靶向mdr1基因转录小发夹RNA重组质粒的构建和序列分析

目的 构建针对多药耐药基因(mdr1)编码区的发夹状RNA重组质粒栽体pshRNA-mdr1,并行序列分析,为下一步逆转肿瘤的多药耐药性打下基础。方法设计含19-21bp mdrl编码基因片段及中间以4个bp间隔的反向重复序列,经退火形成互补双链,克隆至转录栽体pTZU6 1上,转化JM109菌株,提取重组质粒酶切鉴定并序列分析。结果将合成的DNA片段成功克隆至载体上,经酶切及序列鉴定为目的序列。结论靶向mdr1基因发夹状RNA干扰重组质粒的成功构建,可进一步研究其对mdr1 mRNA转录的抑制,达到逆转肿瘤的多药耐药性的目的。     

Livin基因shRNA对恶性胶质瘤生长和凋亡的影响

目的 研究livin基因短发夹RNA(shRNA)对恶性胶质瘤生长和凋亡的影响.方法 将构建的livinβ基因shRNA真核表达载体以脂质体法转染C6细胞.应用Western blot检测livin表达水平;采用MTT法检测细胞增殖;采用流式细胞术检测细胞凋亡的变化.结果 Livin基因的shRNA可显著抑制C6细胞livin表达(P<0.01),转染组细胞生长受到显著抑(P<0.01),C6细胞凋亡率明显增高,细胞周期出现明显的G2/M阻滞.结论 Livin基因的shRNA导入C6胶质瘤细胞后抑制了livin基因在人胶质瘤细胞C6中的表达,并显著地诱导C6细胞发生凋亡.     

UNC5B基因靶向shRNA表达质粒的构建及体外RNA干扰

目的：探讨人UNC5B基因的双链RNA在体外对UNC5B表达的干扰作用及其规律。方法：构建两个能产生UNC5B的发夹状RNA（shRNA）的质粒载体Pgenesil—UNC581及Pgenesil—UNC582作为实验组，并构建无关序列shRNA表达质粒Pgenesil—NC作为阴性对照，将3种质粒分别转染脐静脉内皮细胞（HUVEC）。转染24h后，荧光倒置显微镜下观察质粒转染效率，用G418筛选得到稳定转染的细胞，通过逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测UNC5B在HUVECs中的表达情况。结果：转染24h后，在荧光显微镜下可见绿色荧光，转染效率约为40％～50％。实验组经G418筛选后稳定转染的细胞UNC5BmRNA均受到抑制。两种UNC5B基因靶向shRNA表达质粒对HUVECs中UNC5B抑制率分别为88％和52％。结论：本研究所构建的UNC5BshRNA表达质粒可在体外高效特异地抑制UNC5B的表达，为进一步实验奠定了基础。     

ATX短发夹shRNA表达载体的构建和测序

目的 构建ATX基因重组表达载体,并进行测序鉴定,为下一步探索肿瘤基因治疗的途径打下基础.方法 设计有小发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至Psilencer2.1-U6 neo质粒载体中构建重组表达载体,转化DH5a菌株,提取质粒行酶切鉴定后,进行序列鉴定.结果 成功构建了ATXshRNA重组表达载体.结论 ATX shRNA质粒表达载体的成功构建为研究ATX靶向RNA干扰抗肿瘤的作用打下基础.     

shRNA病毒递送载体

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种有力的基因沉默工具,在功能基因组学、微生物学、基因表达调控机制研究等领域广泛应用。RNAi可以用于鉴定药物靶标及治疗疾病,尤其是传统治疗手段无效的重大疾病。如何将双链小干扰RNA(siRNA)高效传递至体内靶细胞是RNAi成功用于疾病治疗的关键,也是目前研究的热点。由于病毒载体能高效转导多种细胞成为基因工程和基因治疗的主要载体。目前,越来越多的研究将病毒载体应用于介导RNAi,然而病毒载体存在靶向性差、生物安全性等问题。本文针对这些病毒载体的优劣进行归纳并指出今后改进的方向。     

靶向血管内皮生长因子和神经生长因子的shRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的利用RNA干扰（RNAi）技术,构建靶向血管内皮生长因子（VEGF）、神经生长因子（NGF）双基因的短发夹RNA（short hairpin,shRNA）真核表达载体用于胶质瘤基因治疗。方法分别设计并体外合成靶向基因VEGF、NGF的特异性编码shRNA序列的寡核苷酸,克隆到经BglⅡ—HindⅢ酶切线性化的pSUPER质粒H1启动子下游,构建shRNA重组质粒,进而脂质体介导瞬时转染胶质瘤细胞系U251,半定量RT-PCR检测VEGF mRNA、NGF mRNA表达。结果重组质粒经过酶切鉴定和测序,插入片段的序列大小、位点和方向均与已合成的寡核苷酸的序列完全一致,在瞬时转染胶质瘤细胞后下调了VEGF mRNA、NGF mRNA的表达。结论成功构建靶向基因VEGF、NGF的shRNA真核表达载体,为进一步应用RNAi技术,研究其对胶质瘤的抑制作用奠定基础。     

