一种棘孢曲霉α-L-鼠李糖苷酶的结构及性质特征研究

α-L-鼠李糖苷酶是一种具有重要应用价值的诱导酶。目前,α-L-鼠李糖苷酶的结构与功能关系尚不明确。本文以柚皮苷为诱导物培养棘孢曲霉产α-L-鼠李糖苷酶,研究该酶的结构及酶学性质特征。经质谱分析该α-L-鼠李糖苷酶属于棘孢曲霉α-L-鼠李糖苷酶A。三维结构模拟发现该α-L-鼠李糖苷酶具有N端β-折叠结构域、C端β-折叠结构域、clan-L(alpha/alpha)(6)-桶状催化结构域以及具有Asp等九个完全保守氨基酸残基,说明该酶属于糖苷酶78家族成员。分子对接发现该酶通过酸碱催化的机制水解柚皮苷。该酶的最适温度50℃,最适pH 4.0,1 mM与10 mM的Ag+、Fe~(2+)及Fe~(3+)对该酶有较强的抑制作用;该酶可以水解柚皮苷、橙皮苷和杨梅苷,其水解柚皮苷的动力学符合典型的米氏方程,Km值为0.23 mM,Vmax为565.1 U/mg。以上结果丰富了α-L-鼠李糖苷酶的结构与功能关系的研究理论,为开发性质优良的α-L-鼠李糖苷酶提供了信息参考。     

α-L-鼠李糖苷酶高密度发酵及其固定化

在5 L发酵罐中对α-L-鼠李糖苷酶进行小试发酵,制备酶液;以聚乙烯醇-海藻酸钠为包埋载体,以戊二醛为交联剂对该酶进行固定化。经5 L罐高密度发酵96 h,α-L-鼠李糖苷酶酶活为2 766 U/g,生物量为228g/L。经过固定化后,α-L-鼠李糖苷酶的酶活为20 U/g,酶活回收率为32.88%,固定化α-L-鼠李糖苷酶的最适反应温度为35~50℃,最适反应p H值为4.0,该固定化酶在连续使用6次后酶活仍然保留98.22%。高密度发酵能显著提高酶的产量,同时固定化技术提高了酶的重复利用率,为该酶利用芦丁酶法转化制备异槲皮苷提供了依据。     

耐久肠球菌产α-L-鼠李糖苷酶的液体发酵培养基优化研究

通过单因素试验及正交试验确定最佳碳源、氮源和无机盐浓度.最佳培养基的基本组成为蔗糖1.25%,大豆蛋白胨1.25%,磷酸二氢钾2mmol/L,牛肉膏0.3%,蛋白胨1%,氯化钠0.5%,硫酸铁3mmol/L.最佳培养条件为培养温度34℃,发酵时间4d,70mL培养基的接种量为3%.     

曲霉来源的α-L-鼠李糖苷酶结构特征规律分析

为了研究所有曲霉来源的α-L-鼠李糖苷酶的结构特征,利用NCBI数据库收集到291条无重复的曲霉来源α-L-鼠李糖苷酶核酸序列并通过进化树筛选得到21条具有代表性的蛋白序列,通过序列比对分析得到这21条序列相互独立具有可靠的代表性,并利用生物信息学工具对其理化性质、跨膜区、信号肽进行分析发现,曲霉来源α-L-鼠李糖苷酶的等电点(p I)范围为4.66～7.17,在氨基酸数量、分子量、原子总数上波动较大,其中有10条序列拥有信号肽,1条序列为两次跨膜蛋白,21条序列都为亲水性蛋白;对其进行进化树构建、三级结构建模及结构叠合发现,这21条代表性序列的蛋白结构可以被分成两大类型,第一大类型含有1个(α/α)6桶状结构和在桶底的1个β片层结构,并根据额外含有的β片层数量的不同再被分成4个小类;第二大类型拥有1个(α/β)8结构和环绕在桶装结构域周围的β片层结构,阐明了曲霉来源的α-L-鼠李糖苷酶的蛋白结构特征,这有助于更好的明确α-L-鼠李糖苷酶的共性规律,为改造该酶提供理论指导。     

