牛体外受精胚胎一步脱防冻剂冷冻方法的研究

为了研究适合于牛体外受精胚胎的一步除防冻剂的冷冻方法，特进行两个试验。试验１分别用１．５Ｍ甘油＋０．２５Ｍ蔗糖、１．５Ｍ乙二醇和１．５Ｍ丙二醇作防冻剂冷冻体外受精后第７天，已发育至囊胚阶段的牛胚胎。使胚胎降温至－７℃后，植冰，然后以０．３℃／分的速率降温至－３０℃，立即将胚胎投入液氮中冷冻保存。在３７℃水中解冻胚胎后，使其直接在含１５％胎犊血清（ＦＣＳ）的磷酸缓冲液（ＰＢＳ）中脱去防冻剂。经体外培养７２ｈ后，３组胚胎的孵化率分别为７７．２７％（１０２／１３２）、７３．２４％（１０４／１４２）、４７．９０％（５７／１１９），第１、２组的孵化率极显著高于第３组（Ｐ＜０．０１），说明用１．５Ｍ丙二醇溶液冷冻的胚胎，在解冻后不宜直接在ＰＢＳ中脱防冻剂。试验２比较用不同浓度（１．０Ｍ０１．５Ｍ，２．０Ｍ）的乙二醇和不同投液氮温度（－２５℃，－３０℃，－３５℃）冷冻胚胎的效果。结果表明乙二醇浓度和投液氮温度对胚胎孵化率均无显著影响（Ｐ＞０．０５），各组胚胎的孵化率变动于７４．４４％－８５．４８％之间。     

体外受精后不同时间收集的牛胚胎的冷冻效果

比较了体外受精后不同时间收集的牛囊胚期胚胎冷冻后的存活率。试验一收集受精后第６，７，８和９天出现的胚胎，分３步加入０．７５ｍｏｌ／Ｌ甘油和０．５ｍｏｌ／Ｌ丙二醇，将胚胎装入０．２５ｍＬ细管后，放入已降温至５℃的冷冻机内，立即以２℃／ｍｉｎ的速率降温至－７℃，停留５ｍｉｎ后植冰。植冰后５ｍｉｎ，以０．３℃／ｍｉｎ的速率降温至－２５℃，取出胚胎，并立即投入液氮中保存。解冻时，先让细管在空气中暴露１０ｓ     

牛体外受精胚胎的玻璃化冷冻及一步脱防冻剂的研究

在过去的１０年中,体外受精技术进展很快,目前已可以利用该技术在实验室内大批量生产牛胚胎。研究简单、有效的冷冻方法无疑会加速体外受精胚胎在生产中的推广应用。玻璃化冷冻法由于操作简便,可以快速冷冻胚胎而日益受到重视。过去的研究已证实,用２５％乙二醇＋２５...     

不同浓度防冻剂和投液氮温度对牛体外受精胚胎冷冻效果的影响

比较了3种不同浓度的甘油（1.4,1.0,0.7mol/L）和投液氮温度（-25℃、-30℃和-35℃）对牛体外受精胚胎冷冻效果的影响。结果发现,最终投液氮温度为-25℃时,胚胎冻后存活率以1.4mol/L甘油组为最高,同1.0mol/L甘油组相比,差异显著（78.5%vs 64.5%,P〈0.05）;与0.7mol/L甘油组相比,差异极显著（78.5%vs53.5%,P〈0.01）。以1.0mol/L的甘油冷冻,-30℃投液氮的效果优于-25℃的,它们之间冻后胚胎的孵化率差异显著（77.1%vs 64.5%,P〈0.05）。用0.7mol/L甘油冷冻,投液氮温度以-30℃的为最好,冻后胚胎的孵化率（73.3%）极显著（P〈0.01）高于-25℃的（53.5%）。用1.4mol/L甘油冷冻,以-25℃投液氮为最好,冻后胚胎的孵化率（78.5%）显著（P〈0.05）高于-35℃的（65.7%）。结果表明,不同的甘油浓度和投液氮温度对牛体外受精胚胎的冷冻效果有显著的影响。     

