靶向端粒酶反转录酶基因短发夹RNA载体的构建

背景：端粒酶反转录酶对端粒酶活化起重要作用。 目的：利用pLentilox3.7.U6载体构建靶向大鼠脊髓星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的短发夹RNA干扰分子表达载体并鉴定其作用。 方法：选择端粒酶反转录酶基因上两段序列体外合成RNA干扰分子的正义链和反义链模板序列,经退火成互补双链,与线性化pLentilox3.7.U6载体连接、转化大肠杆菌和序列测定,应用蛋白质印迹和免疫荧光技术,在体外培养的大鼠脊髓星形胶质细胞模型上验证构建的干扰载体抑制端粒酶反转录酶基因表达的效果。 结果与结论：蛋白质印迹和免疫荧光检测结果表明,重组质粒干扰组中星形胶质细胞端粒酶反转录酶均呈低表达。结果证实,实验成功构建了针对大鼠脊髓星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的短发夹RNA质粒表达载体,此载体能有效抑制体外培养的大鼠脊髓星形胶质细胞端粒酶反转录酶的表达。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

兔膜联蛋白A1基因短发夹RNA慢病毒载体构建与RNA干扰效率的鉴定*

背景：膜联蛋白A1参与细胞凋亡的调控。 目的：针对兔膜联蛋白A1基因构建短发夹RNA慢病毒载体,并检测其对成骨细胞的沉默效率。 方法：针对兔膜联蛋白A1基因设计RNA干扰靶序列,合成Oligo DNA,退火形成双链DNA,与BamHI和EcoRI 双酶切后的pGLV/H1/GFP载体连接成pGLV-shANXA1,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。pGLV-shANXA1和pGLV/helper-1、pGLV/helper-2、pGLV/helper-3共转染293FT细胞包装产生慢病毒颗粒LV-shANXA1,并测定其滴度,随后将LV-shANXA1感染兔成骨细胞。 结果与结论：经PCR和测序证实构建片段大小及DNA序列与目标序列一致,shANXA1片段完全正确插入慢病毒载体pGLV/H1/GFP中。包装浓缩慢病毒颗粒LV-shANXA1的滴度为3.8×108 TU/L。经嘌呤霉素筛选后,感染复数为50时,LV-shANXA1对成骨细胞感染效率为80%;感染复数为100时,感染效率为95%。Real-time PCR 和Western blot检测显示,LV-shANXA1-901对膜联蛋白A1基因的沉默效率最高,在感染复数为50时,沉默效率可达71.2%。表明实验成功构建的兔膜联蛋白A1基因短发夹RNA慢病毒载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。     

增殖细胞核抗原短发夹状RNA对人骨肉瘤细胞生长的影响

目的构建增殖细胞核抗原(PCNA)短发夹状RNA表达载体,检测其对人骨肉瘤细胞PCNA表达、细胞增殖及细胞凋亡的影响。方法体外构建PCNAshRNA表达载体pSilence2.1neo-PCNA,转染人骨肉瘤细胞系MG63,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测转染前后PCNAmRNA表达,免疫组织化学(SP)法检测转染前后PCNA蛋白的表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法及克隆形成试验检测细胞增殖活性,3H胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)细胞掺入试验检测细胞DNA合成,流式细胞仪检测细胞周期分布,吖啶橙染色法检测细胞凋亡情况。结果pSilence2.1neo-PCNA载体转染能显著抑制PCNAmRNA及蛋白的表达,转染后mRNA表达抑制率为80.51%、增殖指数值为空白组的25.68%。转染组48h细胞增殖抑制率为61.78%,转染组3H-TdR掺入率明显低于空白组(P<0.01)。细胞周期分析显示,siRNA转染组G0G1期细胞含量显著增加,而S期细胞含量显著减低。转染组凋亡率为16.54%。结论pSilence2.1neo-PCNA可显著抑制MG63细胞PCNA的表达及细胞增殖活性,促进细胞凋亡。     