靶向MMP-2基因的RNA干扰质粒表达载体的构建

目的 构建基质金属蛋白酶2(MMP-2)特异的RNA干扰(RNAi)质粒载体,用于探讨抑制MMP-2基因表达在抗胰腺癌侵袭转移中的意义.方法 根据GenBank中提供的MMP-2基因序列,设计能存体内转录小发央结构RNA(shRNA)的cDNA序列,合成该序列并将其连接到pGCsi-U6/Neo/GFP质粒,构建受控于人U6启动子的质粒表达载体.结果 PCR鉴定和测序鉴定显示构建的重组质粒pGCsi-MMP-2含有目的 基因序列.结论 靶向MMP-2基因的RNAi质粒表达载体被成功构建.     

RNA干扰ezrin基因真核生物表达载体的构建及鉴定

目的 构建用于RNA干扰(RNAi)的小发夹RNAshRNA表达载体并检测其对ezrin基因的沉默效果.方法 以ezrin为靶基因,以pGenesil-1质粒为载体,设计和构建重组体,根据GeneBank数据库提供的ezrin核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,设计2条小发夹结构的DNA序列,经退火形成互补双链,克隆到空载体pGenesil-1中,转化DH5a菌株,提取质粒,予以酶切和测序鉴定;重组质粒转染786-0肾癌细胞株,运用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法进行筛选鉴定.结果 酶切及测序鉴定表明成功地构建重组质粒shRNA-ezrinl、shRNA-ezrin2;荧光实时定量PCR和蛋白质印迹法检测结果显示,肾癌细胞中shRNA-ezrinl、shRNA-ezrin2 mRNA相对表达量分别为(0.3376±0.0166)及(0.4661±0.0266),shRNA-ezrinl与shRNA-ezrin2相对表达量差异有统计学意义(P＜0.01),根据基相对表达量算出shRNA-ezrinl,shRNA-ezrin2 ezrin-mRNA的表达量抑制率分别为66.33％及53.29％.转染重组质粒后显著抑制786-0细胞中ezrin mRNA和蛋白表达,其中shRNA-ezrinl的抑制效率最高.结论 成功构建ezrin基因的shRNA表达载体,并筛选出抑制率较高的重组质粒载体shRNA-ezrinl,为进一步研究ezrin基因沉默对肾癌786-0细胞株生物学行为的影响奠定基础.     

E2F6基因真核表达质粒的构建与鉴定

目的 构建含E2F6基因的重组pFLAGCMV10质粒并进行鉴定.方法 以人全血细胞的总RNA为模板,用RT-PCR方法 扩增出E2F6基因.将PCR产物克隆进真核载体pFLAGC-MV10内,构建含E2F6基因的重组真核表达质粒.重组质粒转染293T细胞,用Western blot方法 检测E2F6在293T细胞中的表达.结果 核酸序列分析的结果 表明,克隆的E2F6基因与GenBank中已登记的E2F6基因序列100%同源.Western blot结果 显示,在约35-kD位置有目的 条带,与预期的重组E2F6蛋白大小一致.结论 成功构建了含E2F6基因的真核表达质粒.     

HP450基因的克隆及质粒载体的构建和鉴定

目的HP450基因的克隆载体构建.方法用RT-PCR技术克隆HP450基因,T-A连接到pMD18-T载体,经菌液PCR,酶切鉴定.构建成pMD18-HP450重组质粒载体.结果测序显示完全正确,实现了HP450基因的克隆和质粒载体的构建.结论可以对重组成功的HP450基因进行体外表达和动物的体内应用.     

KH34基因荧光表达质粒的构建

目的：构建KH34基因的荧光表达质粒。方法应用分子生物学手段将KH34基因克隆入phage-UBC-flag-cherry载体,构建KH34的荧光表达质粒,并以该质粒转染293T细胞,荧光显微镜下观察该质粒在细胞内的定位。结果成功构建了KH34的荧光表达质粒,并成功转染293T细胞。结论本实验成功构建了KH34的荧光表达质粒,转染后的293T细胞也具有明显的红色荧光,为后续分析KH34对细胞的功能影响奠定了基础。     

