拟南芥启动子rd29A在长春花中的瞬时转化及功能鉴定

拟南芥诱导型启动子rd29A作为低温及盐胁迫的诱导型启动子,其在长春花中的生物学功能为长春花转基因植物的构建提供了一个可控的基因表达体系。本研究通过克隆拟南芥启动子rd29A,替换双元载体p BI121中组成型启动子Ca MV 35S构建表达载体rd29A::GUS,经根瘤农杆菌(GV3101)介导转化长春花顶端分生组织实现GUS基因在rd29A启动子驱动下的瞬时表达。表明:同常温条件(25℃)相比,经低温诱导(4℃)12 h后长春花中GUS基因表达量升高了四倍,GUS染色也同时证明了低温可成功诱导rd29A启动子在长春花中的生物学活性,进而为长春花诱导型基因表达的转基因植物构建提供了可行的理论依据。     

大豆CHI1基因启动子的克隆及功能初探

为了解大豆ClassⅠ几丁酶基因(Chitinase gene)对不同胁迫响应的分子机制。利用PCR技术克隆了大豆ClassⅠChitinase基因的启动子片段(Gm CHI1p),序列分析表明,扩增片段(1 641 bp)与Gen Bank中的已知序列同源性达99.8%,且含有多个胁迫响应调控元件。利用GUS基因上游无启动子的表达载体p CAMBIA1391Z,构建GmCHI1p与GUS基因融合的植物表达载体pCAM-Gm CHI1p,并通过农杆菌介导法导入烟草中。在转基因烟草愈伤组织中检测到GUS活性,表明该启动子具有启动活性。对转基因烟草中的GUS活性进行初步定性分析,结果表明,GmCHI1p可驱动GUS基因在转基因烟草的根部特异性表达,而且在伤害处理的叶片中检测到GUS的强烈表达,表现出明显的根组织特异性及伤害诱导性。这种伤害诱导仅在伤害组织部位及其附近高效表达而没有被长距离传递,预计该启动子在转基因抗虫分子育种中具有巨大的应用前景。     

Ta6-SFT在烟草中的逆境诱导型表达及抗旱性

分别构建CaMV35S启动子驱动的Ta6-SFT组成型植物表达载体和rd29A启动子驱动的逆境诱导型表达载体。利用农杆菌介导法分别导入烟草中,获得转基因株系,Southern杂交和Northern点杂交确定Ta6-SFT整合进转基因株系基因组中,并正常转录。以非转基因株系作对照,对2种转基因烟草株系进行干旱胁迫处理,采用半定量RT-PCR分析Ta6-SFT在转基因株系中的表达,同时测定胁迫0 d和18 d果聚糖含量及部分农艺性状。结果表明,含有rd29A启动子的逆境诱导型株系中Ta6-SFT相对表达量比在含CaMV35S启动子的组成型株系中高,而且积累更多的果聚糖;从株高、1/2株高处茎粗、叶面积数据来看,逆境诱导型转基因株系的生长势优于组成型株系,对干旱表现强的耐性。因此,在转基因植物中逆境诱导型表达Ta6-SFT基因将发挥更好的抗逆功能。     

逆境诱导型启动子rd29A诱导ipt基因转化烟草的研究

构建诱导型启动子rd29A驱动下ipt基因表达载体,经农杆菌介导转入烟草,同时构建CaMV35S启动子驱动下的ipt表达载体作为对照,以研究两种启动子诱导下目的基因的表达差异.同时对遗传转化后的外植体进行常温(25℃)和4℃低温诱导处理,比较分析不同温度及处理时间对rd29A-ipt及35S-ipt转化的受体材料的愈伤组织诱导、生长和分化情况的影响,结果表明:rd29A启动子在4℃低温诱导12h时,能够很好的调控ipt基因的表达,使烟草外植体正常分化,获得较高的抗性愈伤诱导率,与转rd29A-ipt植株在常温处理以及对照载体低温和常温三种处理之间差异性显著.35S启动子由于诱导ipt基因过量表达而使植株生长受到抑制.PCR检测结果表明ipt基因和rd29A基因已整合到烟草基因组中.     

