细菌直接PCR和双引物策略鉴定16S rRNA基因技术的建立

目的探索一种基于16S rRNA基因的快速鉴定细菌方法,为临床诊断治疗及耐药菌的分子遗传分析提供科学依据。方法对卫生部室间质评菌株和临床病人标本分离培养纯菌落,用双蒸水稀释菌落,然后直接以菌液为模板优化反应体系PCR扩增16S rRNA基因片段,再测序扩增片段。将测序结果在细菌Ribosomal数据库中进行同源性比对,根据序列同源性鉴定病原细菌。结果本实验鉴定的卫生部质评菌株结果与卫生部报告结果一致。本实验能够一次性鉴定出临床病人标本分离的菌株。结论本研究优化了一种免纯化细菌核酸直接PCR鉴定细菌16S rRNA基因的方法。本研究建立的基于病原细菌16S rRNA基因鉴定方法可用于细菌的快速诊断。     

海盐弗朗西斯菌的系统发育与毒力基因分析

目的研究海盐弗朗西斯菌(Francisella salimarina)的系统发育和毒力基因分布情况。方法纳入GenBank数据库中的相关基因组数据, 对海盐弗朗西斯菌及邻近菌种进行系统发育分析, 分析16S rRNA基因、rpoB基因、mdh基因等单个基因与核心基因组系统发育的一致性, 基于毒力因子数据库和抗生素耐药基因数据库注释并分析毒力基因及耐药基因。以蜃楼弗朗西斯菌(Francisella philomiragia) ATCC 25015T为参考, 采用大蜡螟幼虫感染试验评估海盐弗朗西斯菌的毒力。结果海盐弗朗西斯菌在系统发育上与蜃楼弗朗西斯菌亲缘关系最为相近。系统发育树比较发现, mdh基因系统发育树与核心基因组系统发育树高度相似。而单基因系统发育分析显示, 基于16S rRNA基因和mdh基因序列分析均能鉴别海盐弗朗西斯菌及邻近菌种, 但mdh基因具有更强的区分能力。8株海盐弗朗西斯菌共检出多种毒力基因, 主要与分泌系统、黏附、免疫调节、运动和应激生存相关。此外, 8株菌均检测到β-内酰胺类耐药基因blaFPH。该菌在大蜡螟幼虫感染试验中表现出较高的致死能力, 与蜃楼弗朗西斯菌...     

患者血液和温泉水中阿尔卑斯浴者菌的分离及鉴定

目的通过对患者血液来源的阿尔卑斯浴者菌(Balneatrix alpica)分离株X117和该患者所在小区天然温泉水的分离株GN-1进行菌种鉴定与微生物学特征分析, 为该菌作为罕见病原体引起临床相关感染的病原学诊断提供实验依据。方法以阿尔卑斯浴者菌DSM 16621T作为参考, 对分离株X117和GN-1进行生化表型鉴定、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定、16S rRNA基因测序和系统发育分析、单核苷酸多态性(SNP)距离以及全基因组相关指数分析, 以准确确定其分类学地位和同源性;微量肉汤稀释法进行药敏试验;VFDB毒力因子数据库进行毒力基因注释和分析。结果分离株X117和GN-1在哥伦比亚血琼脂平板和巧克力平板上培养4 d可见菌落呈淡黄色或棕黄色, 菌落表面呈斑驳状, 革兰染色阴性杆菌, 氧化酶和吲哚试验阳性, 与阿尔卑斯浴者菌DSM 16621T特征一致。16S rRNA系统发育分析表明分离株X117和GN-1均为阿尔卑斯浴者菌, 其与阿尔卑斯浴者菌DSM 16621T平均核苷酸一致性(ANI)值为98.44%和98.41%, 基因组DNA-DNA杂交值(dDDH)均为87.1...     

一株脓毒血症患者血液分离的罕见螺原体鉴定和生物学特性分析

目的对一株自脓毒血症患者血液中分离的罕见螺原体DGKH1进行菌种鉴定和生物学特性分析。方法对DGKH1进行常规细菌培养、染色与形态学观察、生理生化鉴定、16S rRNA基因测序和系统发育分析, 以及基因组测序和基因组相关指数分析, 从而确定其分类学地位;参考人型副支原体和解脲脲原体进行药敏试验。结果分离株DGKH1可以在哥伦比亚血平板、巧克力平板和嗜血巧克力平板上微弱生长, 在含有四环素(4 μg/ml)、多西环素(1 μg/ml)、米诺环素(1 μg/ml)、交沙霉素(2 μg/ml)、罗红霉素(1 μg/ml)、克拉霉素(1 μg/ml)和特利霉素(1 μg/ml)的支原体液体培养基中不生长。在商品化的支原体固体培养基上, DGKH1可形成"油煎蛋样菌落", 与人型副支原体相类似。采用常规革兰染色, DGKH1不着色;以磷酸盐缓冲液为基质进行透射电镜观察, 其菌体呈螺旋形。16S rRNA基因测序显示, 分离株与中华绒螯蟹螺原体CCTCC M 207170T相似性最高(99.85%), 但尿素分解试验阳性, 与已知螺原体属菌种存在差异。全基因组系统发育分析显示, 该菌株与中华绒螯蟹...     