在不同溶液和容器中短期保存牛体外受精胚胎的效果

为提高室温保存牛体外受精胚胎的效果，特进行了３个试验。试验一分别用３种保存液（ＰＢ１，ＴＣＭ－１９９，Ｈａｍ′ｓＦ－１０）、两种容器（玻璃试管，ＡＡ２０１塑料细管）在２０℃保存胚胎２４ｈ。结果表明，保存液对保存效果无显著影响，在３种保存液中保存第７、８天囊胚的总孵化率分别为７４．７％，７１．８％，７５．５％（Ｐ＞０．０５）。用试管保存的胚胎总孵化率（８３．６％）明显优于用ＡＡ２０１塑料细管保存的（６０．８％）（Ｐ＜０．０１）。试验二比较了用ＰＢ１在两种型号的细管（ＡＡ２０１，ＺＡ４７５）中保存胚胎的效果。胚胎在ＺＡ４７５细管中保存后的孵化率（８９．４％）显著高于在ＡＡ２０１细管中保存的（７６．３％）（Ｐ＜０．０１）。试验三用ＰＢ１在ＺＡ４７５细管中保存第７天囊胚３～７ｈ或１８～２４ｈ，将１枚胚胎移入已授精的、处于发情周期第７天的受体母牛黄体对侧的子宫角内。两组受体牛的妊娠率（分别为６０．３％，６８．３％）和双胎率（分别为４５．７％，６９．８％）均较高，而且差异不显著（Ｐ＞０．０５），说明胚胎可在ＺＡ４７５细管中成功地保存２４ｈ。     

牛体外受精四种方法的比较

本研究发现，细管精液解冻后，不宜直接用于牛卵线细胞的体外受精。但将其悬浮４０分钟后离心或使用Ｐｅｒｃｏｌ梯度离心后的精液，体外受精均获得较高的卵裂率（８１．８％、８５．８％）和囊胚率（４７．２％、５０．７％）。作为对照组的标准程序其卵裂率及囊胚率为８６．７％、５２．７％，三者之间比较无差异，可根据具体需要选择使用三种方法之一。悬浮方法可获得较多的第７天囊胚特别是一级囊胚。     

不同因素对牛体外受精效果的影响

比较公牛个体、精子密度、精卵比例、受精前机械脱除卵丘细胞及胚胎培养液体积对体外受精效果的影响。结果表明:不同公牛个体的精子受精的卵裂率差异不显著(P>0.05),但囊胚率受到极显著的影响(52.24%vs28.13%,P<0.01);精子密度在(0.5~1.5)×106/mL间的卵裂率和囊胚率差异都不显著(P>0.05),但精子密度在0.25×106个/mL时的卵裂率显著低于其他3个试验组(52.17%vs91.23%,P<0.05);受精时,精卵比控制在2 000~10 000∶1之间,受精卵的卵裂率、囊胚率均无差异(P>0.05);受精前机械脱除卵丘细胞对受精效果没有影响(45.21%vs36.46%,P>0.05);每枚胚胎培养液体积在2.5~10μL之间的群体培养,对受精胚的发育没有显著影响(51.39%vs35.06%,P>0.05)。     

不同冷冻方法对牛体外受精胚胎冷冻效果的影响

通过采用程序降温法(试验1:分步法10%甘油;试验2:直接法1.8mol/L乙二醇+0.1mol/L蔗糖)和玻璃化法(试验3:20%甘油+0.3M蔗糖+0.3M木糖+3%聚乙二醇+20%乙二醇)对牛体外受精胚胎进行冷冻保存及解冻后进行孵化培养试验,用囊胚孵化率对各方法进行了比较。结果表明,10%甘油组、1.8mol/L乙二醇+0.1mol/L蔗糖组及玻璃化组胚胎存活率分别为85%、82.5%、90%;囊胚孵化率分别为50%、55%和80%(P<0.05)。体外受精胚用玻璃化法保存显著优于程序降温法,可获得较高的胚胎存活率(90%)和囊胚孵化率(80%)。     

牛体外受精的精子处理方法对受精率和胚胎发育的影响

从屠宰场获得牛的卵巢 ,成熟培养用 TCM1 99 犊牛血清 ;体外受精的精子获能处理 ,以 BO液作为基础液。 BO液 肝素钠为对照组 ,对照组中分别添加 Caffein、Theophelline和 Pentoxifylline3种黄嘌呤诱导体为试验组 ,每组分别处理相同的 3头种公牛冷冻精液。用醋酸 Orcein染色 1 h检查受精精况。结果表明 ,平均受精率试验组均高于对照组 ( P <0 .0 1 ) ;DAY8平均囊胚率 ,Caff、Theo、Pent组分别为 2 0 .4 %、1 9.3 %、2 1 .2 %。 3种黄嘌呤诱导体中以 Pentoxifylline的效果最好     

