针对不同来源金黄色葡萄球菌分离菌株的agr Ⅰ-Ⅳ分型初探

目的:金黄色葡萄球菌附属基因调节子(agr)位点是一个全面的群集感应系统并且控制着毒力因子的产生,本研究旨在针对不同来源的金黄色葡萄球菌分离菌株进行agr Ⅰ-Ⅳ基因分型研究.方法:根据金黄色葡萄球菌agrⅠ-Ⅳ基因组别类型的引物,对五种不同来源的169株金黄色葡萄球菌DNA模板进行多重PCR扩增,获得目的基因,以判断agr基因型.结果:169株分离菌株中,agrⅡ型的检出率为19%(32/169),agrⅢ型检出率为12%(20/169),agrⅣ型检出率为8%(14/169),五种不同来源的金黄色葡萄球菌均有检出agrⅡ型,均未检出agrⅠ型,并且都含有未能分型的agr阴性菌株.研究结果表明不同来源金黄色葡萄球菌分离菌株中agr Ⅰ-Ⅳ基因型的流行情况.该方法对于金黄色葡萄球菌菌株分子分型有一定的借鉴意义,也为金黄色葡萄球菌菌株分子流行病学调查奠定一定的基础.     

金黄色葡萄球菌肠毒素B激活TACE诱导人鼻黏膜上皮细胞分泌黏蛋白

目的观察金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)对人鼻黏膜上皮细胞活性氧(ROS)和肿瘤坏死因子转化酶(TACE)活性的影响,并探讨其在介导黏蛋白MUC5AC分泌中的作用。方法体外培养人鼻黏膜上皮细胞,用不同浓度的SEB孵育细胞0~24 h,采用荧光共振能量转移法检测TACE的酶活性,荧光探针H2DCFDA检测鼻黏膜上皮细胞中活性氧(ROS)的含量,ELISA检测培养上清中MUC5AC的分泌水平。同时采用TACE siRNA干扰或ROS抑制剂NAC处理细胞,观察其在介导MUC5AC分泌中的作用。结果 100 ng/m L SEB作用鼻黏膜上皮细胞15 min后即可上调TACE的酶活性,30~60 min后达到峰值,并持续至2 h;SEB也能增加鼻黏膜上皮细胞内ROS的含量;采用NAPDH氧化酶抑制剂DPI处理后,ROS水平明显减少;ROS抑制剂NAC处理鼻黏膜上皮细胞后,可明显降低TACE的酶活性;30~100 ng/m L SEB能显著诱导鼻黏膜上皮细胞分泌MUC5AC,采用TACE siRNA干扰其表达或抑制剂处理后,可抑制MUC5AC分泌。结论 SEB激活TACE诱导人鼻黏膜上皮细胞分泌MUC5AC。     

不同保存方法对武汉单极虫DNA提取和PCR扩增的影响

为探讨不同保存方法对武汉单极虫Thelohanellus wuhanensis DNA提取和PCR扩增的影响,将从患武汉单极虫病的异育银鲫Carassius auratus gibelio鱼苗上分离出含有孢子的孢囊,分别置于100%乙醇、70%乙醇、2.5%戊二醛、10%福尔马林、Bouin's液、Carnoy's液和Müller's液中保存50 d,经计数调整孢子等量后分别进行DNA提取、常规PCR和巢式PCR扩增。结果表明:100%乙醇和70%乙醇保存方法对武汉单极虫孢子DNA提取、常规PCR和巢式PCR扩增均无任何影响,等同于新鲜孢子,可作为孢子的保存方法;2.5%戊二醛和Bouin's液保存方法只对孢子DNA提取有影响,但均能在常规PCR和巢式PCR扩增后出现特异电泳条带,可作为用于常规PCR和巢式PCR扩增的孢子保存方法;10%福尔马林和Müller's液保存方法对孢子DNA提取和常规PCR扩增均有影响,但均能在巢式PCR扩增后出现特异电泳条带,故只能作为用于巢式PCR扩增的孢子保存方法;Carnoy's液保存方法无论在孢子DNA提取还是进行常规PCR和巢式PCR扩增均无阳性结果,故不能用作孢子核酸分子生物学研究的保存方法。研究表明,除100%乙醇和70%乙醇保存方法外,其他保存方法对孢子DNA提取、常规PCR和巢式PCR扩增均有不同程度的影响。     