变性高效液相色谱技术快速检测下呼吸道致病性细菌的实验研究

目的 运用变性高效液相色谱(DHPLC)技术检测5种下呼吸道致病性细菌,建立一种快速检测下呼吸道致病性细菌的分子生物学方法.方法 以下呼吸道致病性细菌16S rRNA基因的保守区设计通用引物,并在引物前加上40-bpGC,特异性扩增该基因的保守区和可变区,运用DH-PLC技术对PCR产物进行分析.选取50株临床分离菌株验证该方法的有效性.结果 通用引物可特异性扩增细菌16S rRNA,PCR产物经DHPLC分析后每种细菌均能得到特征性的洗脱峰.DHPLC检测临床分离菌株结果显示,与常规培养方法的符合率为100%.结论 DHPLC技术具有准确、简便、快捷和高通量等特点,在临床检测下呼吸道致病性细菌中具有潜在的应用价值.     

中国莱姆病螺旋体的核糖体基因分型研究

目的 莱姆病螺旋体的基因型和临床表现、疫苗菌株和抗原菌株的选择存在密切的关系，所以对中国菌株进行分子流行病学研究，可为莱姆病的防治提供科学依据。方法 5S－23S rRNA基因间隔区RFLP分析和16＋23S rRNA基因RFLP分析。结果 中国菌株至少被分为3个基因型（B.burgdorferi sensu stricto、B.garinii和B.afzelii),B.garinii和B.afzelii占优势，B.burgdorferi sensu stricto少见。少数菌株用上述方法尚不能明确其分类地位，需进一步研究，中国很可4能存在世界上独特的新基因型。结论 中国菌株的基因型明显不同于北美菌株，而同欧洲菌株比较接近，5S－23S rRNA基因间隔区RFLP分析方法简便、快速、准确，是理想的基因型分类方法，可作为国内菌株基因型鉴定的常规方法。     

一株脓液分离的海岸嗜半胱氨酸菌的鉴定及毒力基因分析

目的通过对1株从1名被海虾刺伤的患者脓液分离的致病菌株JM-1进行准确鉴定、药敏试验和毒力基因分析, 为海岸嗜半胱氨酸菌(Cysteiniphilum litorale)作为罕见病原体引起临床相关感染的筛检及改善预后提供实验依据。方法对分离株进行生化表型鉴定、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)鉴定、16S rRNA基因测序和系统发育分析, 以及基于全基因组序列的平均核苷酸一致性(average nucleotide identity, ANI)、平均氨基酸一致性(average amino acid identity, AAI)分析和系统发育分析, 以准确确定其分类学地位;以E-test法进行药敏试验, 并依据CLSI M45-A3土拉弗朗西斯菌解释标准进行结果判读;以VFDB毒力因子数据库对全基因组进行毒力基因注释和分析。结果分离株JM-1在哥伦比亚血平板上培养3 d可见灰白色、中等大小、光滑、圆形、凸起的溶血菌落。革兰染色为着色较淡的阴性球杆菌。API NH鉴定结果提示为卡他莫拉菌(生化编码:3010);Vitek2系统NH卡鉴定无鉴定结果(生物编码:02...     

从前列腺液中分离到结核硬脂酸棒状杆菌

目的 对分离自慢性前列腺炎患者前列腺液中的一株棒状样细菌进行分类学鉴定,探讨其种系发生及生物学地位.方法 利用形态、生理和生化特性等表型性状初步进行细菌鉴定,通过细胞壁化学成分分析、16S rRNA基因测序及基因比对明确其种系来源.结果 分离、培养出革兰染色阳性的棒状样杆菌;生化反应不活泼;细胞壁二氨基酸为内消旋二氨基庚二酸(meso-DAP),全细胞糖含阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖,化学型为胞壁Ⅳ型.GenBank数据库序列比对显示,该菌株与结核硬脂酸棒状杆菌(C tuberculostearicum)菌株ATCC35692的16S rDNA序列相似度最高,为99.4%(仅存在8个核苷酸差异).结论 从表型性状和种系发生研究可确定该菌株为结核硬脂酸棒状杆菌,本研究与模式株相比亦存在一定差异,初步考虑该分离株可能足该菌种的一个新业型.该菌分离自前列腺液,在国内外尚属首例.     