靶向髓样细胞表达的激发受体1基因短发夹RNA真核质粒表达载体的构建及筛选

目的 构建编码髓样细胞表达的激发受体1(TREM-1)基因短发夹RNA(shRNA)真核质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体.方法 针对TREM-1的靶位点设计含shRNA的靶序列,分别构建pGCsi-TREM-1 shRNA1和pGCsi-TREM-1 shRNA2的质粒表达载体和pGCsi-NegshRNA阴性质粒表达载体,通过酶切及测序进行鉴定.鉴定后以脂质体包裹转染肺泡上皮A549细胞,分为未转染对照组(A组)、转染空质粒载体pGCsi对照组(B组)、转染阴性shRNA质粒表达载体pGCsi-NegshRNA对照组(C组)、转染TREM-1 shRNA1质粒表达载体组(D组)和转染TREM-1shRNA2质粒表达载体组(E组),48 h后观察转染细胞绿色荧光蛋白表达效果.转染24、48、72 h后,以A组为对照采用MTT法测定B、C、D、E组细胞的存活率.转染48 h后,通过荧光定量PCR检测各组TREM-1 mRNA的表达水平并与转染前相比较.结果 经酶切和测序鉴定证实,目的 TREM-1基因shRNA1和shRNA2片段已被克隆到pGCsi载体中.荧光显微镜下,B、C、D、E组A549细胞有明显的绿色荧光蛋白表达.各时间点B、C、D、E组细胞存活率均达90%以上.A、B、C 3组转染前后TREM-1mRNA的表达水平差异无统计学意义,D、E组转染的重组质粒均能有效抑制A549细胞的TREM-1mRNA的表达([(1.945±0.252)×105比(1.010±0.194)×105,(1.933±0.216)×105比(1.202±0.171)×105,均P＜0.05],抑制率分别为48.07%和37.82%.结论 成功构建了靶向TREM-1基因的shRNA质粒表达载体,可有效抑制细胞中TREM-1目的 基因的表达,为后续脓毒症的基因治疗提供了依据.     

端粒酶RNA基因在白细胞中表达的研究

用RT－PCR的方法钓取端粒酶RNA（hTR）基因的cDNA，将hTR基因克隆到逆转录病毒载体（pLNCX）构建哺乳动物细胞表达质粒，然后经脂质体介导转染人体正常的外周血白细胞中表达。结果表明端粒酶RNA基因的表达，不能激活或重建白细胞的端粒酶活性，流式细胞技术分析结果显示，外源hTR基因的表达不能延长白细胞的寿命，反而抑制白细胞的增殖并促进其凋亡，这可能是因为外源hTR基因的表达一定程度上阻碍了细胞内端粒酶RNA同端粒酶催化亚基的结合，同时也阻碍了端粒酶RNA模板区与端粒DNA之间的结合，从而影响端粒酶活性，抑制了细胞的增殖。     