拟南芥rd29A基因启动子克隆及其在马铃薯抗胁迫转基因中的应用

从拟南芥（Arabidopsis thaliana）基因组中用PCR技术分离了rd29A基因上游824 bp的调控序列,序列分析表明该片段与已报道的rd29A启动子有99.39%的同源性,包括缺水诱导表达元件DRE、ABA作用元件ABRE等顺式作用元件。将此片段与GUS基因连接构建了植物表达载体pBIrd,用农杆菌介导法获得了转基因马铃薯植株。对转基因植株进行G     

受多逆境诱导表达的GhWRKY64基因启动子克隆与功能分析

WRKY蛋白属于锌指型转录调控因子,参与植物生长发育及耐逆响应。以陆地棉遗传标准系TM-1为材料,克隆Gh WRKY64(KF031101)基因上游1064 bp的启动子序列,并对其调控元件及功能进行分析。生物信息学分析表明,该区域含18个组织器官表达及诱导表达关键元件,分别为6个ROOTMOTIFTAPOX1根特异调控元件,4个CACTFTPPCA1叶肉特异性调控元件、4个OSE2ROOTNODULE病菌诱导元件、2个GTIGMSCAM4盐调控元件和2个W-box胁迫应答响应元件。将该启动子与GUS基因融合,构建p BIW64:GUS植物表达载体,通过农杆菌介导叶盘转化法获得12个转基因烟草株系。选择GUS表达量最高的p BIW64-5进行转基因不同组织器官表达及诱导表达分析。GUS组织化学染色显示,苗期的转基因烟草植株在叶和根部均具有GUS活性,开花期在转基因烟草植株根、叶及叶柄均检测到GUS活性,特别在转基因烟草的根及根尖部分染色更深,在茎和花组织上未检测到GUS活性。对该转基因烟草幼苗进行黄萎病菌诱导处理,诱导48 h后,转基因烟草幼苗根和叶片的GUS染色比未诱导处理的对照明显加深。结果表明,Gh WRKY64上游1064 bp长度的DNA序列,具有启动子的相关顺式作用元件,且为病原菌诱导型启动子。该启动子可为开展棉花抗黄萎病转基因研究提供调控元件。     

甘菊DlBADH1基因启动子DBP12表达特性研究

用pCAMBIA1305.2做载体,构建含有甘菊(Dendranthema lavandulifolium)DlBADH1基因(登录号:DQ011151)启动子DBP12(登录号:DQ497621)的质粒pCHW-2.利用叶盘转化法,通过农杆菌EHA105菌株介导,将重组质粒导入烟草叶片.采用GUS组织活性检测法鉴定烟草转基因植株,结果表明:DPB12启动子驱动的GUS基因表达无组织特异性.对转基因植株进行NaCl、ABA、SA处理,GUS荧光测定发现:100μmol/L ABA胁迫处理24 h和400 mmol/LNaCl胁迫处理48 h,转pCHW-2烟草植株叶片中GUS酶活性均有大幅度提高.该结果表明:DlBADH1基因启动子DBP12是一个诱导型启动子.这一研究结果为进一步研究甘菊中BADH基因调控表达机理提供了参考.     

GmCYP78A5基因启动子的克隆及表达分析

利用PCR技术从大豆(Glycine max L.Merrill)中分离了细胞色素P450基因(cytochrome P450,CYP-78A5)的启动子,序列分析结果表明,扩增片段大小为1 650 bp,与已报道序列的相应区域同源性达99.21%。RT-PCR结果表明,CYP78A5基因在大豆不同组织中的表达存在差异,在未成熟种子中表达水平较高,在茎(上胚轴与下胚轴)中有微弱表达,而在根、叶、花组织中不表达。将该启动子片段与GUS报告基因融合在一起,构建了植物表达载体,并用农杆菌介导法导入了烟草(Nicotiana tabacum)中。对转基因烟草植株中的GUS表达分析表明,Gm CYP78A5启动子可驱动GUS报告基因在转基因烟草的幼苗根上部组织、花器官的花萼和花柄组织及种子中高效表达,而在其他部位均未检测GUS活性。     