鲍曼不动杆菌armA基因的分布与耐药性的研究

目的 调查我院鲍曼不动杆菌中16S rRNA甲基化基因armA的分布以及与鲍曼不动杆菌耐药谱的关系,并初步探讨其在分子流行病学分析中的作用.方法 收集72株鲍曼不动杆菌,采用K-B法对鲍曼不动杆菌进行药物敏感试验,后采用PCR筛选鲍曼不动杆菌的16S rRNA甲基化基因armA,并利用随机扩增多态性DNA法(RAPD)技术进行基因分型.统计各鲍曼不动杆菌菌株对多种氨基糖苷类药物的药敏结果,并分析基因型与耐药性的关系.结果 根据PCR产物片段大小,72株鲍曼不动杆菌共有armA基因阳性菌株20株(27.8%).含有armA基因型鲍曼不动杆菌菌株对庆大霉素、妥布霉素和阿米卡星的耐药率均为90%;随机扩增多态性DNA法显示20株armA基因阳性的鲍曼不动杆菌主要分为7型,A型为优势克隆株.结论 产16S rRNA甲基化基因armA的鲍曼不动杆菌菌株可对多种氨基糖苷类抗生素高水平耐药.同一克隆菌株在病房内和病房间的传播为我院armA基因传播的主要方式.     

产ESBL肺炎克雷伯菌中16S rRNA甲基化酶的分布与相关耐药性的研究

目的 调查我院产ESBL肺炎克雷伯菌临床分离株16S rRNA甲基化酶基因的分布以及与耐药谱的关系,并初步探讨其在分子流行病学分析中的作用.方法 收集我院临床2010年3月至9月分离出69株非重复产ESBL肺炎克雷伯菌,采用PCR法检测16S rRNA 甲基化酶基因,并对阳性菌株进行ESBL基因及整合子基因分析,通过DNA直接测序确定.质粒接合试验和质粒消除试验确定16S rRNA甲基化酶基因的传播途径,利用ERIC-PCR技术进行基因分型.结果 69株产ESBL肺炎克雷伯菌中有rmtB阳性菌株20株(28.9％),其中2株同时携带有rmtB和armA.在20株产16SrRNA甲基化酶菌株中,均携带有CTX-M基因,测序显示14株CTX-M-14基因,6株CTX-M-15基因;14株携带有TEM-1基因;8株携带有SHV基因,测序显示5株SHV-12基因,3株SHV-11基因;3株携带有OXA-10基因;3株携带有VBE-1基因.另有12株携带有int1阳性,含有5种不同的耐药基因盒,分别携带drfA25、drfA1、drfA12、aadA1、aadA2、sat和blaVEB-1基因.ERIC-PCR法显示20株16SrRNA甲基化酶基因阳性的肺炎克雷伯菌主要分为5型,A型为优势流行克隆株.质粒接合和消除试验发现A型克隆株KP5和KP16 rmtB均位于一质粒上并通过接合传播.结论 本院产ESBL肺炎克雷伯菌临床分离株中存在16S rRNA甲基化酶基因rmtB的普遍流行,导致对多种氨基糖苷类抗生素高水平耐药.rmtB可通过水平基因传播和克隆传播的两种方式进行播散,并且存在同时产ESBLs、16S rRNA甲基化酶和Ⅰ类整合子的肺炎克雷伯菌的传播.     

桂西地区幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药性分析

目的 分析桂西地区幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)菌株对克拉霉素的耐药情况,并探讨Hp对克拉霉素耐药与23S rRNA基因点突变的关系.方法 分离培养Hp,纸片扩散法进行药敏实验,PCR方法扩增23S rRNA基因,用聚合酶链反应.限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测克拉霉素耐药菌株的点突变,同时进行基因测序确定突变位点.结果 桂西地区Hp菌株对克拉霉素耐药率为22.2%(28/126);PCR-RFLP检测10株对克拉霉素耐药的Hp,均存在23S rRNA基因的A2143G、A2144G点突变,10株敏感菌株均无23S rRNA的点突变,基因测序显示耐药菌株有A2143G、A2144G突变,其他位置未发现突变.结论 桂西地区Hp菌株对克拉霉素耐药率(22.2%)略高于北京、上海等地区;Hp的23S rRNA基因A2143G、A2144G点突变与克拉霉素的耐药相关.     