NaCl浓度和茎环内的碱基结构对shRNA退火影响的研究

目的优化DNA寡核苷酸单链退火条件,提高单链DNA寡核苷酸退火效率,加速shRNA表达载体构建速度。方法将茎环内部碱基结构不同DNA寡核苷酸链在不同浓度（50、100、150、200mmol/L）NaCl退火缓冲液中进行退火,通过琼脂糖凝胶电泳观察DNA寡核苷酸链在退火前后电泳速度的变化,利用Gene Tools分析软件对电泳图像进行分析比较退火效率。结果当退火缓冲液中NaCl浓度为200mmol/L时,DNA寡核苷酸单链退火效率明显提高,茎环内部碱基互补的DNA寡核苷酸单链退火效率46.00%±3.33%,茎环内部碱基不互补DNA寡核苷酸单链退火效率97.00%±1.49%。结论NaCl浓度和茎环内的碱基设计是影响shRNA退火主要因素,优化shRNA的退火条件,提高退火效率,可以加速载体构建。目的优化DNA寡核苷酸单链退火条件,提高单链DNA寡核苷酸退火效率,加速shRNA表达载体构建速度。方法将茎环内部碱基结构不同DNA寡核苷酸链在不同浓度（50、100、150、200mmol/L）NaCl退火缓冲液中进行退火,通过琼脂糖凝胶电泳观察DNA寡核苷酸链在退火前后电泳速度的变化,利用GeneTools分析软件对电泳图像进行分析比较退火效率。结果当退火缓冲液中NaCl浓度为200mmol/L时,DNA寡核苷酸单链退火效率明显提高,茎环内部碱基互补的DNA寡核苷酸单链退火效率46.00%±3.33%,茎环内部碱基不互补DNA寡核苷酸单链退火效率97.00%±1.49%。结论NaCl浓度和茎环内的碱基设计是影响shRNA退火主要因素,优化shRNA的退火条件,提高退火效率,可以加速载体构建。     

RNA干扰survivin基因提高淋巴瘤细胞对阿霉素的敏感性

目的：探讨RNA 干扰下调Burkitt淋巴瘤Daudi细胞系凋亡抑制基因survivin的表达对阿霉素敏感性的影响。方法：构建survivin发夹RNA（shRNA）真核表达载体, 脂质体介导转染Daudi细胞。多重RT-PCR 检测 survivin mRNA 表达；Western blotting 检测Survivin蛋白表达；流式细胞仪（FCM）检测干扰前后细胞凋亡率；MTT 法检测干扰前后细胞对化疗药物阿霉素（adriamycin,ADR）敏感性变化。结果：与无功能control-shRNA处理组和PBS处理组比较，转染survivin-shRNA 细胞的survivin mRNA和蛋白表达率显著降低，抑制率分别为62.32% 和61.88% (P<0.05)；FCM结果示转染组细胞凋亡指数（apoptosis index, AI) 显著高于两对照组(P<0.05)； MTT结果显示，转染组细胞的阿霉素半数抑制浓度(IC50)为（0.25±0.43） μmol/L，显著低于无功能control-shRNA处理组（0.87±0.21） μmol/L和PBS处理组(0.91±0.36) μmol/L,P<0.05；相同剂量ADR对转染细胞的生长抑制率明显高于PBS组和control组。结论： 发夹RNA干扰survivin基因可显著提高Daudi细胞凋亡率和对化疗药物阿霉素的敏感性。     

人端粒酶逆转录亚单位特异性siRNA对ES-2细胞生长抑制作用的研究

目的研究人端粒酶逆转录亚单位（hTERT）特异性SiRNA对ES-2细胞体外生长及体内肿瘤形成能力的抑制作用。方法设计并化学合成针对hTERT的8iRNA，用脂质体转染法将其导入ES-2细胞内，通过软琼脂克隆形成实验及肿瘤细胞接种裸鼠的肿瘤形成实验，观察hTERT—siRNA对ES-2细胞体外及体内的生长抑制作用。结果软琼脂克隆形成实验显示，hTERT—siRNA转染的ES-2细胞克隆形成数量明显少于对照组。裸鼠体内实验结果显示，hTERT—siRNA转染组肿瘤生长速度也明显慢于对照组。结论hTERT-siRNA在体内外均可以有效、特异地抑制肿瘤细胞的生长。     