DDX46基因慢病毒载体的构建及其在人膀胱癌细胞中的表达

目的 构建DDX46基因低表达慢病毒载体,并检测其在人膀胱癌细胞中的表达效果,为DDX46基因在人膀胱癌细胞中的研究奠定基础。方法 应用实时荧光定量检测5637细胞和T24细胞中DDX46 mRNA表达水平,以寻找合适的细胞系进行实验。分别以DDX46基因序列和普适型阴性序列为模板,设计合成靶点序列,并合成寡核苷酸双链,定向克隆到慢病毒质粒GV115,合成重组质粒shDDX46和shRNA,分别称之为实验组和对照组。将不同重组质粒与pHelper 1.0和pHelper 2.0分别转染293T细胞以包装成慢病毒颗粒后感染5637细胞和T24细胞。应用实时荧光PCR定量检测重组慢病毒感染5637细胞和T24细胞后DDX46 mRNA表达水平,判断其干扰效率。结果 5637细胞和T24细胞均高丰度表达DDX46mRNA,其结果（用ΔCt值表示）分别为（6.53±0.08）和（8.48±0.11）;重组慢病毒感染膀胱癌细胞后,在5637细胞中,实验组DDX46 mRNA的表达水平（用ΔCt值表示）为（0.32±0.01）,低于对照组（1.00±0.10）,差异有统计学意义（P<0.05）,其敲减效率为67.70%;在T24细胞中,实验组DDX46 mRNA的表达水平（用ΔCt值表示）为（0.11±0.01）,低于对照组（1.00±0.03）,差异有统计学意义（P<0.05）,其敲减效率为89.00%。结论 成功构建DDX46基因低表达慢病毒载体,为研究DDX46基因在膀胱癌细胞中的作用奠定了基础。     

USP22 ShRNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的：构建并鉴定USP22基因ShRNA慢病毒载体,为进一步研究USP22基因在鼻咽癌中的作用机制奠定基础。方法针对USP22基因的编码序列设计并合成2条特异性干扰序列,序列两端含有限制性内切酶位点HpaⅠ和X hoⅠ。寡核苷酸链退火生成寡核苷酸双链,5＇端磷酸化后将含有酶切位点的寡核苷酸双链克隆到pLL3.7慢病毒表达载体。连接产物经转化、培养,提取其质粒,提取出来的质粒经HpaⅠ和XhoⅠ酶切电泳鉴定,鉴定正确的质粒进行测序。构建成功的慢病毒表达载体pLL-USP22-shRNA与包装载体质粒混匀共转染于293T细胞。通过荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）情况,对病毒滴度和感染效率进行检测。结果成功构建慢病毒表达载体pLL-USP22-shRNA。与包装载体质粒共转染293T细胞后测定慢病毒滴度为4×10^7 TU/ml。结论本实验应用相关技术成功构建USP22 ShRNA慢病毒载体,为进一步研究USP22基因的生物学功能奠定了基础。     

胰腺癌Bx-PC3细胞Survivin基因ShRNA质粒表达载体的构建

目的：构建针对胰腺癌Bx—PC3细胞Survivin基因2条shRNA的质粒表达载体。方法：以Survivin基因为靶点，通过自行设计并构建包含两段短发夹状RNA（small hairpin RNA，shRNA），携带有各自的U6启动子和终止码、共同的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，EGFP）基因和Neo基因的pGenesil-1 Survivin shRNA载体，利用脂质体介导的方法转染人胰腺癌Bx—PC3细胞，RT—PCR观察其对Bx—PC3细胞Survivin基因表达的影响。结果：HE1质粒和HE2质粒的酶切鉴定正确，质粒转化菌液HE1、HE2进行测序分析均为插入正确的克隆质粒。胰腺癌Bx—PC3细胞转染成功。转染细胞后SurvivinmRNA的表达有明显抑制。结论：实验构建针对胰腺癌细胞Survivin基因2条shRNA的质粒表达载体成功。     