藏药仁青芒觉和帮间久埃对金黄色葡萄球菌的增殖抑制作用

目的:观察分析藏药仁青芒觉和帮间久埃对金黄色葡萄球菌的抑菌作用,为临床科学用药提供依据。方法:采用琼脂打孔法研究两种药物对6株金黄色葡萄球菌的抑菌作用,连续记录药物作用36h的菌液吸光度A600nm,绘制细菌生长曲线。结果:仁青芒觉、帮间久埃能够明显抑制金黄色葡萄球菌增殖,耐药菌株的抑菌圈直径与标准菌株基本一致。结论:二者对耐药性金黄色葡萄球菌均具有显著的抑菌作用,提示其较好的临床应用前景。     

金黄色葡萄球菌双组分系统反应调节蛋白AgrA的原核表达、纯化及活性鉴定

AgrA作为金黄色葡萄球菌双组分信号转导系统(two-component signal transduction system,TCST)的反应调节因子,能调控细菌毒力因子的表达,在金黄色葡萄球菌致病过程中起着重要的作用。采用无限制克隆法构建AgrA表达载体,在AgrA蛋白的C端融合绿色荧光蛋白(GFP)标签,通过实时监测GFP的荧光强度来快速检测重组蛋白的表达水平。首先利用单因素实验,筛选出宿主菌株BL21-(DE3)-PlysS;其次,结合Box-Behnken试验设计,筛选出最优蛋白质表达条件:诱导时间为22h、转速为222r/min、诱导剂浓度为0.5mmol/L,AgrA产量达到5.56mg/L。最后,基于AgrA蛋白LytTR区域的非放射性凝胶阻滞实验(non-radioactive electrophoretic mobility shift assay,EMSA)验证了AgrA的生物活性。提出了反应调节蛋白AgrA在大肠杆菌高效可溶性表达的策略,为双组分信号转导系统的体外研究奠定基础,也为其他反应调节蛋白的可溶性表达与分离纯化提供了一个可行借鉴。     

反义锁核酸阻断耐甲氧西林金黄色葡萄球菌agr群体感应系统

目的:利用反义策略,设计、筛选针对agrA mRNA的反义锁核酸,阻断agr群体感应系统,降低MRSA毒力因子的表达,减小细菌生存压力,为抗耐药菌感染提供一种新策略。方法:应用Primer Premier 5.0和RNA structure 4.5两种软件,设计、筛选2条针对agrA mRNA的反义寡核苷酸序列,对其进行锁核酸修饰,并与透膜肽(KFF)3K共价连接,将这两条反义序列导入细菌体内。体外与MRSA共培养,观察细菌生存情况。实时定量PCR检测其对agrA及agr群体感受系统的效应分子RNAⅢ和下游毒力基因hla的转录水平的影响,Western blot检测其是否能抑制α-溶血素的表达。结果:两条反义锁核酸序列PLNA34和PLNA522在体外均无抗菌活性,但都能不同程度的抑制agrA,RNAⅢ和hla的转录水平;相比较而言,PLNA34的抑制效果更佳,并能明显抑制α-溶血素的分泌表达。结论:agrA可作为抗MRSA感染的新靶点,为新型抗MRSA药物的研发提供了理论基础。     

基于gyrB基因的地衣芽孢杆菌PCR快速检测方法的建立

根据地衣芽孢杆菌的gyrB基因序列设计一对引物,扩增片段大小为507bp的基因片段,该方法对地衣芽孢杆菌DNA的扩增结果为阳性,对照菌株扩增结果均为阴性,对地衣芽孢杆菌检测的灵敏性为1pg总DNA量,成功建立了地衣芽孢杆菌PCR检测方法,该方法具有快速、灵敏度高、特异性强等优点,为地衣芽孢杆菌的分离及鉴定奠定了良好的基础。     