中棉(Gossypium arboreum)光诱导基因Gacab启动子在转基因烟草中的功能缺失分析

分离了金华中棉(Gossypiun arboreum var.jinhua)光诱导基因cab 5'上游的调控序列1 009 bp,并对其功能进行了分析,证明获得的这一DNA片段具有驱动光诱导表达的功能.为了进一步分离具有最大转录活性的最小光诱导启动子,根据光诱导表达调控元件所在的位置,构建了Gacab P和197 bp、504 bp、779 bp的5'端缺失体,并将这些缺失体分别与gus(uid A)基因融合,构建植物表达载体.用农杆菌介导法转化烟草,获得转基因烟草.GUS组织化学分析表明,转基因烟草的T1代种子在光下培养时,只有Gacab P驱动gus基因在转基因烟草的叶片表达,其他3个启动子驱动gus基因在转基因烟草的整个植株中均有表达;当转基因烟草的T1代种子在暗中萌发及培养时,GacabP驱动gus基因在转基因烟草中无表达,其他3个启动子驱动gus基因在转基因烟草的整个植株中均有表达.GUS定量分析表明,-504～-1 bp的启动子缺失体启动活性最高,比CaMV35S启动子高0.6倍.上述结果表明只有全长的Gacab启动子具有光诱导和绿色组织特异表达特性,且-504～-1 bp的启动子缺失体启动活性最高.     

大豆低温诱导启动子GmERF9P的克隆及活性鉴定

为获得低温诱导基因GmERF9启动子,并分析该启动子的功能,利用PCR技术从大豆叶片基因组DNA中克隆1885bp的GmERF9启动子序列GmERF9P。序列分析表明,GmERF9P序列中含有多种与逆境相关的顺式作用元件。将GmERF9P构建到植物表达载体pCAMBIA1301上并转化烟草。通过PCR检测共获得6株T_1阳性转基因烟草株系。对野生型烟草和转基因烟草进行低温处理2h,通过GUS组织化学染色和实时荧光定量PCR检测GUS基因的表达量。结果显示GmERF9P在低温处理下能够提高GUS基因的表达量,具有低温诱导启动活性。     

棉花种子特异表达的LEA启动子克隆及功能验证

以棉花品种新陆早33号为材料,克隆获得其胚胎发育晚期丰富蛋白LEA基因的种子特异性启动子。启动子序列全长为1228bp;作用元件分析表明该区域除了具有启动子核心调控序列外,还含有多个与组织特异性、激素、逆境等表达相关的顺式作用元件,如E-box、ABRE元件、A-box等。与已报道的棉花品种Coker 201的LEA基因D34的5'端上游调控序列1212bp相比,两者具有97%的一致性。拟南芥遗传转化的功能分析结果表明,所克隆的序列能驱动GUS基因在种子中特异表达,且GUS主要在转基因植物的种子发育后期表达;其表达强度要弱于组成型的CaMV35S启动子。研究结果不仅有助于进一步深入认识棉花LEA基因功能及其表达调控规律,也为植物遗传转化提供组织特异性的启动子。     

拟南芥2-甲基-6-叶绿基-1,4-苯醌甲基转移酶启动子在转基因烟草中的表达特性分析

通过对报告基因GUS产物的分析进行了拟南芥2-甲基-6-叶绿基-1,4-苯醌甲基转移酶（MPBQ MT）启动子在转基因烟草中的表达特性的初步研究。构建含该启动子和GUS报告基因的植物表达载体,通过农杆菌介导转化烟草,对转基因烟草进行GUS组织化学染色和GUS荧光定量分析该启动子表达特性。GUS在转基因烟草的根和种子中基本不表达,茎上有一定表达,叶上表达量最高,约是茎的4.7~10.9倍。结果表明MPBQ MT基因启动子主要在烟草绿色组织中特异性高表达。     

烟草绒毡层特异启动子pTA29在棉花中的表达特性

烟草绒毡层特异启动子pTA29 (TA29 promoter)已用于多种植物雄性不育和花粉发育的研究。作为外源特异表达启动子pTA29在棉花中的表达特性尚不清楚,为了研究该启动子在棉花中的表达特异性,本文构建了pTA29:gus融合基因,并将其转入棉花。研究发现在GUS染液中添加10%的乙醇可以抑制棉花花药内源GUS活性。用改良的GUS染液进行组织化学染色表明,pTA29:gus转化植株的GUS活性主要存在于花药中,并在花蕾长为6 mm和15 mm的花药中有2个活性高峰,而在根、茎、胚珠、花瓣、苞叶中未被检测到。与烟草不同,在pTA29:gus棉花转化植株的叶片表皮毛和花粉中也能检测到GUS活性。定量RT-PCR分析表明转化子中gus基因的转录水平与GUS活性一致。上述结果表明,烟草绒毡层特异启动子pTA29可以控制下游基因在棉花花药中优势表达;在利用该启动子进行棉花基因功能以及雄性不育研究时,应注意该启动子在棉花中的表达范围和组织特异性。     