携带白细胞介素2和NK4双基因真核共表达质粒的构建及活性观察

目的 构建同时携带白细胞介素2（IL-2）和NK4基因的真核表达载体（pIRES-IL-2-IRES-NK4）,观察其在防治肿瘤中的潜在应用前景.方法 根据Pubmed上公布的IL-2及NK4 mRNA序列,设计扩增IL-2及NK4 cDNA的特异性引物,以PBV220-IL-2质粒和PCAGGS/hNK4质粒为模板,分别扩增IL-2及NK4基因,并将IL-2及NK4基因分别克隆在真核表达载体pIRES-SEQ的XhoI、MLuI位点和SalI、NotⅠ位点.获得同时携带IL-2和NK4基因的重组真核表达质粒pIRES-IL-2-IRES-NK4.该重组质粒转染肝癌细胞HepG2后,检测目的基因的转染表达及表达产物对HepG2细胞增殖的影响.结果 通过对构建质粒克隆进行测序及酶切,证实携带IL-2和NK4双基因的真核表达质粒pIRES-IL-2-IRES-NK4构建成功.用pIRES-IL-2-IRES-NK4转染HepG2细胞后24 h后在荧光显微镜下可观察到细胞有较强的绿色荧光表达,48 h时荧光更强;逆转录聚合酶链反应结果表明转染pIRES-IL-2-IRES-NK4质粒细胞的IL-2及NK4基因表达明显增强.酶联免疫吸附测定检测结果表明,转染组细胞较对照组细胞培养上清中IL-2及NK4蛋白表达水平明显增强.转染组48 h后的IL-2、NK4蛋白表达水平为2.139、1.956 mg/L,明显高于未转染组的0.492、0.620 mg/L.四甲基偶氮唑盐法结果表明转染真核表达质粒pIRES-IL-2-IRES-NK4的细胞表达上清,有明显抑制肝癌细胞HepG2增殖的活性,且有剂量效应关系.结论 本研究成功构建了同时携带IL-2和NK4基因的重组真核表达质粒pIRES-IL-2-IRES-NK4,该质粒可有效转染肝癌细胞,且转染细胞表达上清有明显抑制肝癌细胞HepG2增殖的活性,提示该重组质粒有潜在防治肿瘤的应用前景.     

组蛋白去乙酰化酶3真核表达载体的构建和鉴定

目的利用pEGFP-N1真核表达载体构建组蛋白去乙酰化酶3真核表达载体pEGFP-Hdac3,并鉴定其在大鼠肝癌细胞系CBRH-7919中的表达。方法利用大鼠肝脏cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)获取目的基因Hdac3;用HindⅢ、BamH I双酶切真核表达载体pEGFP-N1和目的基因Hdac3,用T4 DNA连接酶连接纯化后的酶切产物;连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞并挑选阳性克隆,并通过PCR、双酶切、DNA测序鉴定构建的重组质粒。利用测序正确的重组体转染CBRH-7919细胞,检测Hdac3和PPAR-γ的mRNA表达。结果利用基因克隆技术获得组蛋白去乙酰化酶3的真核表达载体pEGFP-Hdac3重组质粒。PCR,双酶切,DNA测序证实目的基因H-dac3已成功插入pEGFP载体中。用重组质粒转染大鼠肝癌细胞系CBRH-7919后Hdac3 mRNA表达显著升高、而PPAR-γmRNA表达明显降低。结论本研究成功构建了蛋白去乙酰化酶3的真核表达载体pEGFP-Hdac3。     

反向重复序列法构建神经病靶标酯酶RNA干涉表达质粒

目的构建基于通用真核表达载体的人神经病靶标酯酶双链RNA的稳定表达载体。方法在正义和反义引物两端分别加上EcoRⅠ和BamHⅠ的识别位点扩增得到神经病靶标酯酶活力域序列,构建含有目标基因的倒置重复序列的双链RNA表达载体pcDNA.NTE.dsRNA,酶切分析鉴定重组载体。脂质体法转染到Hela细胞中瞬时表达重组载体,酶活力测定其对细胞内神经病靶标酯酶活力的影响。结果成功构建了NTE双链RNA稳定表达载体pcDNA.NTE.dsRNA,表达该载体细胞内NTE活力明显下降至对照细胞的20%左右。结论采用反向重复序列法将靶标基因的编码序列正反向插入到通用真核细胞表达载体中,是构建哺乳细胞基因双链RNA稳定表达载体的有效方法。     

Livin shRNA慢病毒载体的成功构建及鉴定

目的构建携带livin基因短片段发卡RNA（livin shRNA）的慢病毒载体。方法针对已经筛选确定的干扰人livin基因的有效靶序列,设计、合成靶序列的寡聚脱氧核苷酸DNA序列（OligoDNA）,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ酶切后的携带U6启动子和绿色荧光蛋白的pGCL—GFP载体连接产生短片段发卡RNA慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。结果PCR鉴定与DNA测序证实合成的含livin shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确。结论成功构建人livin shRNA慢病毒载体。     

hMSH2反义核糖核酸表达质粒的构建

利用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）, 特异地扩增HeLa细胞中hMSH2 cDNA的最保守区域, 并将其克隆到TA载体, 从重组质粒两端进行序列分析, 证实为目的片段. 将该目的片段反向克隆到哺乳动物表达载体pREP9的 BamHⅠ和KpnⅠ位点之间, 筛选后得pREP9-hMSH2反义表达重组质粒. 用磷酸钙-DNA共沉淀法将重组质粒DNA及载体DNA分别导入HeLa细胞, 经G418筛选, 扩大培养. 凝胶阻滞实验证实转染有pREP9-hMSH2重组质粒的HeLa-MSH2细胞抽提物中G·T和A·C错配结合蛋白质表达明显降低, 为研究hMSH2基因功能提供了一有效细胞系.