微粒体甘油三酯转移蛋白的功能及临床意义

微粒体甘油三酯转移蛋白（microsomal triglyceride transfer protein,MTP）是一种主要分布于肝细胞、肠上皮细胞中的脂质转移蛋白,其在甘油三酯转运及极低密度脂蛋白组装和分泌中发挥着重要作用。近来研究表明MTP与血脂障碍和肝脏脂肪变性等疾病的发生发展关系密切。     

表达绿色荧光蛋白的重组腺病毒伴随病毒的产生

来源于维多利亚水母 (Ａｅｑｕｏｒｅａｖｉｃ ｔｏｒｉａ)的绿色荧光蛋白 (ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ ,ＧＦＰ)是近年来发现的一种新的报告基因 ,由于其具有产生荧光不需任何底物或辅助因子、可以活体观察等特点 ,因此在目前的基因转移、基因治疗研究中得到了广泛的应用[1 ] 。重组腺病毒伴随病毒 (ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｄｅｎｏ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ,ｒＡＡＶ)具有安全性好、可介导外源基因长期稳定表达等特点 ,是目前比较理想的基因治疗载体。构建表达ＧＦＰ的ｒＡＡＶ载体 (ｒＡＡＶ ＧＦＰ)对于…     

人EPO基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的:制备表达人促红细胞生成素基因(hEPO)的重组腺病毒。方法:将hEPO基因亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV上,采用细菌内同源重组"两步转化法"构建携带hEPO基因的重组腺病毒载体。获得的重组腺病毒载体线性化后转染HEK293细胞,包装、扩增出重组腺病毒,氯化铯梯度离心法进行纯化,PCR和电镜负染鉴定重组腺病毒,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达并检测重组腺病毒的滴度。继而用纯化的重组腺病毒感染HeLa细胞,测定转染效率,以Western blot检测hEPO蛋白的表达。结果:成功构建了携带hEPO基因的重组腺病毒载体pAd-hEPO,PCR、透射电镜和绿色荧光鉴定证实病毒包装成功,并且具有感染力,病毒的滴度可达1.8×1010pfu/mL。Western blot检测表明RAd-hEPO感染的HeLa细胞中hEPO基因能够有效表达。结论:制备的RAd-hEPO可成功表达hEPO基因,为后续开展RAd-hEPO治疗缺血性心脏病的研究奠定基础。     

携带人livin α基因腺病毒载体的构建及其在树突状细胞的表达

目的:本研究旨在利用AdMax系统构建携带人抗凋亡基因livinα的重组腺病毒载体(rAd-livinα),并感染树突状细胞(Dendritic cells,DCs),制成DCs疫苗,为下一步用此疫苗抗肿瘤实验奠定基础。方法:以质粒pIRES2-EGFP-livinα为模板,通过PCR扩增出人livinα基因cDNA序列,再将livinα基因cDNA亚克隆于穿梭质粒pDC316-EGFP-cmv,获得重组质粒pDC316-EGFP-cmv-livinα。将鉴定后的重组穿梭质粒pDC316-EGFP-cmv-livinα与腺病毒辅助质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞,同源重组获得重组腺病毒rAd-livinα。用重组腺病毒rAd-livinα感染人DCs后,Western blot方法分析livinα蛋白表达,流式细胞仪检测DCs的表型变化。结果:在HEK293细胞内能观察到重组腺病毒rAd-livinα绿色荧光蛋白的表达。rAd-livinα经PCR鉴定特异性地扩增出符合预期大小的片段。rAd-livinα感染的DCs中可检测到livinα蛋白的表达,并且感染的DCs与未感染DCs比较,可明显提高了细胞表面分子CD83、CD86和HLA-DR的表达(P<0.05)。结论:通过AdMax系统成功构建了重组腺病毒rAd-livinα,使livinα蛋白有效表达于DCs中,并且重组腺病毒感染的DCs的成熟度得到提高。     

