复性的乙型肝炎病毒X蛋白突变体HBxΔNΔC具有体外生物学活性（英文）

乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)在肝炎引起的肝癌病变中作为一个多功能调节因子起着关键的作用.对HBx的功能有非常多的体外研究报导,而由于HBx蛋白难以溶解和稳定使得体外的研究报导非常少.我们根据肝癌患者中最常见的截短突变体,在大肠杆菌包涵体中重组表达了一个保留了第12~127位氨基酸的、N端和C端截断的突变体HBxΔNΔC,并使用变复性的方法将其复性溶解.分子筛显示HBxΔNΔC为单体;圆二色谱显示HBxΔNΔC包含有5%的α-螺旋,30%的β-折叠和65%的其他结构.复性的HBxΔNΔC能从人HepG2细胞中拉下(pull-down)肿瘤抑制因子p53和DDB1蛋白,它还能刺激肝细胞的迁移.腹腔注射1μg/g的HBxΔNΔC能明显刺激小鼠肝的生长.这些结果显示HBxΔNΔC具有一定的生物学活性,它可以用来研究体外的HBx结构和分子作用机制.     

ΔNp63γ 和ΔNp63a及其C端在H1299细胞凋亡中的作用

为了研究ΔNp63γ、ΔNp63a及其C端(p63aCT)在细胞凋亡中的作用,本研究扩增出人ΔNp63γ、ΔNp63a和p63aCT编码序列,并克隆至慢病毒表达载体pLVX-HA-Flag.通过将构建的pLVX-ΔNp63a、pLVX-ΔNp63γ、pLVX-p63aCT包装至慢病毒颗粒,感染人肺癌细胞株H1299后,用Western blot检测到ΔNp63γ、ΔNp63a及其C端能在H1299细胞中有效地过表达;通过PI染色以及流式细胞术检测发现ΔNp63a能有效挽救DNA损伤药物Cisplatin(CDDP)诱导的细胞凋亡,而ΔNp63γ和ΔNp63aCT则没有明显的挽救效果.本研究表明,在H1299细胞中,ΔNp63a具有抑制细胞凋亡的作用,其C端可能与其它功能域一起参与此过程.     

影响HIV-GP41N端1/2在E.coli中表达的两段氨基酸序列界定

GP41蛋白二级结构预测显示 ,前 1 /2片段的 N端 ( 4～ 2 6位氨基酸 )和 C端 ( 1 67～ 1 89位氨基酸 )各有一个富含疏水氨基酸的穿膜螺旋 (可能性 >0 .9) ,分别从 N1 (前 1 /2片段无 C端穿膜螺旋 )的 N端和 N6(前1 /2片段无 N端穿膜螺旋 )的 C端进行缺失构建一系列缺失突变体 ,只有 p ET-N2 ,p ET-N3 ,p ET-N4,p ET-N5在大肠杆菌中获得高效表达 ,其表达量占菌体总蛋白的 2 0 % ,Western blot显示表达蛋白与 HIV阳性血清有良好的反应性 .而 p ET-N1 ,p ET-N6在大肠杆菌中表达量很低或不表达 .从而证明 1～ 6位 ,1 84～ 2 0 1位氨基酸是影响 gp41基因 N端 1 /2片段表达的主要因素     

基于铁蛋白的溶栓蛋白纳米粒子的构建及活性分析

将凝血酶激活的低分子量单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(T-uPA)修饰铁蛋白重链亚基(FTH1),构建基于铁蛋白的溶栓蛋白纳米粒子。通过基因工程、体外混合复性等技术,将T-uPA分别修饰FTH1的N和C端并进行对比,表明仅C端融合蛋白才可复性折叠并组装成FTH1/FTH1-T-uPA。通过实验分析,表明FTH1/FTH1-T-uPA基本为中空笼状且分散均匀,粒径为13.41 nm,水合粒径为24.2 nm,T-uPA可成功被凝血酶激活,具有优良的纤维蛋白溶解活性(约1 200 IU/mg);在体外达到与商品化尿激酶相似的溶栓效果,且具有更好的安全性。本研究成功解决了T-uPA修饰铁蛋白的关键问题,为构建靶向型的铁蛋白纳米粒子载药系统提供了基础。     