军团菌双重荧光定量PCR检测方法的建立与应用

目的建立一种特异、快速、敏感,同时能区分嗜肺和非嗜肺军团菌的荧光定量PCR方法,用于检测临床和环境样品。方法利用军团菌属特异性23S rRNA基因和嗜肺军团菌种mip基因的保守序列,设计引物和TaqMan探针。提取嗜肺军团菌标准菌株(LP1)DNA,分别构建2个含有目的基因的标准质粒作为阳性模板。优化荧光PCR反应条件和反应体系,对方法的特异性、敏感性、重复性进行评价。并对环境水样及80份临床痰样进行检测。结果该方法检测灵敏度达10标准质粒拷贝数/反应,具有高度特异性、稳定性。整个过程约需2 h。对35份环境水样进行检测,检出3株嗜肺军团菌和3株非嗜肺军团菌,所有水样经传统分离培养法和普通PCR法检测均显示为阴性。对临床80份随机痰液标本进行检测,2份嗜肺军团菌阳性。结论 TaqMan探针荧光定量PCR双管检测是一种可同时区分嗜肺与非嗜肺军团菌的特异、敏感、稳定的方法,可用于基层医院对环境标本及临床痰样的检测。     

斑点叉尾鮰肠败血症PCR诊断方法的建立

为了建立快速、敏感的聚合酶链式反应(PCR)诊断斑点叉尾鮰Ictalurus punctatus的肠败血症技术,作者根据NCB I公布的鮰爱德华氏细菌序列,设计了一对特异性诊断引物CM3/CM4,对鮰爱德华氏细菌特异基因片段进行PCR扩增试验,PCR反应条件的优化以及不同检测材料的比较,同时测试了该方法的特异性和敏感性,并对广西4个市县临床样品进行了检测。结果表明:用该引物可以扩增到与预计大小相符的276 bp鮰爱德华氏菌特异性片段;PCR反应与Ⅰ型荧光假单胞菌、点状产气单胞菌点状亚种、鳗弧菌、温和气单胞菌、肠型点状产气单胞菌、柱状黄杆菌、嗜水气单胞菌、河弧菌、迟缓爱德华氏菌及海豚链球菌无交叉反应;用该PCR法可以检测出病鱼脑、肝、肾及脾中的病原菌,检测的最低细菌数为12个,且病鱼内脏组织、菌落及菌液均可直接用于该PCR扩增;临床菌株检测结果与基于菌株16S rRNA基因序列系统进化分析和生化鉴定结果一致。因此,本试验中所建立的PCR检测方法在斑点叉尾鮰肠败血症的诊断和防治方面具有较好的应用前景。     

食品中重金属元素检测方法研究进展

食品安全问题是直接关系到人民健康的重大民生问题。简要阐述了食品中重金属对人体的影响与危害,全面分析了重金属元素对食品的污染,从不同种类的食品,包括农作物(粮食、蔬菜、水果、食用菌、茶叶)、水产品、畜禽产品、食用油、食用酒精等方面,综述了近年来食品中重金属检测方法研究的进展。随着检测技术的不断发展进步,快速、灵敏、无损的多元素在线检测的方法必将在食品中重金属元素的测定方面得到广泛的应用。     

食品中重金属检测方法研究探讨

如今重金属污染问题已经日趋严重,在食品、医药、环境等诸多方面都引起了人们广泛的重视,近年来重金属快速检测的方法发展迅速,在重金属快速检测与筛查方面发挥了很大的作用,但还需进一步改进和完善。目前,重金属检测仍然存在以下不足,忽略了对有益重金属的测定,忽略了对重金属元素的不同价态分别进行测定,还有不容忽视样品中其它物质对测定的影响。本论文从应用新型的科技成果到结合生物技术对重金属的检测方法做出探讨。     