GFP／HBVX融合蛋白重组载体的构建及稳定表达细胞系的建立

目的构建绿色荧光蛋白（GFP）与人乙型肝炎病毒（HBV）X基因的重组表达载体，建立稳定表达HBVX蛋白（HBx）与GFP融合蛋白的HepG2细胞系，以进一步研究HBx的生物学功能及其在肝癌发生中的作用。方法应用PCR法从adr亚型HBV质粒pHBVDNA中扩增HBVX基因片段，PCR产物经HindⅢ和KpnⅠ双酶切后定向插入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1的相应酶切位点，转化宿主菌DH5α，采用上述双酶切及DNA测序鉴定重组质粒pGFP-HBx；采用脂质体转染法将pEGFP-C1质粒、pGFP-HBx重组质粒DNA转染人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，G418选择抗性细胞克隆，荧光显微镜下观察GFP表达，挑取表达GFP的抗性克隆扩大培养、传代。采用RT-PCR检测转染细胞HBVX基因的表达。结果经酶切及测序鉴定成功构建了GFP-HBVX重组表达载体pGFP-HBx；将pEGFP-C1、pGFP-HBx重组质粒转染HepG2．，经G418筛选15d获得抗性细胞克隆。将带绿色荧光的抗性克隆细胞扩大培养并经传代70次，细胞仍表达强的荧光蛋白。RT-PCR检测表明转染pGFP-HBx重组体的HepG2／GFP-HBx细胞有HBVX转录、表达。结论成功构建了GFP．HBVX真核重组表达载体pGrP-HBx；获得了稳定表达GFP-HBx融合蛋白的HepG2细胞系，这为进一步研究FIBx的生物学功能以及HBx在肝癌发生中的作用与机制打下了基础。     

诺如病毒衣壳蛋白重组人3型腺病毒的构建

目的 制备表达诺如病毒衣壳蛋白的重组人3型腺病毒.方法 将诺如病毒衣壳蛋白基因(Noro-orf2)克隆到腺病毒穿梭载体pBSE3CMV-egfp上,与线性化人3型腺病毒骨架质粒pBRAdv3共电转化感受态大肠杆菌BJ5183,使其在细菌内发生同源重组,带Noro-orf2基因的表达框置换腺病毒E3区,PCR及酶切筛选得到重组腺病毒质粒,将重组腺病毒质粒转染Hep-2细胞进行包装,获得感染性的重组腺病毒粒子,免疫组化分析重组腺病毒中诺如病毒衣壳蛋白的表达.结果 同源重组后经酶切和PCR鉴定证明插入Noro-orf2基因的重组腺病毒质粒pBRAdv3E3dNor成功构建,并经转染包装得到高滴度的重组腺病毒Adv3E3dNor,免疫组化证明诺如病毒衣壳蛋白得到表达.结论 成功构建表达诺如病毒衣壳蛋白的重组3型腺病毒Adv3E3dNor,为研制人3型腺病毒-诺如病毒双价疫苗奠定了基础.     

人胸腺基质淋巴生成素基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的: 构建含人胸腺基质淋巴生成素基因(TSLP)的重组腺病毒载体并表达, 以研究其免疫学功能。方法: 将由人胚肺细胞扩增得到的TSLP基因, 克隆于真核表达载体pcDNA3. 1中, 再亚克隆至穿梭质粒pShuttle中, 并与腺病毒骨架载体pAdEasy -1共同转化大肠杆菌。以获得的重组质粒线性化后转染HEK293细胞, 并包装成病毒颗粒。采用PCR法对重组腺病毒基因进行鉴定, 并以Westernblot检测TSLP蛋白的表达。结果: 通过细菌内同源重组, 成功构建带有人胸腺基质淋巴生成素基因的重组腺病毒质粒, 转染 293细胞后, 包装的重组病毒经PCR检测表明, 基因组含有目的基因,病毒的滴度可达 1×1011pfu/L。Westernblot证实, 感染的肿瘤细胞中有相应基因产物的表达。结论: 通过菌内重组可高效制备带有特定基因的重组病毒。所制备的Ad -TSLP可成功表达相应基因产物, 为进一步研究这一新型细胞因子的功能奠定了基础。     