α-L-鼠李糖苷酶的研究进展

α-L-鼠李糖苷酶是一种水解酶,可以作用于α-1,2、α-1,3、α-1,4、α-1,6以及α1连接的糖苷键,广泛存在于自然界的细菌和真菌中。不同来源的α-L-鼠李糖苷酶的结构不同,其催化特性也不尽相同。α-L-鼠李糖苷酶在食品、医药、化学等行业都有广泛的应用。该文综述了α-L-鼠李糖苷酶的来源、分类、特性及应用等。     

塔宾曲霉固态发酵产物中α-L-鼠李糖苷酶的分离纯化及酶学性质分析

α-L-鼠李糖苷酶是一种在食品、药品中有重要用途的糖苷酶,但其结构与功能关系尚不明确,限制了优良酶制剂的设计。本文通过硫酸铵分级沉淀、疏水层析和亲和层析从塔宾曲霉固态发酵柚皮产物中分离纯化得到了一种α-L-鼠李糖苷酶,纯化倍数和比活力分别为34和21105 IU/mg,SDS-PAGE测得该酶的分子质量为120 ku;纯化得到的α-L-鼠李糖苷酶最适反应p H为4.0,最适反应温度为50℃,p H稳定性和热稳定性好;Fe²⁺对酶活有促进作用,Mn²⁺、Ca²⁺、Cd²⁺对酶有抑制作用;该酶可水解柚皮苷,但对芸香苷和对硝基苯酚鼠李糖的转化率较低,不水解杨梅苷和柴胡皂苷C。以上结果表明纯化得到的α-L-鼠李糖苷酶在金属离子影响特性、底物特异性方面具有新颖性,丰富了α-L-鼠李糖苷酶的结构与功能关系研究素材。      

从黑曲霉固态发酵产物中纯化α-L-鼠李糖苷酶及酶法制备普鲁宁

本文研究了从黑曲霉固态发酵产物中纯化α-L-鼠李糖苷酶,并探究利用该酶转化柚皮苷制备普鲁宁。用黑曲霉固态发酵柚皮产生α-L-鼠李糖苷酶,通过40%~80%硫酸铵沉淀、疏水层析、亲和层析和凝胶过滤层析,从黑曲霉固态发酵产物中分离纯化得到了1种α-L-鼠李糖苷酶;该酶为单体分子量约为160 k Da;它由二硫键连接的两个肽段构成,其中有一个大肽段分子量约为130 k Da。其水解柚皮苷的最适温度为50~60℃,最适p H 4.0~5.0,米氏常数和最大酶反应速度分别为0.24μmol/m L和312.5 U/m L。用该酶转化柚皮苷制备普鲁宁的最适反应时间为60~90 min,柚皮苷转化率达98%以上。转化产物中普鲁宁的含量在95%以上,普鲁宁的分解产物柚皮素的含量小于5.0%。用从黑曲霉固态发酵产物中纯化的α-L-鼠李糖苷酶制备普鲁宁具有热稳定性好、底物亲和力强、转化率高和副产物少等优点,为开发酶法制备普鲁宁的工艺提供了重要参考。     

黑曲霉菌丝体活力对α-L-鼠李糖苷酶发酵的影响

α-L-鼠李糖苷酶是工业上一种重要的水解酶。为了方便地优化和监控α-L-鼠李糖苷酶的发酵生产过程,在5 L发酵罐水平研究黑曲霉菌丝体活力与α-L-鼠李糖苷酶产量之间的关系,菌丝体活力采用TTC-脱氢酶法进行测定。实验结果表明,在发酵过程中维持适宜的菌丝体活力对α-L-鼠李糖苷酶的产量非常重要:当摇瓶种子菌丝体活力达到最大值0.388 U/mL时,对应的5 L发酵罐中α-L-鼠李糖苷酶的产量最大;控制发酵过程的pH恒定于5.5,可以有效延缓菌丝体活力下降速度,使α-L-鼠李糖苷酶的产量提高28.7%;当搅拌转速低于400r/min或通气量低于0.3 vvm时,发酵24～36 h的菌丝体活力大幅下降,α-L-鼠李糖苷酶的产量显著降低。因此,可以将菌丝体活力作为α-L-鼠李糖苷酶发酵工艺优化和生产过程控制中一项重要的监控参数。     