HBV-M与定量PCR法检测HBV-DNA相关性探析

目的:探讨乙肝病毒DNA(HBV-DNA)与其血清学标志物HBV-M之间的相关性。方法:选取本院收治的乙肝患者183例作为研究对象,采集并分离患者的血清标本,分别采用荧光定量PCR法和酶联免疫吸附法对患者的HBV-DNA、HBV-M进行检测,在不同的HBV-M模式下分析其与HBV-DNA间的关系。结果:在HBsAg(+)+HBeAg(+)+HBcAb(+)的模式下,HBV-DNA的检测阳性率为97.9%;HBsAg(+)+HBeAg(+)模式下,HBV-DNA的检测阳性率是100%;两者比较差异无统计学意义,但这两种模式下的检测阳性率都显著高于其他模式(P<0.05)。结论:乙肝病毒的血清学标志物的模式不同,HBV-DNA的检测阳性率不同,乙肝患者机体内的病毒含量也有差异,HBV-M和HBV-DNA的检测分别是乙肝感染的间接证据和直接证据,同时对患者进行这两项指标的检测对于乙肝的临床诊断、病情判定、传染性的评估具有重要的意义。     

不同PCR扩增试剂盒检验血样DNA的检验结果对比研究

目的:讨论研究Profiler PlusTM、IdentifilerTM以及Powerplex16扩增试剂盒用于检验血样DNA检验结果的差异,并研究其扩张不平衡和基因丢失现象的发生几率。方法:选取150例完全无血缘关系的个体作为研究对象并采集其血样,分别使用两种扩增试剂盒进行检验。对所得不同结果的同一对象再使用3种扩增试剂盒进行检验。将检验所得结果进行比较。结果:3种试剂盒检测的等位基因缺失率比较差异无统计学意义(P>0.05)。Profiler PlusTM检测扩张不平衡率显著高于其余两种试剂盒(P<0.05)。结论:使用PCR扩增试剂盒对血样DNA进行检测时,会出现不同位置的异常基因,可表现为基因缺失及扩增不平衡。但Profiler PlusTM检验扩增不平衡发生率显著高于其余两种试剂盒。在实际生活对血样DNA进行检测时,除需准备主要检测扩增试剂盒外,还需准备其他不同类备用试剂盒用于互相验证及对比,尽量降低基因等位缺失及扩张不平衡发生率。     

血液基因组 DNA 提取方法的改良

目的：探讨改良血液样品基因组 DNA 的提取方法，制备纯化的高分子量 DNA。方法将312份新鲜血液样品随机分为2组：A 组（90份）和 B 组（222份）。A 组采用常规基因组 DNA 提取方法。B 组采用改良的基因组 DNA提取方法，其基因组 DNA 提取方法改良之处：1）在血液样品中加入细胞裂解液 CL 后采用手工震荡，并离心2 min 40 s；2）震荡混匀后将样品分装成3管，然后将缓冲液 GS 加入第1管吹打溶解后吸取上清，并加入第2管，再吹打溶解后吸取上清加入第3管，继续吹打溶解；3）加入缓冲液 GB 后再58℃水浴过夜16 h。结果改良的血液样品 DNA 提取方法能够提高产率，提高纯度，获取更多高分子量的 DNA，相对于常规基因组 DNA 提取方法有显著提高。结论改良的血液基因组 DNA 提取方法操作简便，能有效地避免操作导致 DNA 链断裂，提高 DNA 的完整性及纯度。     

金黄色金属光泽釉在琉璃瓦制品上的应用研究

应用FERRO公司的成品釉43522TF,在琉璃瓦制品上得到成功应用,获得了带网纹图案的金黄色金属效果。通过大量试验,考察了不同工艺条件、烧成制度等因素对金属光泽釉外观效果的影响;研究了外加金属氧化物,如氧化铜、氧化锰、氧化镍、氧化钴等对该金属光泽釉外观效果的影响。     

牛羊细粒棘球蚴病现场快速检测方法的建立及应用

建立了一种基于恒温隔绝PCR(Insulated isothermal PCR,ii PCR)技术现场检测牛羊包虫病的方法.结果显示,该方法只能检出细粒棘球绦虫,对多房棘球绦虫、肝片吸虫、细颈囊尾蚴、前后盘吸虫、日本血吸虫、金黄色葡萄球菌、伪结核杆菌无关病原不检出;检测下限为100个拷贝,重复性好.对55份牦牛源包囊样本和70份羊源包囊样本的检出率分别为61.8和4.3%,与文献报道的检测方法的符合率分别为100%;本研究建立的ii PCR方法特异性好、灵敏度高、重复性好,从核酸提取到报告检测结果仅需1小时,操作方便,可现场使用,为牛羊包虫病的现场快速诊断提供有力的工具.     