pAd-SIG腺病毒质粒构建及其在MCF-7细胞中的表达

目的含人生长抑素受体2亚型(human somatostatin receptor subtype2,hSSTr2)和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的腺病毒重组质粒的构建及表达。方法采用PCR方法将hSSTr2以及IRES-EGFP基因亚克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV中,获得pShuttle-CMV/hSSTr2-EGFP,经PmeⅠ酶切,去磷酸化后转化含pAdeasy-1的超感受态BJ5183菌,细菌内同源重组构建腺病毒质粒pAdeasy-1/hSSTr2-EGFP(pAd-SIG),将其转染HEK293细胞进行病毒包装与滴度测定。重组腺病毒感染MCF-7细胞,流式细胞术检测其表达。结果酶切、PCR及基因测序证实重组腺病毒质粒pAd-SIG构建成功,病毒滴度为8.2×109IU/ml,流式细胞术结果显示hSSTr2在MCF-7细胞中表达阳性率为86.59%。结论成功构建了重组腺病毒质粒pAd-SIG,并能在真核细胞表达,为体内外研究hSSTr2效应提供了基础。     

应用细菌同源重组法快速构建和制备重组腺病毒

目的：利用大肠杆菌细菌同源重组构建重组腺病毒载体并在293细胞制备高滴度重组病毒。方法：自细胞周期相关激酶真核表达载体pCR31-CCRK中酶切出CCRK基因，亚克隆至带有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）表达盒的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中，形成转移质粒pAdTrack-CMV-CCRK，采用电穿孔或化学转化法在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组，得到重组腺病毒载体pAd-CCRK。以pAd-CCRK为模板，经DNA测序正确后，用Pac Ⅰ酶切线性化pAd-CCRK，转染293细胞，包装成重组病毒颗粒，荧光显微镜观察转染细胞EGFP的表达，采用PCR的方法对重组腺病毒进行鉴定。将重组病毒上清感染RAW细胞，荧光显微镜下观察感染细胞重组病毒的表达。结果：成功地构建了携带CCRK基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒，重组病毒能在体外高效表达。结论：应用细菌内同源重组能够快速构建腺病毒载体，可高效制备均一的高滴度重组病毒，为CCRK基因功能的研究奠定了基础.     

人LIM矿化蛋白1基因腺病毒重组表达载体构建及在犬骨髓间充质干细胞中的表达

背景：研究表明LIM矿化蛋白1在体内和体外都可促使骨发生。 目的：应用Adeasy-1腺病毒系统构建含人LIM矿化蛋白1基因的腺病毒重组体,并感染犬骨髓间充质干细胞,检测其体外表达及诱导成骨作用。 方法：构建重组腺病毒质粒pAd-LMP-1,经人胚胎肾293细胞包装、扩增后得到复制缺陷重组腺病毒Ad-LMP-1,以最佳感染复数值体外感染犬骨髓间充质干细胞,行RT-PCR及 Western Blot检测LIM矿化蛋白1、骨形态发生蛋白7基因的表达。重组Ad-LMP-1和(或)外源性重组人骨形态发生蛋白7处理犬骨髓间充质干细胞,21 d后行矿化(钙)结节茜素红染色分析LIM矿化蛋白1基因的诱导成骨作用。 结果与结论：①将Ad-LMP-1以感染复数值100感染犬骨髓间充质干细胞可获得最佳感染效率,感染后骨髓间充质干细胞能在基因和蛋白水平表达LIM矿化蛋白1,未引起骨形态发生蛋白7基因的表达。②Ad-LMP-1或重组人骨形态发生蛋白7均不能单独促使骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化,两者联合可促使骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化。③实验成功构建重组腺病毒载体Ad-LMP-1,并实现其在犬骨髓间充质干细胞中表达,证实了LIM矿化蛋白1在诱导成骨作用中表现为与外源性重组人骨形态发生蛋白7的协同效应。     

携带人NIS基因的重组腺病毒的构建

利用RT-PCR技术从Graves甲亢病人的甲状腺组织中扩增得到甲状腺钠/碘同向转运体(NIS)可编码区片段,并克隆到T载体,测序后亚克隆到腺病毒载体穿梭质粒pAdTrack-CMV上,再与含有骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183同源重组,经293细胞包装并扩增得到重组腺病毒AdNIS。结果显示重组腺病毒质粒经PmeI酶切鉴定,电泳中出现了诊断性片段;感染的293细胞出现了明显的细胞病变效应;PCR产物电泳证实了重组病毒的存在。病毒滴度为2.5～3×109efu/ml。表明成功构建了携带人NIS基因的重组腺病毒,这为基因转移NIS介导131I治疗非甲状腺肿瘤提供实验研究基础。     