重组人睫状神经营养因子突变体的制备及PEG修饰

通过大肠杆菌重组表达人睫状神经营养因子突变体(CNTFm),并进行PEG修饰,旨在降低免疫原性.该突变体将天然CNTF的C端15个氨基酸删除,大肠杆菌表达的CNTFm以包含体形式存在,经复性、纯化获得纯度达到95%的目的蛋白.体内生物学活性测定结果显示,给药10 d,小鼠最大体重减少率达31%,产生的最高中和抗体滴度达到1:6 400; 经PEG修饰,CNTF突变体的生物学活性降低了34%,但最高中和抗体滴度降低到1:800.该PEG修饰后的CNTFm制备工艺有望为CNTF的临床应用开辟道路.     

拟南芥膜相关转录因子bZIP60活化后与转录因子MYB7互作共同调控种子萌发

膜相关转录因子在调控植物生长发育、逆境响应中发挥重要作用.拟南芥膜相关转录因子bZIP60在响应生物和非生物胁迫中发挥功能.本研究发现bZIP60的非常规剪接受ABA诱导,bZIP60的突变体zip60在ABA处理后绿色子叶率显著降低,说明bZIP60负调控ABA诱导的种子休眠,促进种子萌发.为了进一步研究bZIP60在其中的作用,以bZIP60Δ为诱饵蛋白对cDNA文库进行筛选,最后筛选到24个可能与bZIP60Δ相互作用的蛋白.体外pull-down实验证明bZIP60Δ蛋白与其中一个MYB7蛋白有直接相互作用,荧光素酶互补实验和双分子荧光互补实验(BiFC)证明bZIP60Δ蛋白与MYB7蛋白在烟草细胞中具有相互作用.MYB7之前报道在种子萌发过程中通过抑制ABI5的表达来解除ABA对种子萌发的抑制.这些实验表明bZIP60活化后可能通过与MYB7相互作用协同拮抗ABA信号,促进种子萌发.     

八肋游仆虫eRF1a的C端是肽链释放因子eRF3的结合区(英文)

真核生物蛋白质合成终止需要两类肽链释放因子,eRF1和eRF3.研究表明八肋游仆虫的两类肽链释放因子在体内和体外都能形成复合物,且第一类肽链释放因子eRF1a与第二类肽链释放因子eRF3的C端结合.为了确定eRF3在eRF1a上的结合区,本研究以八肋游仆虫第一类肽链释放因子eRF1a基因为模板,用PCR的方法获得了N端分别截短140和206个氨基酸的eRF1a片段,同时在这两个片段的3'端融合了编码6个组氨酸残基的核苷酸序列,将这两个序列分别插入原核表达载体pTWIN1,并构建重组表达质粒pTWIN1-eRF1aC1 his6和pTWIN1-eRF1 aC2his6,转入大肠杆菌BL21( DE3)中获得了可溶性表达,通过一步His60 Ni Superflow柱亲和层析,重组蛋白CBD-intein-eRF1 aC1 his6和CBD-intein-eRF1aC2 his6获得纯化.体外pull down分析显示eRF1aC1和eRF1aC2均能与八肋游仆虫第二类释放因子eRF3相互作用,这表明八肋游仆虫eRF1a的C端是肽链释放因子eRF3的结合区.     

