人巨细胞病毒UL135基因在临床低传代分离株中的多态性研究

目的：研究人巨细胞病毒（HCMV）UL135基因编码序列在临床低传代分离株中的多态性，探讨HCMV基因多态性与其感染引起不同临床疾病之间的关系。方法：对29株经荧光定量PCR方法检测HCMV．DNA为阳性的临床低传代分离株的细胞培养上清液进行HCMVUL135全序列PCR扩增，并对PCR扩增阳性的25例标本进行序列测定及分析。结果：29株临床低传代分离株有25株PCR扩增阳性。25株分离株UL135开放读码框架（0RF）长度均与Toledo株相同，其核苷酸的变异率为0．1％-2．6％。与Toledo株相比，部分分离株具有氨基酸翻译后修饰位点的新增或缺失。25株临床分离株UL135蛋白质二级结构预测结果显示了第28位、313—317位、161—163位、171位氨基酸均有蛋白质结构二级的改变。结论：25株HCMV临床低传代分离株UL135基因及其编码产物的氨基酸序列比较保守，但仍存在一定程度的多态性，未发现UL135基因的变化与HCMV先天感染导致的不同疾病存在着相关联系。     

人巨细胞病毒UL138基因在临床低传代分离株中的多态性研究

目的:研究人巨细胞病毒(HCMV)UL138基因在临床低传代分离株中的多态性及其与HCMV先天感染不同致病性之间的关系.方法:对30株经荧光定量PCR方法检测HCMV-DNA为阳性的临床低传代分离株进行HCMV-UL138全序列PCR扩增,对16株进行HCMV-UL138基因全序列测序及结果分析.结果:30株临床分离株中有20株UL138基因PCR扩增阳性.16株临床分离株HCMV-UL138开放阅读框架及编码蛋白的重要功能基团均高度保守.核苷酸序列进化树的分析结果表明:除20M外,先天性巨结肠株只存在于2a型,而小头畸形株仅存在于2b型.结论:HCMV UL138基因高度保守,但存在一定的多态性.     

人巨细胞病毒UL137基因在临床低传代分离株中的多态性研究

目的：研究人巨细胞病毒（HCMV）UL137基因在先天巨细胞病毒感染临床低传代分离株中的多态性。方法：选择经荧光定量PCR方法检测HCMV-DNA为阳性的临床分离株进行涵盖UL137全序列的UL136，UL138基因全序列PCR扩增，对扩增阳性的标本进行全序列的测序，核实测序结果，拼接出UL137基因编码序列，进行相关分析。结果：经分析获得22株HCMV临床分离株UL137ORF核苷酸序列，核苷酸变异分布于整个编码区，但主要集中在5’端220—290bp处，均为核苷酸碱基替换，无插入及移码突变。在UL137预测编码蛋白氨基酸序列中，新增2个半胱氨酸位点，导致17株临床分离株在71-76位氨基酸出现了N相连豆蔻酰化位点（MYR）的新增，及第90～92位氨基酸硫化cAMP位点的相应缺失。结论：HCMVUL137基因在临床低传代分离株中高度保守，但存在一定的多态性。     

人巨细胞病毒UL141片段在临床低传代分离株中的多态性研究

目的:研究人巨细胞病毒不同临床分离株UL141基因多态性,并分析这种多态性与人巨细胞病毒先天感染疾病之间的关系.方法:对荧光定量PCR方法检测HCMV-DNA阳性的临床低传代分离株进行UL141基因全序列PCR扩增,对扩增阳性的标本进行测序及分析.结果:19株临床低传代分离株在Toledo株UL141基因227位均缺失一个碱基T,因此产生两个新的ORF(UL141A和UL141B).与Toledo株相应片段比较,UL141A预测蛋白质第75位氨基酸后序列和翻译后修饰位点产生大量变异.UL141B高度保守.结论:临床分离株的UL141片段产生两个新的ORF.     

靶向人巨细胞病毒UL145基因的CRISPR/Cas9基因敲除质粒的构建

目的 构建靶向人巨细胞病毒UL145基因的CRISPR/Cas9基因敲除质粒.方法 根据CRISPR/Cas9设计原则,设计3条靶向UL145基因的gRNA,构建重组lenti CRISPR-UL145-T1、T2、T3表达质粒,转化并挑选阳性克隆,进行PCR及测序验证.同时通过荧光素酶SSA(Luciferase S...     