携带反义多药耐药基因的重组腺病毒载体的构建

从携带有全长人类 MDR1c DNA的质粒 p Ha MDR1- 1获得 MDR1基因片段 ,将其反向克隆到腺病毒载体 Ad Easy系统的穿梭质粒 p Ad Track- CMV上 ,与骨架质粒在大肠杆菌 BJ5 183内进行同源重组 ,经 2 93细胞包装生成携带反义 MDR1基因片段的重组腺病毒 Ad Easy- GFP- as MDR1,可以有效地感染人肝癌耐药细胞株 ,为进一步研究逆转肝癌多药耐药性的机制提供了基础     

含人基质金属蛋白酶组织抑制因子-1重组腺病毒的构建与体外表达

从人肝癌组织中提取总RNA，RT—PCR合成hTIMP-1的全长cDNA，克隆到腺病毒载体AdEasy系统的穿梭质粒pAdTraek—CMV上，与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183受体菌中进行同源重组，成功构建含hTIMP-1全长eDNA的重组腺病毒载体，经293细胞的包装、扩增，生成含hTIMP-1基因的重组腺病毒AdhTIMP-1并实现体外表达，为进一步研究肝癌浸润和转移机理以及肝癌的基因治疗提供实验基础。     

乙型肝炎病毒X基因重组腺病毒的构建及在HepG2细胞中的表达

从携带有双拷贝乙肝病毒adw亚型全基因组的质粒pecob6获得X基因片段,将其亚克隆到AdEasy腺病毒系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV上,和骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌内同源重组,获得重组腺病毒质粒pAd-X,PacI酶切线性化后脂质体法转染293细胞进行包装、扩增,获得重组腺病毒Ad-X,Ad-X可感染HepG2细胞,Western-blot法检测到X蛋白的表达,重组腺病毒Ad-X构建成功,为进一步研究X蛋白的生物学功能奠定了基础。     

HAX1和EGFP共表达重组腺病毒载体的构建、鉴定

目的 构建和鉴定HAX1和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体.方法 采用DNA重组技术,将目的 基因HAX1克隆至含有报告基因EGFP的穿梭质粒pAdTrack-CMV中,并转化于大肠埃希菌DH5α;筛选出重组质粒pAdTrack-CMV- HAX1,并在BJ5183细菌中与pAdEasy-1质粒进行同源重组,产生重组腺病毒载体;用lipofectamine将其转染HEK293细胞,包装携带全长HAX1的重组复制缺陷型腺病毒pAd-HAX1-EGFP,酶切和序列测定鉴定;用制备好的Ad-HAX1-EGFP感染HEK293细胞,流式细胞术检测其感染效率,RT-PCR、Western 印迹鉴定外源基因HAX1的表达.BrdU检测感染了Ad-HAX1-EGFP的HEK293细胞增殖情况.结果 pAdTrack-CMV-HAX1重组质粒构建成功.pAdTrack-CMV-HAX1 质粒与pAdEasy-1质粒同源重组后与预期结果相符.构建好的Ad-HAX1-EGFP能有效感染HEK293细胞;外源基因能在239细胞中有效表达.HAX1高表达的HEK293细胞其增殖率得以提高.结论 成功构建了表达HAX1和EGFP共表达的重组腺病毒载体,HAX1能够促进结肠癌细胞HEK293细胞的增殖.     

粒-巨噬细胞集落刺激因子与绿色荧光蛋白融合基因慢病毒载体构建

目的：构建粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)与绿色荧光蛋白（GFP）融合基因慢病毒载体。 方法： 采用RT-PCR方法获得GM-CSF全外显子片段, 使之克隆到带GFP慢病毒表达载体质粒 FUGW中，经限制性酶切、PCR扩增和测序鉴定重组载体。在脂质体介导下将慢病毒包装系统的包装结构基因pCMV.△8.9、包膜基因VSVG、目的基因FUGW-GM-CSF导入病毒包装细胞293T，荧光显微镜检测基因的表达，包装成病毒后，收集病毒上清，浓缩，鉴定。用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测转染FUGW-GM-CSF细胞上清液 GM-CSF表达水平，电子显微镜观察293T细胞中的慢病毒。 结果： 限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实RT-PCR获得的GM-CSF/PCR产物与GenBank中的数据完全吻合; GM-CSF准确克隆入FUGW的多克隆位点。慢病毒的3种质粒可高效转染入293T细胞，荧光显微镜下观察可见大量绿色荧光。转染 FUGW-GM-CSF包装细胞上清液 GM-CSF酶联反应阳性。电子显微镜下见慢病毒颗粒位于293T细胞胞浆的内质网中。 结论： 成功构建了GM-CSF与GFP融合基因慢病毒载体，为诱导DC提供了适合的稳定转染的载体。     