23S rRNA基因序列分析及其在细菌鉴别诊断中的应用

目的研究细菌23S rRNA基因序列的差异，为细菌鉴别诊断和相关研究提供科学依据。方法设计合适的通用引物、寻找恰当的扩增条件扩增常见细菌的23S rRNA基因片段。通过序列测定和运用生物信息学分析不同种属细菌23S rRNA基因的保守序列、变异规律及菌株间种系进化关系。结果扩增出常见引起食源性感染的16属(种)细菌23S rRNA基因片段。部分扩增产物进行了限制性酶切鉴定和序列测定。序列比较研究获得21个23S rRNA的通用保守序列，23S rRNA基因保守序列与变异区在种系间呈间隔分布，大量变异区呈“马赛克”式分布。种系间进化关系与16S rRNA分析结果一致。结论23S rRNA基因序列的分布规律为进行细菌的鉴别诊断及基因芯片的研制提供了重要的理论和实验基础。     

采用MALDI-TOF MS和全基因组测序鉴定和分析动弯杆菌属及其亲缘关系北大核心CSCD

目的用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术结合16S rRNA基因测序鉴定动弯杆菌,并通过全基因组测序分析动弯杆菌的耐药基因及该菌属种间亲缘关系。方法将65例细菌性阴道病（bacterial vaginosis,BV）患者的阴道分泌物标本厌氧培养获得25株动弯杆菌,采用MALDI-TOF MS及16S rRNA基因测序鉴定细菌种属,并提取细菌全基因组DNA进行二代测序,测序后得到的原始数据根据SPAdes软件进行拼接组装,并与ARGD耐药基因库比对得到这些细菌含有的获得性耐药基因,最后通过Harvest软件对所有菌株进行核心基因组多样性比较,构建进化树。结果采用MALDI-TOF MS鉴定动弯杆菌属仅能获得柯氏动弯杆菌的鉴定结果;采用16S rRNA基因测序能将动弯杆菌属菌株区分为柯氏动弯杆菌和羞怯动弯杆菌;全基因组分析显示动弯杆菌主要含有四环素耐药基因tet（o）及大环内酯类耐药基因erm（x）,其中tet（o）基因的检出率为84.7%,erm（x）基因的检出率为61.5%;动弯杆菌属两个种内亲缘关系相近,种间亲缘关系甚远。结论本实验结果表明目前MALDI-TOF MS不能鉴定出动弯杆菌属中的羞怯动弯杆菌;动弯杆菌对四环素类及大环内酯类抗生素具有潜在的耐药性;动弯杆菌在种内进化缓慢,暂无新种出现的趋势。     

两株临床分离的金黄杆菌的鉴定和系统发育分析

目的对临床痰液和中段尿标本分离的SQ219和SQ220进行生物学特性、系统进化和临床意义分析。方法观察菌株的培养特性及生理生化特征;用VITEK2全自动微生物鉴定和药敏分析仪及MALDI-TOF质谱仪鉴定细菌;利用相关软件对细菌16S rRNA和核心基因组作系统发育分析及基因组平均核苷酸一致性(ANI)分析。结果 SQ219和SQ220为革兰阴性杆菌, 专性需氧, 触酶和氧化酶阳性, 无动力;在30℃、pH7和不含NaCl的培养基中生长最佳;SQ220可在血平板上产生黄色素但SQ219不产生;SQ219和SQ220对氨曲南、阿米卡星、妥布霉素、黏菌素耐药, 与金黄杆菌属药敏表型一致。SQ219和SQ220总长分别为5.08 Mb和4.80 Mb, G+C含量分别为36.72%和36.36%, 均预测到β-内酰胺类耐药基因(blaCGA)。16S rRNA系统发育分析表明SQ219、SQ220与啤酒神金黄杆菌DSM18014T相似性最高, 分别为98.93%和98.36%;核心基因组进化分析显示SQ219、SQ220与啤酒神金黄杆菌DSM18014T的进化关系最近。然而, 两株菌与啤酒神...     