RNA干扰抑制肝星状细胞CTGF表达对细胞外基质分泌的影响

目的：利用pEGFP质粒载体构建介导结缔组织生长因子(CTGF)短发夹RNA表达的质粒，筛选有效的抑制序列后，研究其对HSC-T6中TGF-β₁、CTGF及细胞外基质表达的影响。方法:1.分别设计3对针对CTGF的有小发夹结构的两条DNA序列及1对非特异对照序列，构建重组体成功后转染HSC-T6，24 h后通过RT-PCR及Western blotting分析HSC-T6 CTGFmRNA及蛋白表达水平，筛选出有效抑制CTGF表达的序列。2.将已构建并筛选出有最高抑制效率的pEGFP-CTGFshRNA转染HSC-T6 ，培养24、48 h后用RT-PCR和/或Western blotting检测各组细胞中TGF-β₁、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原基因的表达;放免法分析细胞上清液中Ⅲ型前胶原、IV型胶原、透明质酸和层黏连蛋白的含量。结果:将构建成功的3组pEGFP-CTGFshRNA转染肝星状细胞后，筛选出两组能高效抑制CTGF表达的序列; pEGFP-CTGFshRNA能明显抑制HSC-T6 CTGF、Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA及蛋白的表达，降低上清液中Ⅲ型前胶原、IV型胶原、透明质酸和层黏连蛋白的含量(P<0.01或P<0.05)，而对TGF-β₁的基因表达则无影响。结论:pEGFP-CTGFshRNA能高效抑制肝星状细胞中CTGF及细胞外基质的表达;CTGFshRNA介导的RNA干扰有望对慢性肝病所致肝纤维化具有治疗潜力。     

人类端粒酶催化亚基表达转录活性调控

端粒酶在肿瘤的发生和发展中起重要的作用。端粒酶催化亚基单位也称为人端粒酶逆转录酶 ,是端粒酶激活的限速因素。对端粒酶催化亚基单位的调节主要在转录水平 ,通过对其启动子的调控 ,一些转录因子如 c-myc蛋白、Mad1、SP1、wt P5 3、人类乳头状瘤病毒 16型 E6癌蛋白、WT1及 E2 F等对 HTERT的表达起着调节作用     

骨桥蛋白短发卡样RNA质粒载体的构建与筛选

目的 构建携带骨桥蛋白双链小干扰RNA(OPN-siRNA)的质粒表达载体,筛选出基因沉默效果最明显的短发卡样RNA(shRNA)质粒表达载体.方法 设计并合成2个针对OPN的shRNA寡核苷酸片段(shRNA1,shRNA2),退火形成双链并分别克隆进入载体pGenesil-1.酶切鉴定后,采用LipofectamineTM2000介导的转染方法将重组的shRNA质粒转入大鼠血管平滑肌细胞(VSMC),筛选出稳定转染株.采用RT-PCR及Western免疫印迹检测其对OPN表达的抑制效果.结果 shRNA质粒成功转染入VSMC且效率达50%以上.转染含OPN shRN A1的VSMC的OPN mRNA和蛋白的表达分别为0.16±0.04和0.30±0.09,含OPN shRNA2分别为0.23±0.06和0.44±0.06,两组之间及分别与正常细胞组比较差异均有统计学意义(P<0.01).空载体组和阴性对照组与正常细胞组比较,差异均无统计学意义(P>0.05).结论 成功构建了靶向OPN基因的shRNA质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的shRNA质粒表达载体为shRN A1质粒.     

短发夹状RNA特异性抑制HeLa细胞的Hax-1基因表达

目的:构建靶向Hax-1基因的短发夹状干扰RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体pGenesil-Hax-1,并探讨siRNA靶向抑制Hax-1基因表达的作用。方法:根据shRNA设计的原则,在Hax-1全长序列中选取含19个核苷酸靶序列,设计形成siRNA的DNA模板并克隆到shRNA表达载体pGenesil-1中,获得可靶向抑制Hax-1基因的重组shRNA表达载体。采用LipofectamineTM2000转染试剂将pGenesil-Hax-1导入HeLa细胞中;分别采用RT-PCR以及Western blot从mRNA和蛋白水平上检测干扰效果。结果:半定量PCR及Western blot结果表明,siRNA可使Hax-1mRNA的转录水平得到显著抑制(P<0.01),Hax-1蛋白的表达较对照组减少约70%。结论:靶向Hax-1基因的重组shRNA表达载体pGene-sil-Hax-1介导的siRNA可显著抑制Hax-1基因在人宫颈癌HeLa细胞中的表达。     