酿酒酵母NHX1基因克隆与烟草表达分析

提取酿酒酵母DNA，PCR法合成片段长度为1902bp的NHX1基因，构建植物高效表达载体转化烟草，经PCR扩增、GUS酶染色分子鉴定后，应用荧光定量PCR分析转化材料幼根NHX1基因的转录水平，并将各转化材料T1代烟苗移栽至中间试验隔离圃中，化验分析烟叶内在成分。获得抗卡那霉素、NHX1基因PCR扩增和GUS染色阳性的转化子42株，在转化材料幼根中可检测到外源基因NHX1转录的mRNA分子；烟叶内在成分化验结果表明T1代转化材料烟叶含钾量增加30％，总糖含量显著降低，证明NHX1基因除了与Na^＋运输有关还与K^＋的吸收和糖分运输有关。     

一个棉花纤维伸长期优势表达启动子pGhFLA1的克隆与鉴定

棉花纤维是研究单细胞生长发育的良好模式细胞,寻找在棉花纤维发育时期优势表达的启动子,对于棉花纤维发育的功能基因组研究非常重要。本试验对发掘到的一个在纤维伸长期优势表达基因GhFLA1的启动子进行克隆,并将该启动子融合GUS转化棉花和烟草。转基因棉花的GUS蛋白染色表明,在0~20 DPA(days post anthesis)的纤维中检测到GUS蛋白,同时在柱头、雄蕊、萼片、胚根、子叶和根中也检测到GUS蛋白,但在花瓣、叶片和苞叶中没有检测到。同时GUS定量检测结果显示,pGhFLA1驱动GUS蛋白积累的高峰是在20 DPA的纤维中,其驱动GUS表达的能力是Ca MV 35S::GUS的22倍。转基因烟草组织化学染色显示pGhFLA1可以驱动GUS在叶片及叶片的表皮毛中优势表达,同时在子房、柱头、花药、苞叶、花柄基部、花瓣、种子等生殖器官上也存在GUS蛋白。启动子pGhFLA1在棉花纤维和烟草叶片的表皮毛中优势表达,可用于棉花纤维功能基因组研究,在改良纤维品质育种中具有潜在的应用价值。     

中棉(Gossypium arboreum)光锈导基因Gacab启动子在转基因烟草中的功能缺失分析

分离了金华中棉(Gossypiun arboreum var. jinhua)光诱导基因cab 5'上游的调控序列1 009 bp,并对其功能进行了分析,证明获得的这一DNA片段具有驱动光诱导表达的功能。为了进一步分离具有最大转录活性的最小光诱导启动子,根据光诱导表达调控元件所在的位置,构建了Gacab P和197 bp、504 bp、779 bp的5'端缺失体,并将这些缺失体分别与gus (uid A)基因融合,构建植物表达载体。用农杆菌介导法转化烟草,获得转基因烟草。GUS组织化学分析表明,转基因烟草的T1代种子在光下培养时,只有Gacab P驱动gus基因在转基因烟草的叶片表达,其他3个启动子驱动gus基因在转基因烟草的整个植株中均有表达;当转基因烟草的T1代种子在暗中萌发及培养时,Gacab P驱动gus基因在转基因烟草中无表达,其他3个启动子驱动gus基因在转基因烟草的整个植株中均有表达。GUS定量分析表明,–504 ~ –1 bp的启动子缺失体启动活性最高,比CaMV35S启动子高0.6倍。上述结果表明只有全长的Gacab启动子具有光诱导和绿色组织特异表达特性,且–504 ~ –1 bp的启动子缺失体启动活性最高。     

番茄果实特异性启动子2A11的基因克隆及功能研究

采用巢式PCR技术从番茄基因组DNA克隆到长度1.3kp的果实特异性2A11启动子基因。序列分析表明,克隆到的基因序列2A11启动子转录起始位点上游的621bp处缺失了已报道的番茄2A11启动子基因（GenBank ID M87659,1993）序列中的“tatattgttaacttcttgttgaattaaagcaat”片段,其同源性为61%,登入GenBank,ID号为DQ453963;构建植物表达载体pCAMBIA2A11,用农杆菌介导侵染番茄果实,GUS基因瞬间表达结果表明,该2A11启动子基因具有驱动GUS基因在番茄果实中特异性表达的功能。研究结果表明成功地获得2A11果实特异性启动子基因,为下一步转基因番茄口服疫苗的研制奠定了一定的基础。