多参数预测人巨细胞病毒临床病毒株UL145基因B细胞表位

目的 应用多参数预测及分析人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus,HCMV）临床病毒株UL145 基因B 细胞表位。方法 根据人巨细胞病毒UL145 基因氨基酸序列预测其二级结构,结合跨膜结构、亲水性、可及性及抗原性方案等参数综合预测UL145 基因B 细胞表位。结果 HCMV pUL145 氨基酸等电点为6.64,二级结构以无规则卷为主,1～130 位氨基酸均为膜外区域,结合多种预测方法分析提示,88～99 位氨基酸序列内可作为HCMV UL145 基因的B 细胞候选表位。结论 多参数预测提示88～99 位氨基酸序列为HCMV UL145 基因B 细胞表位预测序列,为进一步制备相应的抗体提供了重要依据。     

人巨细胞病毒UL133基因型在婴幼儿肝功能损伤中的分子机制

目的探索人巨细胞病毒（HCMV）UL133基因型对婴幼儿肝功能损伤的分子机制。方法选择收治入院的68例HCMV肝炎患儿和66例同期门诊体检肝功能正常且确诊为HCMV感染的患儿为研究对象。其中UL133基因型筛查阳性的66例肝炎患儿为UL133阳性组,UL133基因型筛查阴性的64例体检患儿为UL133阴性组。检测并比较患儿尿液中HCMVUL133基因型,血液中Caspase-3、Caspase-6蛋白表达水平及肝功能指标。结果肝炎患儿尿液中UL133基因型筛查阳性率达94.1%,明显高于体检患儿的3.0%（P＜0.05）。UL133阳性组患儿血液中ALT、Caspase-3、Caspase-6蛋白表达水平均明显高于UL133阴性组（P＜0.05）。两组患儿血AST、TBiL、DBiL、谷氨酰转移酶（GGT）比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。结论携带有UL133基因型的HCMV感染婴幼儿后,可能通过诱导Caspase-3、Caspase-6蛋白表达上调,导致肝功能损伤。     

人巨细胞病毒增殖性感染UL111A基因转录本特征及变化

目的：探究人巨细胞病毒（HCMV）UL111A基因在增殖性感染不同时间点的转录本特征及变化。方法：在HCMV AD169株感染人包皮成纤维细胞（HFF）12 h,24 h,48 h,3 d,5 d,7 d,9 d等不同时间点,抽提RNA,反转录成cDNA,PCR检测UL111A转录本特征。扩增产物通过克隆、测序验证不同时间点UL111A转录本的特征变化。利用真核表达载体pcDNA3.1构建UL111A 3种转录本编码区序列载体pcDNA3.1-cmvIL-10,pcDNA3.1-LAcmvIL-10以及pcDNA3.1-unspliced,Western blot验证构建的载体在293T细胞中的有效表达。结果：感染HCMV AD169株的HFF可以检测到cmvIL-10,LAcmvIL-10以及未剪切3种形式转录本。未剪切形式转录本占比最多,cmvIL-10转录本占比最少。在感染的24 h和9 d 3种转录本都有检测到,而在其他时间点未能检测到cmvIL-10 转录本。此外,3 种转录本的编码区序列在293T细胞中均可有效表达。结论：HCMVUL111A基因在增殖性感染不同时间点存在3种形式的转录本。     

广州地区HCMV临床病毒株UL137基因的结构特征与多态性

【目的】研究广州地区新生儿感染人巨细胞病毒（HCMV）临床低传代分离株UL137基因的结构特征与基因多态性。【方法】从62份被证实为临床HCMV感染的新生儿尿液标本中分离获得3株低传代临床病毒株，经多重PCR鉴定后分别命名为HCMVD2、D3和D52。对3株临床分离株进行HCMVUL137基因全序列PCR扩增，PCR产物纯化后进行基因克隆，构建HCMVUL137-pMD18-T重组质粒；基因测序；将HCMVUL137基因序列呈报GenBank，并进行基因生物信息学分析。【结果】成功从广州地区新生儿感染HCMV患儿体内分离3株HCMV临床病毒株。克隆测序后呈报GenBank并被收录，收录序列号分别为：DQ180388、DQ180376、DQ180360。通过序列分析，结果显示低传代分离株UL137基因DNA序列高度保守，同源性在96．91％～100％之间．其变异均为碱基替换：编码蛋白均由96个氨基酸残基组成，同源性在90．63％～100％之间，超半数的变异发生在第61～81位氨基酸残基之间：编码蛋白翻译后修饰位点包括PKS、MYS、cAMPs三类，其中4个PKS和44～49位的MYS高度保守，cAMPs位点仅在5株病毒出现；编码蛋白等电点在11．50～12．00之间，呈强碱性。【结论】广州地区临床低传代分离株HCMVUL137基因核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列极为保守，但仍存在-定多态性。提示HCMVUL137ORF可能是-个具有重要功能的基因。     

人巨细胞病毒ORF11基因在消化系统疾病临床分离株中的序列分析

目的 研究人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)ORF11基因在临床分离株中的多态性及其与HCMV感染所致不同消化系统疾病之间的关系.方法 研究对象为16名具有不同消化系统疾病的HCMV感染儿.对全部标本进行HCMV ORF11基因的半巢式PCR扩增.应用DNAclub,BioEdit,PROSITE数据库及DNAstar软件对PCR产物的序列进行分析.结果 所有临床分离株HCMV ORF11的核苷酸序列是保守的,而其编码蛋白翻译后修饰位点的氨基酸序列则高度保守.未发现HCMV ORF11序列的变异与不同表现类型的消化系统疾病相关.结论 HCMV ORF11基因相对保守,不同分离株的序列变异与不同临床表现的消化系统疾病没有明确的相关性.     

