水平明显上升（P<0.05或P<0.01）,RANKL蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。HE染色,与对照组比较,骨质疏松组大鼠骨组织中骨吸收陷窝变大,骨吸收增强,导致骨质流失;与骨质疏松组比较,骨质疏松治疗组大鼠骨质吸收减弱,骨骼恢复正常结构。结论：雌性大鼠卵巢切除及注射雌激素治疗后,其骨组织中PERK表达趋势与成骨细胞转录因子Runx2和osterix变化一致,与破骨细胞转录因子RANKL表达相反,提示PMOP发病时成骨细胞功能减弱与PERK表达下降有关。     

RUNX2/LAPTM5在小鼠颅骨前成骨细胞矿化诱导中的表达

目的 探讨RUNX2/LAPTM5在矿化诱导过程中的表达与成骨及溶酶体的相关性。方法 矿化诱导MC3T3-E1,对照组不做处理,茜素红染色检测矿化情况,碱性磷酸酶染色检测成骨分化情况。RT-qPCR及Western blot检测分化0-5 d RUNX2及LAPTM5的基因及蛋白表达。过表达与干扰RUNX2/LAPTM5的表达后,Western blot检测RUNX2、LAPTM5的表达。过表达与干扰LAPTM5的表达后,Western blot检测成骨相关基因碱性磷酸酶、骨钙素 的表达。结果 倒置显微镜下观察,茜素红染色矿化结节计数随时间变化逐渐增多,矿化结节的大小也逐渐变大;碱性磷酸酶染色蓝紫色颗粒计数随时间逐渐增加。RT-qPCR及Western blot结果显示RUNX2及LAPTM5的表达,其在成骨矿化过程中呈上升趋势（P<0.001）。过表达与干扰RUNX2影响LAPTM5表达（P<0.05）;过表达与干扰LAPTM5对RUNX2的影响不显著。过表达与干扰LAPTM5影响了成骨的表达（P< 0.01）。结论 RUNX2/LAPTM5可能参与了成骨细胞分化调节,RUNX2可能参与LAPTM5的表达调控。RUNX2/LAPTM5可能在溶酶体参与成骨矿化的过程中起到桥梁作用。