人类PIF1蛋白质N-末端多肽的表达纯化和

解螺旋酶参与几乎体内所有的DNA代谢,具有重要的生理功能.为了从分子水平阐述人类PIF1解螺旋酶的生理功能,我们以HeLa细胞的cDNA文库为模版,PCR扩增得到PIF1基因5′端含有1～534核苷酸的cDNA序列-PIFΔC.在PIFΔC的 5′端引入六组氨酸标签后插入pET15b表达载体,得到重组质粒pET15-PIFΔC.以此重组质粒转化RosettaTM 2(DE3)感受态细胞,使PIFΔC蛋白质在大肠杆菌中得到表达.在4℃通过快速液相色谱纯化系统,通过一系列色谱层析柱纯化了PIFΔC蛋白质.以纯化的PIFΔC蛋白质免疫家兔制备了抗血清,并检测了纯化的PIFΔC的生物化学活性.结果显示不含解旋酶模序的人类PIF1蛋白质的N-末端,具有使单链DNA复性的特性.PIF1解螺旋酶具有解开DNA双链和使双链DNA复性这一矛盾的特性,暗示了人类PIF1解螺旋酶可能参与损伤DNA的修复,包括断裂的双链DNA的修复.     

葡激酶突变体Y1-Sak的体外变复性研究

具有低免疫原性的双功能葡激酶突变体Y1-Sak(△15,S16K,K74A,E75A,R77A,K109R,F111D)在大肠杆菌中的表达产物为包涵体,必须进行体外变复性才能得到活性.详细研究了复性方式、pH、温度、复性的初始蛋白浓度和添加L-精氨酸对Y1-Sak的体外变复性的影响,发现复性温度和添加的L-精氨酸对Y1-Sak的复性有重要的影响.经过工艺优化后,Y1-Sak的纯化活性回收率达到40%左右,蛋白比活性由20 kU/mg提高到53 kU/mg.用动态光散射分析发现,工艺优化后复性的高比活性Y1-Sak的水合动力学半径与野生型葡激酶相近,分子基本处于单体状态.     

重组纤溶酶原激活剂及其突变体的表达研究

利用PCR技术 ,获得了人体组织型纤溶酶原激活剂tPAcDNA的缺失突变体———rPA ;在此基础上 ,运用定点突变技术 ,得到rPA的定点突变体———rPA(KHRR2 96～ 2 99AAAA) ,rPA(A473S)和二者的复合突变体rPA(KHRR2 96～2 99AAAA A473S) ;将rPA及其 3个突变体分别亚克隆至原核表达载体pET 2 8a( )中 ,获得表达载体pErA ,pErA(K) ,pErA(A)和pErA(KA) .酶切鉴定和序列分析结果均表明实现了实验设计的氨基酸突变 .表达载体转化大肠杆菌 ,经IPTG诱导、菌体裂解及SDS PAGE电泳分析发现 ,只缺失而无突变的pErA和突变的pErA(A)都未表达目的蛋白 ,突变体pErA(K)与pErA(KA)则获高水平表达 ;蛋白产量分别占菌体总蛋白的 35 .97%与 37.71% ,分子量均为 39.6kD .Westernblotting显示 ,表达产物与抗tPA抗体呈特异性阳性反应 .该产物经初步纯化后进行复性与活性 (mFAPA)测定 ,结果表明其复性产物具有明显的体外纤溶活性 .以上结果为rPA突变体的进一步纯化、体内活性研究以及规模化制备提供了基础     

重组果蝇Merlin蛋白的表达与纯化

NF2基因的的缺失会导致Ⅱ型多发性神经纤维瘤的发生.NF2又称Merlin,和ERM蛋白家族成员类似,Merlin蛋白N端的FERM结构域与C端的CTD结构域存在分子内的相互作用,从而形成一种自抑制的闭合构象;当Merlin蛋白N、C端分子内的相互作用被破坏时,能释放出N端的FERM结构域,从而能与许多效应因子相互作用...     