Attenuation of SARS coronavirus by a short hairpin RNA expression plasmid targeting RNA-dependent RNA polymerase

Severe acute respiratory syndrome (SARS) is a highly contagious and sometimes a lethal disease, which spread over five continents in 2002-2003. Laboratory analysis showed that the etiologic agent for SARS is a new type of coronavirus. Currently, there is no specific treatment for this disease. RNA interference (RNAi) is a recently discovered antiviral mechanism in plant and animal cells that induces a specific degradation of double-stranded RNA. Here, we provide evidences that RNAi targeting at coronavirus RNA-dependent RNA polymerase (RDRP) using short hairpin RNA (shRNA) expression plasmids can specifically inhibit expression of extraneous coronavirus RDRP in 293 and HeLa cells. Moreover, this construct significantly reduced the plaque formation of SARS coronaviruses in Vero-E6 cells. The data may suggest a new approach for treatment of SARS patients.     

小发卡RNA抗呼吸道合胞病毒效应的研究

目的 为从基因水平抑制呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）的复制，针对RSV的M2-2基因构建小发卡结构状RNA（short hairpin RNA，shRNA）重组质粒，在细胞水平观察shRNA对RSV复制的影响。方法 将成功构建的针对RSV M2-2基因的重组质粒pshRNA8260转染HEp-2细胞，利用光镜观察pshRNA8260对RSV致HEp-2细胞病变效应（cytopathogenic effect，CPE）的影响并计算CPE抑制率，空斑形成实验检测RSV滴度变化。结果 成功构建了针对人RSV M2-2基因mRNA的pshRNA8260重组质粒，研究发现pshRNA8260能明显改善RSV所致的病变效应，降低RSV在细胞内复制的病毒滴度。结论 针对RSV M2-2基因的pshRNA82（g）重组质粒具有明显的特异性抗RSV效应的作用。     

靶向MAG基因shRNA慢病毒载体的构建及其对MAG基因表达的沉默

 目的：设计以MAG基因为靶点的短发夹状RNA（shRNA）,构建重组慢病毒载体并鉴定此RNA干扰体系对MAG基因表达的影响。方法：将3条靶向大鼠MAG基因的shRNA片段插入至慢病毒载体pWPI,与pCDNA3-MAG-FLAG质粒用Lipofectamine　2000共转染293T细胞,Western blotting法鉴定出最有效的shRNA。此重组质粒与pAX2和pMD2G经293T细胞包装后,产生的重组慢病毒感染少突胶质细胞,48 h后Western blotting法检测MAG蛋白的表达情况。结果：经双酶切后测序鉴定,构建了MAG shRNA慢病毒载体pWPI-MAG,鉴定出shRNA-2为最为有效的shRNA。重组慢病毒能明显抑制少突胶质细胞中MAG的表达。结论：慢病毒介导的shRNA干扰技术可特异性阻断MAG的表达,为进一步探讨MAG特异性shRNA治疗神经系统髓鞘损伤奠定了基础。     