母婴同室新生儿皮肤感染及环境相关因素的分析

目的:对本院产科母婴同室新生儿皮肤感染及其环境相关因素(包括母婴同室病房空气、物体物品表面、医务人员手及鼻腔)进行取样调查,分析新生儿皮肤感染的环境因素,探讨降低母婴同室新生儿皮肤感染的措施。方法:前瞻性对2015年1-12月本院产科病房进行定期取样,包括病房空气、物体物品表面、医护人员手及鼻腔,标本进行细菌分离和菌株鉴定。同期对新生儿皮肤感染取样后进行细菌培养及菌株鉴定。结果:2015年母婴同室新生儿皮肤感染率为1.93%,金黄色葡萄球菌感染占25.0%。环境中金黄色葡萄球菌的检出率为19.7%,其中耐甲氧西林菌株金黄色葡萄球菌(methicillinresistant Staphylococcus aureus,MRSA)检出率为5.3%。医护人员鼻腔样本金黄色葡萄球菌及MRSA的检测阳性率明显高于手样本(P<0.001)。结论:金黄色葡萄球菌是新生儿皮肤感染主要的致病菌,重视环境中金黄色葡萄球菌及MRSA的带菌情况,加强医护人员手及鼻腔卫生的监管,可有效降低带菌率。     

略谈生物技术在食品检测中的应用

当代社会人类对食品安全的关注度越来越高,相应的食品检测技术也得到改善。其中生物技术也挥了重要的作用,PCR技术、酶联免疫吸附技术(ELISA)、PCR-免疫技术(PCR-ELISA)、免疫亲合色谱(IAC)、生物芯片(Biochips)等技术以各自的优点,被广泛地运用于食品检测领域。     

深圳市孕妇鼻腔定植SA和MRSA的耐药谱分析

目的:了解深圳市孕妇鼻腔定植的金黄色葡萄球菌(SA)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的耐药谱情况。方法:收集深圳市龙华新区人民医院及中心医院入院待产孕妇鼻腔分离出的SA菌株,并采取纸片扩散法确定MRSA菌株和SA耐药情况。结果:共收集了SA 547株,其中MRSA 107株。MRSA对克林霉素、利福平、红霉素、青霉素及多重耐药的耐药情况与MSSA比较,差异均有统计学意义(P<0.001、P<0.001、P<0.001、P=0.012、P<0.001)。对孕妇的年龄进行分组后,可见不同年龄组对利福平、妥布霉素、红霉素、青霉素、替考拉宁、复方新诺明及多重耐药的耐药情况比较,差异均有统计学意义(P<0.001、P=0.012、P=0.034、P=0.009、P=0.008、P=0.004、P=0.003)。结论:本研究中孕妇鼻腔携带的SA和MRSA菌株的耐药率较高。另外,高龄孕妇和低龄孕妇的MRSA耐药性较严重应引起注意。     

环境介质中微塑料的处理与检测方法研究进展

微塑料作为一种新兴污染物,由于尺寸小、使用量大、处置不当以及在环境中难以被彻底降解等特性而在生态系统中广泛分布,近年来,海洋和淡水环境中的微塑料污染成为日益关注的全球热点问题。研究这种新型污染物的首要问题是将微塑料从复杂的环境介质中分离鉴定出来。目前已有各种微塑料检测分析流程,但为使不同研究结果间具有可比性,亟需统一、标准的微塑料分离提取和鉴别定量方法。在系统综述常见且可靠的分离提取步骤(如密度分离、筛分、过滤、消解)、鉴别定性方法(如热分析和光谱分析)、统计定量方法(如目检统计、荧光分析和热分析)的基础上,提出对微塑料检测分析方法的研究展望。结合光谱分析的染色荧光法在快速、准确地评估环境中微塑料污染方面具有广阔的应用前景。