重组腺病毒载体转染Apo~(E-/-)小鼠的安全性评价和在主动脉血管组织的表达情况

腺病毒介导的脂联素过表达对Apo E-/-小鼠动物的安全性检测。将48只普通饮食饲养的12周龄雄性Apo E-/-小鼠分为对照组和脂联素干预组,每组24只。对照组给予一次性尾静脉注射生理盐水100μl;干预组则同法注射100μl重组腺病毒(Ad-APN-e GFP,3.0×108p.f.u)。分别在注射后0天、1周、2周、及4周处死小鼠,取全血和主动脉血管组织。用ELISA法测定血清中脂联素浓度;用WB法检测血管组织中标识绿色荧光蛋白(GFP)以确定重组腺病毒的转染率。全自动生化仪检测血常规指标、肝功能(ALT、AST)、肾功能指标(CR、BUN)、心肌酶(CK、CKMB)、以确定重组腺病毒转染的安全性。腺病毒对血常规指标和心肌酶的表达没有显著影响,对肝功能指标谷丙转氨酶(ALT)(1周时组间差异P0.01和2周时组间差异P0.05)、肾功能指标尿素氮BUN(1周时组间差异P0.01)有一过性影响。重组腺病毒可在体内高效介导外源基因脂联素的表达,血清中的脂联素浓度在病毒转染后1周达到了最高值,约是正常对照组的4倍(78.28±15.02 vs 23.42±5.35)μg/ml,2周内稳定表达。1周时GFP蛋白在血管组织中表达的量最高,1周时GFP/GAPDH为83.63±1.50%,随后逐渐降低,2周时GFP/GAPDH为54.00±4.00%,4周时GFP/GAPDH为22.00±3.99%。重组腺病毒注射存在一过性的肝毒性和肾毒性,但是对动物的生理状态没有显著影响。重组腺病毒对Apo E-/-小鼠的血管组织有高效转染、2周内安全、稳定表达的特性。     

Adenovirus-Mediated in Utero Gene Transfer in Mice and Guinea Pigs: Tissue Distribution of Recombinant Adenovirus Determined by Quantitative TaqMan–Polymerase Chain Reaction Assay

Fetal somatic cell gene therapy could become an attractive solution for some congenital genetic diseases or the disorders which manifest themselves during the fetal period. We performed adenovirus-mediated gene transfer to mice and guinea pig fetuses in utero and evaluated the efficiency of gene transfer by histochemical analysis and a quantitative TaqMan–polymerase chain reaction (TaqMan-PCR) assay. We first injected a replication-deficient recombinant adenovirus containing the Escherichia coli LacZ gene driven by a CAG promoter (AxCALacZ) into pregnant mice through the amniotic space, placenta, or intraperitoneal space of the fetus. Histochemical analysis showed limited transgene expression in fetal tissues. We then administered AxCALacZ to guinea pig fetuses in the late stage of pregnancy through the umbilical vein. The highest β-galactosidase expression was observed in liver followed by moderate expression in heart, spleen, and adrenal gland. The transgene expression was also present in kidney, intestine, and placenta to a lesser degree. No positively stained cells were observed in lung, muscle, or pancreas except in the vascular endothelium of these organs. Quantitative measurement of recombinant adenoviral DNA by the TaqMan-PCR assay showed that the vast majority of the injected viruses was present in liver. The current study indicated that adenovirus-mediated gene transfer into guinea pig fetus through the umbilical vein is feasible and results in efficient transgene expression in fetal tissues. The experimental procedures using pregnant guinea pigs might serve as a good experimental model for in utero gene transfer. Since our TaqMan-PCR assay detects the LacZ gene, one of the most widely used reporter genes, it may be generally applicable to adenovirus quantification in various gene transfer experiments.