多点突变提高α-L-鼠李糖苷酶热稳定性

为了提高α-L-鼠李糖苷酶的热稳定性,对实验室前期构建的K406R、K440R、K573V、E631F四个不同氨基酸位点的单点突变体进行联合突变,得到了K406R-K573V、K406R-E631F、K440R-K573V、K440R-E631F四个联合突变体。结果表明,相比于野生型(wild type,WT),联合突变体K440R-K573V和K440R-E631F的热稳定性有所提高,在60℃时半衰期分别提高了1. 13倍,1. 44倍;在65℃的半衰期分别提高了1. 64倍,1. 64倍;在70℃的半衰期分别提高了1. 88倍,1. 68倍。对突变体K440R-E631F进行圆二色谱分析、分子动力学以及分析微观结构变化分析可知,K440R-E631F突变体与WT相比,内部疏水性有所提高,二级结构中α-螺旋、"-转角、无规则卷曲含量增多,可能与热稳定性的提高相关。     

α-L-鼠李糖苷酶AnRhaE在毕赤酵母中的表达及应用

α-L-鼠李糖苷酶对天然产物之间的转化具有重要的作用和应用价值.该研究采用毕赤酵母表达 α-L-鼠李糖苷酶AnRhaE,构建pPIC9K-AnRhaE表达载体,电转化至毕赤酵母GS115和KM71H中,经诱导表达,SDS-PAGE电泳显示GS115更有利于生产AnRhaE酶.AnRhaE酶在45～55℃时酶活力高,最适...     

黑曲霉DB056发酵α-鼠李糖苷酶和柚苷酶培养基的优化研究

目的:优化黑曲霉DB056产α-鼠李糖苷酶和柚苷酶的培养基,提高这两种醇的产量.方法:以α-鼠李糖苷酶活力和柚苷酶活力为指标,研究碳源、氯源和乳化剂Triton X-100对α-鼠李糖苷酶活力和柚苷酶活力的影响,优化黑曲霉DB056摇瓶发酵α-鼠李糖苷酶和柚苷酶的培养基.结果:碳氮源的种类与浓度,乳化剂Triton X-100的浓度对黑曲霉DB056产α-鼠李糖苷酶和柚苷酶有重要影响;黑曲霉DB056产酶的优化培养基是:柚皮苷3.5 g/L,玉米浆4g/L,MgSO4·7H2O 1.0g/L,KH2PO41.0g/L,KCl 0.5 g/L,无水CaCl20.1 g/L,乳化剂Triton X-1001.0%.此时α-鼠李糖苷酶活力和柚苷酶活力分别为994U/mL和276U/mL,分别比发酵初始培养基提高了42.3%和147.8%.结论:通过培养基优化,大幅度提高了黑曲霉DB056液态深层发酵α-鼠李糖苷酶活力和柚苷酶活力.     