Sequence variability of human cytomegalovirus UL143 in low-passage clinical isolates

Background Human cytomegalovirus （HCMV） infects a number of organs and tissues in vivo. The different symptoms and tissue tropisms of HCMV infection perhaps result from genetic polymorphism. A new region of DNA containing at least 19 open reading frames （ORFs） （denoted UL133 to 151） was found in the low-passage HCMV clinical strain, Toledo, and several other low-passage clinical isolates, but not present in the HCMV laboratory strain, AD169. One of these genes, UL143, was studied to explore the sequence variability of UL143 ORF in HCMV clinical isolates and examine the possible association between gcne variability and the outcome of HCMV infection. Methods The UL143 gone of the strains obtained from suspected congenitally HCMV-infectcd infants was amplified by polymerase chain reaction （PCR） and sequenced. Results Nineteen sequences of the strains were divided into 2 major groups, G1（n=16） and G2（n=3）. All of the sequences had frame-shift mutation compared to Toledo. Nucleotide polymorphisms conferred substantial amino acid substitutions when compared with Toledo. All 16 UL143 putative proteins of the strains in G1 had a new myristylation site and loss of two PKC sites owing to missense mutations. No convincing relationships were observed between the presence of HCMV disease and the UL143 sequence group. Conclusions HCMV-UL143 existed in low passage isolates. Sequence variability caused by frame -shift mutation was found in all HCMV clinical strains. No obvious linkage was observed between UL143 polymorphisms and the outcome of suspected congenital HCMV infection.     

人巨细胞病毒UL144基因克隆表达及其对树突状细胞功能的影响

目的:构建携带人巨细胞病毒(hCMV) UL144基因的重组腺病毒,研究UL144基因修饰的树突状细胞(dendritic cell,DC)的功能变化。方法:从hCMV-DNA阳性患者外周血提取cDNA,采用PCR技术扩增出UL144基因。采用AdEasy系统构建携带hCMV UL144基因的重组腺病毒载体pAd-UL144,转染HEK293细胞后包装产生重组腺病毒Ad-UL144。通过RT-PCR检测目的基因的表达。将此重组腺病毒转染小鼠骨髓来源的DC,采用流式细胞术检测DC表面分子,采用ELISA技术分析DC培养上清中的细胞因子,采用3H-TdR掺入法检测UL144基因修饰的DC激活T细胞增殖的能力。结果:成功将UL144基因片段克隆至载体上,并经HEK293细胞包装出病毒颗粒,经测定病毒滴度为3×1010 pfu/ml。流式细胞术检测显示,UL144基因修饰的DC表面分子CD80、CD86和I-Ad表达水平低于对照组(P<0.01)。ELISA分析表明,UL144基因修饰的DC分泌TNF-α、IL-6和IL-1β的能力减弱(P<0.05)。UL144基因修饰的DC介导的T细胞增殖功能明显低于DC对照组(P<0.01)。结论:UL144基因修饰的DC具有维持相对未成熟状态的能力,并减弱了对抗原特异性T效应细胞的刺激功能。     

贫困山区早孕期HCMV宫内感染与UL54基因突变的研究

目的:探讨贫困山区早孕期人巨细胞病毒(HCMV)宫内活动性感染与HCMVUL54基因突变的关系。方法:采用免疫组织化学(SABC)PCR-RFLP的方法检测人绒毛组织中HCMV早期抗原的存在及HCMVUL54基因密码子501是否发生突变。结果:贫困山区早孕期妇女HCMV宫内活动性感染率为18.91%;PCR-RFLP分析结果显示,在早孕期HCMV宫内感染者中UL54501密码子未发生突变。结论:贫困山区早孕期HCMV宫内感染与HCMVUL54基因密码子501突变无关,但不排除其他位点的突变或其他形式异常导致病毒致病性改变存在的可能性。     

晚期黄疸新生儿人巨细胞病毒感染与US3基因多态性的关系

目的了解晚期黄疸新生儿人巨细胞病毒(HCMV)感染状况,探讨HCMV US3基因多态性与致病性之间的关系。方法应用巢式PCR法检测2010年1～6月在本院新生儿科就诊的79例晚期黄疸新生儿样本HCMV US3基因,阳性标本结果进行双向DNA测序,通过BioEdit、DNAstar、GeneDoc等软件进行序列分析。结果 79例晚期黄疸新生儿中20例HCMV US3基因PCR扩增阳性,阳性率25.3%。以Towne作为参考株,序列比对分析显示,20株临床分离株US3的ORF长度均与参考株相同,为561bp,编码186个氨基酸蛋白。US3核酸变异比较普遍,变异主要集中在序列的N端,大部分是同义突变,US3氨基酸序列高度保守,仅几个位点在少数分离株中存在变异。未发现US3基因多态性与临床致病性的联系。结论 HCMV感染是导致新生儿晚期黄疸的重要原因之一。20株临床分离株HCMV US3基因编码的氨基酸序列比较保守,但仍存在一定的多态性。未发现不同临床分离株US3基因多态性与HCMV引起的新生儿晚期黄疸的联系。