shRNA表达载体的改建及鉴定

目的通过改建pSilencer3.1-H1载体快速有效筛选重组shRNA表达载体,并可使线性化载体环化,长期保存。方法制备含有单一限制性内切酶NotⅠ识别序列的双链DNA插入片段,与BamHⅠ和HindⅢ酶切线性化的shRNA表达载体pSilencer3.1-H1连接,构建载体pSilencer3.1-H1/NotⅠ,再用BamHⅠ和HindⅢ双酶切pSilenc-er3.1-H1/NotⅠ,将含靶向目的基因JAK2siRNA表达框的DNA模板与其连接,构建pSilencer3.1-H1/JAK2的shRNA表达载体,提取质粒DNA,用NotⅠ进行单酶切,快速选择阳性克隆,选取不能被NotⅠ切开的质粒进行测序鉴定。随后将pSilencer3.1-H1/JAK2转染胃癌细胞系,用Western blot检测JAK2蛋白的表达。结果通过测序证实pSilencer3.1-H1/NotⅠ和含JAK2siRNA表达框的表达载体成功构建,将其转染胃癌细胞系AGS后,抑制了JAK2蛋白的表达。结论通过对pSilencer3.1-H1表达载体的改建可以快速有效地筛选shRNA表达载体。     

bcl-xL短发夹状RNA重组真核表达质粒对几种细胞增殖的影响

目的：以自行构建的真核表达质粒pmU6为基 础，针对bcl-xL基因构建在细胞内表达短发夹状RNA（shRNA）的质粒载体，并观察它们 对CN E-2Z、MCF-7和ECV-304细胞株增殖的影响。方法：将两条合成的bcl-xL 寡核苷酸链插入pmU6载体中产生pmU6-RNAi重组质粒，把重组质粒转染到细胞中，MTT比色法 检测细胞的生长抑制率。结果：bcl-xL shRNA 对CNE-2Z细胞株的生 长增 殖有明显的抑制作用，而对MCF-7和ECV-304细胞株的生长增殖无明显抑制作用。结 论：提示pmU6-RNAi重组体能在细胞内表达短发夹状RNA，产生了RNA干扰效应并抑 制靶细胞的生长增殖。     

AIF靶向短发夹RNA干扰重组载体对神经母细胞瘤细胞SHSY5Y的沉默作用

目的探讨AIF基因短发夹RNA(shRNA)表达质粒对神经母细胞瘤细胞(SHSY5YAIF)基因的干扰作用。方法根据siRNA设计原则,构建靶向AIF基因的短发夹RNA干扰质粒(pGPU6/GFP/AIF),使用脂质体法转染人神经母细胞瘤细胞,通过RT-PCR和Wester blot印迹检测神经母细胞瘤细胞AIF基因mRNA和蛋白表达水平。结果 pGPU6/GFP/AIF重组质粒经限制性内切酶酶切及测序证明基因插入正确。质粒成功转染SHSY5Y细胞后,该细胞的AIFmRNA和蛋白表达明显下降(P0.05)。结论成功构建靶向AIF基因的shRNA表达载体转染神经母细胞瘤细胞,有效抑制AIFmRNA和蛋白表达,为AIF基因靶向治疗提供前期的实验依据。     

Mcl-1短发夹RNA在Raw264.7细胞内特异性的筛选

目的:将Mcl-1shRNA转染到Raw264.7细胞内,针对shRNA对小鼠Raw264.7巨噬细胞系中Mcl-1表达的影响,筛选出沉默Mcl-1基因效果最明显的特异性shRNA真核表达质粒。方法:将特异性shRNA经脂质体介导转染小鼠巨噬细胞系Raw264.7;半定量RT-PCR和Western blot分别检测转染24、48 h后Mcl-1 mRNA水平变化和Mcl-1蛋白表达情况,分析对应不同位点的三对特异性shRNA片段对Mcl-1的沉默效果。结果:特异性shRNA片段在24、48 h均能有效降低Mcl-1 mRNA和蛋白水平,沉默效率高于正常组、脂质体组和阴性对照组,差异具有统计学意义(P0.05);对应不同位点的三对shRNA真核表达质粒,其中Mcl-1 shRNA3对Mcl-1 mRNA和蛋白的抑制作用均最强。结论:RNA干扰技术可有效下调小鼠Raw264.7巨噬细胞系中Mcl-1 mRNA水平,明显下调Mcl-1蛋白表达。成功筛选出了沉默Mcl-1基因效果最明显的特异性shRNA真核表达质粒。