红曲霉固态发酵产生淀粉酶培养基的优化

研究碳源、氮源、无机盐对红曲霉M2固态发酵产生淀粉酶的酶活性影响。在单因素试验的基础上,采用响应面试验设计对红曲霉固态发酵产生淀粉酶的培养基进行优化,并建立乳糖、(NH4)2SO4、K2HPO4变化的二次回归方程,探讨各因素对生淀粉酶酶活力的影响。在固态发酵基础培养基中,最终确定适宜的培养基条件为：乳糖添加量为8.18%、(NH4)2SO4添加量为6.36%、K2HPO4添加量为0.91%;在该条件下可得到红曲霉M2产生淀粉酶的最大酶活力,预测值为680.29 U/g,对实验结果进行验证,得到生淀粉酶酶活力为662.21 U/g。     

α-L-鼠李糖苷酶发酵过程放大研究——从5L到30L发酵罐

以产α-L-鼠李糖苷酶(α-L-1,2-鼠李糖苷酶和α-L-1,6-鼠李糖苷酶)的黑曲霉As-pergillus niger WZ001为考察对象,研究了从5L发酵罐到30 L发酵罐的通气量和搅拌转速的放大工艺.通气量按三种准则、搅拌转速按两种准则放大.通过实验验证,优选得到最佳放大准则为:通气量按1.5倍空气表观线速度进行放大、搅拌转速按搅拌桨叶尖线速度放大.在该优化的放大工艺条件下,30 L发酵罐中α-L-1,2-鼠李糖苷酶和α-L-1,6-鼠李糖苷酶的产量分别为2 515 U/mL和3 612 U/mL,达到5L发酵罐的水平.     

真核α-L-鼠李糖苷酶的碳水化合物结合结构域功能架构分析

为了分析位于CAZy数据库的CBM67家族的真核α-L-鼠李糖苷酶的CBM的功能,利用Ex PASy网站和MEGA 6.0软件进行CBM67家族的真核α-L-鼠李糖苷酶的理化性质分析、进化树的构建,发现CBM67家族的真核α-L-鼠李糖苷酶可被分为三大类,且大部分为疏水性蛋白,氨基酸数量范围为239～377个,分子量(Mr)范围为24540.58～40740.16 u,等电点(p I)范围为3.93～8.74,负电荷残基总数范围为20～29个,正电荷残基总数范围6～33个,原子总数范围为3415～5712,亲水性平均系数范围为-0.077～0.377,;通过Clustal X 2.0程序和Espript网站进行序列比对分析确定CBM67家族真核α-L-鼠李糖苷酶CBM所在的氨基酸区域。采用Discovery Studio 2019软件进行同源建模和分子对接,构建出由12个β折叠组成的α-L-鼠李糖苷酶CBM三维结构,与L-鼠李糖进行分子对接的结果表明CBM能够通过与底物产生强的氢键和范德华力来识别底物,促进酶水解反应的发生。这有助于更好的理解CBM识别并结合底物的结构基础与共性规律,从而为提高CBM的结合力提供理论指导。     

碳源及阻遏蛋白CreA对黑曲霉产α-L-鼠李糖苷酶的影响

【目的】研究碳源对黑曲霉JMU-TS528发酵α-L-鼠李糖苷酶的影响,并探讨葡萄糖阻遏黑曲霉合成α-L-鼠李糖苷酶的分子机制。【方法】分别用5种单一碳源进行摇瓶发酵,高效液相色谱法测定经黑曲霉发酵后产物中的α-L-鼠李糖苷酶活性;通过在培养基中添加葡萄糖进行液态发酵,研究葡萄糖对黑曲霉JMU-TS528产α-L-鼠李糖苷酶的影响,并用实时定量PCR技术检测α-L-鼠李糖苷酶基因rha和葡萄糖抑制基因Cre A的相对表达量。【结果】黑曲霉JMU-TS528在以柚皮苷、橘皮苷、芸香苷和鼠李糖为唯一碳源时可分泌α-L-鼠李糖苷酶,以葡萄糖为唯一碳源时不能合成α-L-鼠李糖苷酶;培养基中添加葡萄糖后,黑曲霉发酵产物中α-L-鼠李糖苷酶活性降低,黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶基因rha表达量降低,而葡萄糖抑制基因Cre A表达量上升。【结论】黑曲霉JMU-TS528菌株液态发酵条件下合成α-L-鼠李糖苷酶需要诱导物作为碳源,该菌株合成α-L-鼠李糖苷酶的能力受到葡萄糖的调节作用,此调控过程可能通过一个依赖阻遏蛋白Cre A的机制实现。     