开放式拉长细管冷冻法对牛卵母细胞体外受精后发育的影响

在常规牛体外受精(IVF)技术的基础上,分别采用开放式拉长细管 (OPS,open pulled straw)法和细管法对未经成熟培养的卵丘卵母细胞(COCs)进行玻璃化冷冻,解冻后再进行体外成熟(IVM)、IVF和早期胚胎的体外培养(IVC)。结果表明,细管组和 OPS组的解冻后 COCs正常率分别为 59.4%±4.3%和 77.9%±4.1%(P<0 01);成熟率分别为48.2%±5.3%和66.0%±5.8%(P<0 01);卵裂率分别为18.5%±2.0%和32.8%±1.4%(P<0 01);8 细胞阶段的成功率分别为14.8%±2.5%和 24.8%±1.5%(P<0 01);桑椹胚发育率分别为 0 和5 3%±1.1%,明显低于未经冷冻的鲜卵组(21.0%±3.8%;P<0 01);囊胚发育率分别为0和4.0%,明显低于鲜卵组(P<0 01)。说明OPS玻璃化冷冻法可以使未经成熟培养的牛 COCs冷冻后获得桑椹胚和囊胚,但桑囊胚发育率仍较低,方法有待改进。     

牛孤雌生殖胚与体外受精胚体外发育比较

从卵巢采集的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)经体外成熟培养24 h后,随机分为2组分别用于孤雌激活与体外受精.在相同培养条件下,比较孤雌生殖胚与体外受精胚的发育率和发育速度.结果表明将牛孤雌生殖胚与体外受精胚分别置于mSOFaa和mBECMaa培养液中培养,卵裂率(89.3%vs.80.1%;83.2%vs.82.5%)、囊胚发育率(27.5%vs.24.0%;28.9%vs.21.9%)和孵化率(58.7%vs.56.7%;51.5%vs.53.3%),均无显著差异(P＞0.05);孤雌生殖胚与体外受精胚在体外发育的速度基本相同.对孤雌生殖胚胎进行培养可以代替体外受精胚胎筛选最佳体外培养系统.     

牛体外受精胚胎细胞核移植的实验研究

将采自肉联厂屠宰车间的牛卵巢中的卵母细胞置于ＴＣＭ－１９９＋１０％ＥＣＳ（０ｄ）＋ＦＳＨ（１万ＩＵ／Ｌ）＋ＬＨ（５ｍｇ／Ｌ）中培养成熟，用含０．３％透明质酸酶的消化液将卵母细胞周围的卵丘细胞去掉，并以７．５ｍｇ／Ｌ的ＣＢ液处理后，用微吸管吸去透明带内的第一极体及极体下面的部分卵母细胞质，然后将经体外受精并发育至８～１６细胞期胚胎的卵裂球注入去核卵母细胞的卵周隙中，再将移核胚置于电融合槽内进行融合（电场强度为１２００Ｖ／ｃｍ，持续时间为８０μｓ，１次脉冲刺激）。将融合的胚胎移入生长有单层贴壁颗粒细胞的发育培养液（ＴＣＭ－１９９＋１０％牛血清）中培养，观察移核胚的融合率及发育率，部分去核卵母细胞经染色后观察去核率。结果表明：（１）移核胚的融合率为８６．９％（５３／６１）；（２）发育至２～８细胞期的胚胎占培养的移核胚胎总数的２１．３％（１０／４７）；（３）卵母细胞的去核率为６８．２％（４５／６６）。     

牛体外受精早期胚胎与小鼠胎仔成纤维细胞共培养的研究

探讨了人工合成培养液ＣＲ１ａａ和小鼠胎仔成纤维细胞对牛体外受精早期胚胎体外发育的影响。结果表明，牛体外受精卵在ＣＲ１ａａ液中的卵裂率达７６．２％，８细胞胚的比率达４４．８％。小鼠胎仔成纤维细胞能够显著促进牛体外受精的早期囊胚以上胚胎的发育。牛体外受精后第５、６天的早期胚胎分别与小鼠胎仔成纤维细胞共培养，在受精后第７天发育至囊胚以上的比率分别达１９．８％和２４．６％；受精后第８天，孵化的囊胚比例分别达５．２％和７．５％。实验表明，受精后第５、６天的牛体外受精早期胚胎与小鼠胎仔成纤维细胞共培养，可显著提高扩张囊胚和孵化囊胚数量。小鼠成纤维细胞对胚胎发育的支持作用取决于胚胎发育阶段     