SUMO融合表达对淀粉酶N-Amy活性的影响

前期解析了一个来自嗜碱菌Bacillus pseudofirmus 703的新型的碱性淀粉酶Amy703,该酶含有一个未知功能的N端结构域,将该结构域缺失后得到的突变体N-Amy相对野生型Amy703比酶活提高了35倍;底物结合实验显示Amy703可以结合不可溶性底物,单独的N端结构域和N端结构域缺失突变体N-Amy都不能结合,推测N端结构域会造成催化结构域的结构变化从而引起比酶活的大幅提高.为了进一步探究Amy703特异的N端结构域造成酶活显著下降的原因,将Amy703的N端结构域替换为SUMO蛋白,实验结果显示裂解液上清的SUMO/N-Amy条带比Amy703粗亮,验证了SUMO蛋白的促可溶性作用;但纯化后的融合蛋白SUMO/N-Amy的比酶活显著低于N-Amy,仅和野生型Amy703的比酶活相当,表明SUMO与N-Amy的融合显著降低了酶活,同时也预示着N端多一段结构域会影响到催化结构域的结构变化.此外,对SUMO/N-Amy融合蛋白是否与底物结合进行了探讨,为进一步解析Amy703的N端结构域功能提供了实验依据.     

关于小分子热休克蛋白Hsp16.3各功能区作用的初步研究

小分子热休克蛋白Hsp16.3是一种存在于结核杆菌中的重要抗原,具有小分子热休克蛋白家族成员典型的3个功能区:N端疏水区,α-crystallin域和C端较短的非保守区.为了进一步研究其各功能区的作用,我们定义了Hsp16.3的3个功能区并在大肠杆菌中分别克隆、表达和纯化了N端区或C端区缺失的两个Hsp16.3残体蛋白.远紫外和近紫外圆二色谱分析结果显示,残体蛋白表现出与野生型蛋白相似的二级和三级结构.在九聚体野生型蛋白进行亚基重组装时,C端缺失的Hsp16.3残体蛋白能与野生型蛋白发生相互作用,形成异源寡聚体.在对野生型蛋白进行胰酶消化时,Hsp16.3的α-crystallin域对胰酶的消化具有抵抗能力.所有这些结果显示:在Hsp16.3的3个功能区中,α-crystallin域是一个相对独立和稳定的结构单元,它对该蛋白各级结构的维持十分重要.     

基因工程血管抑素3A蛋白的分离纯化

在8mol／mL尿素溶液中,以二硫苏糖醇(DTT)为还原剂,对基因工程血管抑素3A包涵体进行溶解实验。结果发现：1．5h后溶解的上清液蛋白浓度达26．2mg／mL。SDS-PAGE电泳扫描结果显示,3A蛋白经过Sephadex G75分离后PAGE电泳纯达到100％,该步收率达85．82％,相对分子质量为10ku。采用分步稀释法对其进行复性,所获复性3A蛋白经MTT法检测表明：3A蛋白浓度为0．1μg／mL时,对内皮细胞的生长抑制率为93．4％。     

重组人尿激酶原的工业化制备与性质研究

将含有 pET2 9a prouk重组质粒的人尿激酶原工程菌经 10L种子罐培养及 10 0L发酵 ,IPTG诱导表达 ,其表达量为占菌体总蛋白的 2 0 % ,表达产物经体外变复性 ,CM 纤维素离子交换层析 ,Superdex 75分子筛层析及Affi preppolymyxinsupport亲和层析去热源 ,每 10 0L发酵液得重组人尿激酶原纯品 6g ,纯度达 95 %以上 ,比活大于 1.2× 10 4 IU /mg ,双链含量低于0 .5 % ,内毒素及热源含量、宿主蛋白残留量、宿主DNA残留量等均达到临床使用标准 .其分子量 (质谱测定 )、氨基酸组成、N、C 端氨基酸序列分析等均与理论值相符 .进行了等电点及肽图等性质研究     