一株不典型山夫登堡沙门氏菌的鉴定及其16SrRNA序列分析

目的对一株从广州市食品从业人员肛拭子中分离的蔗糖发酵型沙门氏菌进行鉴定。方法应用培养特性试验、生化分析、血清型鉴定,及16S rRNA序列分析进行鉴定。结果该菌培养特性及生化特性符合沙门氏菌定义,但与普通沙门氏菌在蔗糖利用、硫化氢产生上存在差异。血清型鉴定为山夫登堡沙门氏菌（Salmonella enterica Subsp·enterica serovar Senftenberg）,16S rRNA序列分析为肠道沙门氏菌亚种（Salmonella enterica subsp）。结论该菌为一株蔗糖发酵型、硫化氢阴性的不典型山夫登堡沙门氏菌。     

微阵列技术诊断神经系统细菌感染

微阵列技术以高通量、大规模、微型化和平行化的显著特点，已越来越多地应用于人类疾病诊断。我们在细菌的16S rRNA基因内设计了一套保守的通用引物，并对脑脊液常见病原菌各设计了2条特异性探针，建立了膜微阵列技术平行检测脑脊液病原菌DNA的方法，在对标准菌株进行检测鉴定的基础上，又对34株脑脊液临床分离株进行了鉴定，其结果可靠，而且仅用5h即可鉴定出菌种，具有一定的现实意义。     

质粒介导16S rRNA甲基化酶在奇异变形杆菌临床分离株的流行情况研究

到目前为止,在革兰阴性杆菌中已发现AnnA、RmtA、RmtB、RmtC、RmtD和NpmA 6种16S rRNA甲基化酶,且编码这些酶的基因通常和超广谱β-内酰胺酶(ESBL)基因共处一个质粒上,通过质粒在不同的菌株之间播散[1-]4.RmtC型16S rRNA甲基化酶首次在奇异变形杆菌中被发现[4],但16S rRNA甲基化酶在奇异变形杆菌中的流行情况还不清楚.本研究的目的是对从我院2004年5月至2007年9月临床标本中分离的198株奇异变形杆菌进行16SrRNA甲基化酶筛查,并对其转移机制进行研究,现将结果报道如下.     

质粒介导16S rRNA甲基化酶在奇异变形杆菌临床分离株的流行情况研究

到目前为止,在革兰阴性杆菌中已发现AnnA、RmtA、RmtB、RmtC、RmtD和NpmA 6种16S rRNA甲基化酶,且编码这些酶的基因通常和超广谱β-内酰胺酶(ESBL)基因共处一个质粒上,通过质粒在不同的菌株之间播散~[1-4].RmtC型16S rRNA甲基化酶首次在奇异变形杆菌中被发现~[4],但16S rRNA甲基化酶在奇异变形杆菌中的流行情况还不清楚.本研究的目的是对从我院2004年5月至2007年9月临床标本中分离的198株奇异变形杆菌进行16SrRNA甲基化酶筛查,并对其转移机制进行研究,现将结果报道如下.     

用16S rRNA基因序列分析从西藏的微小牛蜱中检出的埃立克体

用埃立克体属特异性套式PCR和DNA序列测定从西藏微小牛蜱检出边缘无形体和埃立克体;用半套式PCR扩得该埃立克体的16S rRNA基因,并测定了它的序列;将该埃立克体的16S rRNA基因序列与其它埃立克体的16S rRNA基因序列进行对比分析,结果证明它的16S rRNA基因与埃立克体属的犬埃立克体群16S rRNA基因相似水平最高(97%～98%);用16S rRNA基因序列做系统发育分析,结果显示该采自西藏的微小牛蜱的埃立克体可能是与查菲埃立克体密切相关的一种新埃立克体.     

应用激光捕获显微切割技术分离肝癌石蜡组织标本中细菌及螺杆菌基因的检测

目的　对肝癌石蜡组织标本病理切片中发现的细菌进行分离鉴定。方法　38例肝癌石蜡组织标本经聚合酶链反应(PCR)扩增螺杆菌16S rRNA,阳性标本病理切片后行石炭酸碱性品红染色观察幽门螺杆菌(H.pylori),应用激光捕获显微切割技术(LCM)分离光镜下观察到的细菌,分离的细菌经PCR扩增螺杆菌16S rRNA,PCR产物进行测序及同源比较,阳性者再扩增H.pylori的特异基因[相对分子质量(Mr)为26×103 蛋白,H.pylori种特异抗原]和相关功能基因(cagA,vacA)。结果15例肝癌石蜡组织标本中检测到螺杆菌16S rRNA,选取观察到细菌数量较多的6例用于LCM分离。分离的6例细菌样本均扩增出螺杆菌16S rRNA,经测序与H.pylori有99%~100%的同源性。4例Mr为26×103 蛋白基因阳性,1例扩增出cagA基因,未扩增出vacA基因。结论　肝癌石蜡组织中经PCR检测到的H.pylori就是病理观察到的细菌。