不同培养体系对牛胚胎体外发育的影响

采用离子霉素和6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)对牛体外成熟卵母细胞进行联合激活,激活后采用不同的培养体系进行体外培养,观察不同的培养液对牛孤雌激活胚体外发育能力的影响。3种培养体系分别为:A(0~48 h:CR1aa+3 mg/mL BSA;48 h~7 d:CR1aa+10%FBS),B(连续7 d均为SOFaa+3 mg/mL BSA),C(0~5 d:SOFaa+3 mg/mL BSA;6~7 d:SOFaa+10%FBS)。结果表明:3种培养液对卵裂率没有显著性影响,分别为87.22%,94.33%和91.30%,但囊胚发育率存在显著性差异,以A效果最好,其囊胚发育率为25.56%;C次之,囊胚发育率为11.80%;B最低,囊胚发育率为3.55%。之后选择最佳的培养液进行体外受精实验,结果表明CR1aa可用做牛胚胎体外生产的培养液。     

牛卵泡卵母细胞体外受精和发育的研究

利用屠宰黄牛卵巢作为供试材料 ,对卵巢表面 2～8mm卵泡卵母细胞体外受精(IVF) -受精卵的体外发育 (IVD)进行了系列研究 ,采用上游法、Percoll法和本实验室沿用的直接洗涤法处理牛冻精 ,观察 3种精子处理方法处理牛冷冻精子对卵母细胞体外受精胚胎发育的影响。实验结果 ,就卵裂率指标 ,采用Percoll法处理的精子进行卵母细胞体外受精 ,和上游法及洗涤法分别比较 ,差异均不显著 (P >0 .0 5 ) ;桑囊率指标 ,只有上游法比洗涤法高 ,差异显著 (P <0 .0 5 ) ,其余差异均不显著。以FERT -TALP液作为受精液采用常规培养方法 ,精卵作用 18～ 2 0h后分开 ,与精卵作用 6～ 8h后分开卵母细胞受精后的 8-细胞发育率及桑囊率变化不大 (P >0 .0 5 ) ;卵裂率指标 ,18～ 2 0h处理组高于 6～ 8h处理组 ,但两组之间差异也不显著。表明 ,在生产中采用FERT -TALP液做为受精液 ,应用上游法处理精子 ,不需要另购试剂 ,精卵孵育时间由 18～ 2 4h缩短至 6～ 8h是可行的 ,其现实意义是可以简化胚胎体外生产的程序 ,节省人力 ,降低成本     

Percoll法处理牛精子对体外受精胚胎发育的影响

牛冷冻精液解冻后,在Ｐｅｒｃｏｌｌ梯度液中４００ｇ离心２４ｍｉｎ有效地获得了５７．８７％±８．０％的精子回收率;对照组上游法精子回收率仅为１５．８７％±１．９％（Ｐ〈０．０５）。Ｐｅｒｃｏｌｌ和上游２种方法分离的精子在受精液中８,１８ｈ后的活率,分别为６０％,１０％和７０％,２０％,２种浓度Ｐｅｒｃｏｌｌ法分离的精子对不同成熟处理的卵母细胞体外受精子（ＩＶＦ）卵裂率的影响,精子最终浓度为２×１０＾     

紫外线照射时间对孤雌激活和体外受精胚胎发育的影响

用核荧光染料 Hoechst3 3 3 42对 5组牛成熟卵母细胞染色后 ,以紫外线 ( UV)分别照射0 ,10 ,2 0 ,3 0 s和 40 s。观察和分析对孤雌激活胚胎和体外受精胚胎卵裂及体外发育的影响。结果表明 ,经 UV照射 0 ,10 ,2 0 ,3 0 s和 40 s的卵母细胞孤雌激活后的卵裂率分别为 80 .8% ,77.9% ,72 % ,61.4%和 45 % ,囊胚发育率分别为 3 9.2 % ,3 6.4% ,19.4% ,14 .5 %和 11.1% ;UV照射 2 0 s以上的囊胚发育率都极显著低于UV未照射和照射 10 s的卵母细胞 ( P <0 .0 1) ,UV照射卵母细胞超过 2 0 s降低了孤雌激活胚胎的体外发育潜力 ;体外受精胚胎中 ,UV照射2 0 s以上与未照射和照射 10 s组相比 ,卵裂率和囊胚发育率显著差异 ( P >0 .0 5 ) ,U V照射卵母细胞超过 2 0 s时 ,显著降低了体外受精胚胎的发育潜力。由此可知 ,卵母细胞经染色后 ,UV照射时间应控制在 2 0 s以内 ,并以照射 10 s时 ,对孤雌激活胚和体外受精胚的体外发育影响最小