藏木香石油醚快速溶剂萃取物体外抑制肝癌细胞增殖活性研究

为充分开发利用藏药资源,对藏木香进行体外抗肝癌活性评价,并对活性部位的细胞毒活性及初步抗肝癌机制进行研究.运用快速溶剂萃取法制备藏木香的各溶剂提取物,采用MTT法、细胞形态学观察、Hoechst 33258荧光染色、流式细胞术和蛋白免疫印迹等分析藏木香各提取物抗肝癌活性及活性部位抗肝癌机制.藏木香石油醚提取物(IR-Pe)对HepG2和Hep3B都有良好的抗肝癌活性,其IC50值分别为21.9 ± 2.3 μg·mL－1、27.6 ± 2.5 μg·mL－1,且对正常肝细胞L-02在100 μg·mL－1未显示出毒性.IR-Pe对HepG2和Hep3B两个肝癌细胞株皆显示出显著的时效和量效关系;细胞形态学观察及流式细胞术显示IR-Pe明显的诱导肝癌细胞凋亡.IR-Pe明显地上调Bax和切割后的caspase-3蛋白的表达,同时下调Bcl-2蛋白的表达.IR-Pe具有良好的体外抗肝癌活性,其通过调控线粒体通路诱导肝癌细胞凋亡发挥抗肝癌活性,具有极大的开发应用潜力.     

Δ-直向模

设A是一个拟遗传代数,F(Δ)是A的Δ-好模范畴.F(Δ)中一个不可分解模X称为Δ-直向的,如果它不属于F(Δ)中的任意一个循环.利用F(Δ)的二次型及其Auslander-Reiten箭图的性质, 研究了Δ-直向模, 证明了如果F(Δ)中的所有不可分解模都是Δ-直向的, 那么F(Δ)是有限的,即在同构意义下,F(Δ)中只有有限个不可分解模.     

人血管能抑素免疫兔抗血清制备及其特性测定

纯化的人血管能抑素包涵体进行SDS-PAGE分离，切胶回收目的蛋白，与弗氏不完全佐剂充分乳化后，进行多点皮下注射免疫新西兰白兔，制备兔抗人血管能抑素抗血清，抗血清去除交叉反应抗体后，进行Western Blotting分析抗血清与人血管能抑素及其N端和C端片段的抗原抗体反应特性。结果表明，经过4次加强免疫后，获得了高效价的兔抗人血管能抑素抗血清。抗血清去除交叉反应抗体后，Western Blotting分析表明，它能与人血管能抑素发生特异的抗原抗体反应，同时还能与人血管能抑素的N端片段和C端片段发生特异性较弱的抗原抗体反应。证明制备的兔抗人血管能抑素抗血清能应用于人血管能抑素及其N端和C端片段免疫学研究中。     

用气相色谱法分析大麻籽油中的Δ~9-四氢大麻酚

报导了一个测定大麻籽油中Δ9 四氢大麻酚含量的微量分析方法.用甲醇 石油醚提取大麻籽油中的Δ9 四氢 大麻酚,然后通过活性氧化铝柱层析净化,再对其进行气相色谱测定.实验平均回收率为88%,变异系数为4.1%,最低检出限为0.2μg/L.     

人P53的原核表达及包涵体复性研究

通过检测血清中p53蛋白及其抗体变化诊断肿瘤的ELISA试剂盒的研发需要大量制备p53蛋白.本研究通过构建人野生型p53基因的原核表达质粒pET-32a-p53,在大肠杆菌中诱导表达得到p53包涵体蛋白,经包涵体变性、亲和纯化、复性得到可溶p53蛋白.发现利用8M尿素对包涵体进行变性溶解,经镍柱亲和纯化得到纯度超过95%的变性蛋白.尝试透析复性、稀释复性和柱上复性3种方法分别对p53变性蛋白进行复性.结果表明透析复性的复性率最高,这为原核表达制备p53提供了一种参考.本研究为ELISA法检测血清中p53蛋白及其抗体诊断肿瘤相关试剂盒研发奠定了基础.