GH78家族真菌α-L-鼠李糖苷酶分子系统进化关系分析

为了分析糖苷水解酶第78家族(glucoside hydrolase family 78,GH78)中真菌α-L-鼠李糖苷酶保守区及进化关系,本研究应用Clustal W2软件对87条GH78家族真菌α-L-鼠李糖苷酶进行多重序列比对,利用Block Maker进一步分析,得到了该家族真菌的共有完全氨基酸保守位点及保守区;利用Signal P 4.1 Server对序列进行信号肽预测;应用MEGA 6.0软件对Clustal W2结果进行遗传距离分析并构建分子系统进化树。GH78家族真菌87条序列虽然长度不等,但均包含AHGWSTGPTY、VTLDTGQNVAG和NELSIPTDGAKRD 3个保守区及多个完全保守氨基酸位点;87条序列中29条含有信号肽;属间遗传距离为0.7~48.5,种间遗传距离为0.4~48.5;分子系统进化树并不是依靠菌株来源进行聚类,而是依据是否为胞外酶进行聚类。该研究分析了GH78家族真菌α-L-鼠李糖苷酶的保守区及进化关系,为α-L-鼠李糖苷酶的工程改造奠定了基础。     

红曲霉固态发酵产木聚糖酶培养基的响应面优化

研究了碳源、氮源、无机盐对红曲霉M2固态发酵产木聚糖酶酶活的影响。在单因素实验的基础上,采用响应面实验设计对红曲霉固态发酵产木聚糖酶的培养基进行了优化,并建立了玉米粉、牛肉膏、K2HPO4变化的二次回归方程,探讨了各因子对木聚糖酶酶活的影响。最终确定适宜的培养基条件为:玉米粉添加量为1.90g、牛肉膏添加量为0.55g、K2HPO4添加量为0.10g;在该条件下可得到红曲霉M2产木聚糖酶的最大酶活,预测值为1550.62U/g,对实验结果进行验证,得到木聚糖酶酶活为1545.38U/g。      

米曲霉制备麦糟蛋白肽固态发酵培养基优化

以麦糟为原料,通过米曲霉固态发酵制备麦糟蛋白肽,研究不同培养基条件对肽转化率的影响。通过单因素实验考察碳源添加种类、碳源添加量、磷酸二氢钾添加量和料液比对肽转化率的影响,并采用响应曲面法优化培养基条件,建立肽转化率与各影响因素间的回归方程。结果表明,米曲霉发酵制备麦糟蛋白肽的最优培养基条件为:蔗糖添加量4.21%,磷酸二氢钾添加量0.51%,料液比1:3（g·mL?1）,在该条件下,发酵麦糟肽转化率可达50.73%。结果可为生物转化麦糟生产蛋白肽提供技术参考。     

米曲霉GN-1固态发酵产乳糖酶培养基的优化

在单因素实验的基础上,采用正交实验对米曲霉GN-1产乳糖酶的固态发酵培养基成分进行了优化。结果表明,在固液比为1∶1（w/v）的固态基础培养基中添加1.5%（w/w）的硫酸铵,0.4%（w/w）的硫酸镁,3%（w/w）的蔗糖为发酵培养基,30℃发酵6d,乳糖酶活力高达156.04U/mL,是在基础培养基的条件下发酵酶活力的8.3倍。      

米曲霉GN-1固态发酵产乳糖酶培养基的优化

在单因素实验的基础上,采用正交实验对米曲霉GN-1产乳糖酶的固态发酵培养基成分进行了优化.结果表明,在固液比为1∶1(w/v)的固态基础培养基中添加1.5％(w/w)的硫酸铵,0.4％(w/w)的硫酸镁,3％(w/w)的蔗糖为发酵培养基,30℃发酵6d,乳糖酶活力高达156.04U/mL,是在基础培养基的条件下发酵酶活力的8.3倍.